Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Количественная оценка информации, кодируемых ген выражение уровня во время жизни модуляции под широкий диапазон диетическое ограничение в C. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем основы касаются широкого диапазона диетическое ограничение экспрессии генов и продолжительность жизни. Мы описываем протоколы для широкого диапазона диетическое ограничение и изображений количественные выражения гена под этой парадигмы. Далее мы приводим Вычислительный анализ выявить основные функции обработки информации генетических цепей участвует в пищевой зондирования.

Abstract

Сенсорные системы позволяют животных обнаружить, обрабатывать и отвечать на их окружающей среды. Обилие пищи является экологической кий, что имеет глубокое воздействие на животных физиологии и поведения. Недавно мы показали, что модуляции долголетия в нематоды Caenorhabditis elegans , изобилие пищи является более сложным, чем ранее признанные. Оперативности продолжительность жизни на изменения в уровне питания определяется специфических генов, которые действуют, управляя в нейронной цепи обработки информации. Наши рамки сочетает в себе генетический анализ, количественные изображений высокой пропускной способностью и теория информации. Здесь мы описываем, как эти методы могут использоваться для характеризовать ген, который имеет физиологическое значение для широкого диапазона диетическое ограничение. В частности этот рабочий процесс предназначен для раскрыть, как ген интереса регулирует продолжительность жизни под широкий диапазон диетическое ограничение; затем установить как выражение гена зависит от уровня питания; и наконец, для обеспечения объективной количественной количество информации передал экспрессии генов о изобилие пищи в окружающей среде. Когда несколько генов одновременно рассматриваются в контексте нейронной цепи, этот рабочий процесс может раскрыть кодирования стратегия цепи.

Introduction

Все организмы должны быть в состоянии чувствовать и реагировать на изменения окружающей среды для обеспечения их выживания. В животных нервной системы является основной детектор и датчика информации об окружающей среде и координирует физиологической реакцией на любые изменения, которые могут повлиять на организм выживания1. Обилие пищи является экологической кий, что хорошо учился в нескольких контекстах, что не только регулирует поведения, связанные с продовольственной, например нагула2, но также влияет на долговечность животного. Модуляция жизни путем изменения в изобилии продовольствия явление, известное как диетическое ограничение (DR) и имеет широкие эволюционной сохранения3.

Нематоды Caenorhabditis elegans является мощной модели системы для решения фундаментальных биологических вопросов. Были разработаны множество методов, которые позволяют для манипуляции червь генома, например RNAi и vivo гена, методы редактирования. Небольшой физический размер червь и его оптической прозрачности также поддаются в vivo изображений как транскрипционный анализ и трансляционная флуоресцентные репортеров и полезность высокопроизводительных технологий, таких как микрофлюидика4. Вместе эти инструменты могут быть использованы для изучения как нейронных цепей прямой поведение животных.

C. elegans является bacterivore и опубликовал несколько методов, которые позволяют для точного управления изобилия продовольствия управляя бактериальных концентратов5,6,7,8 . В C. elegans исследовательского сообщества д-р была изучена в двух разных контекстах. Первый можно назвать «классических DR», как он отражает изменения в ответ на снижение продовольственной уровнях в других организмах. В этом контексте уменьшения изобилие пищи от уровня Ад Либитум приводит увеличение продолжительности жизни вплоть до достижения оптимальной, после этого точка долголетия уменьшается с дальнейшее сокращение продовольственной6,7, 9. Второй контекст, под которым DR изучалось в C. elegans является диетическое лишений, в которых увеличивается долговечность червей путем полного удаления любых бактериальных пищевой источник10,11. В Entchev et al. (2015)12, мы показали, что сложность DR, вытекающие из этих двух различных парадигм может рассматриваться одновременно в контексте мы называем «широкий диапазон DR». С помощью протокола, изложенные ниже, мы определили новый класс генов, участвующих в DR что двунаправленно модулировать срок ответ к изобилию пищи и участвуют в нейронных цепей, которые смысле питания12 (рис. 1).

Ответ на изменения в окружающей среде животного интегрирует последовательность биологических процессов, которые связывают сенсорные системы регулирования сложных взаимодействий, передачи экологической информации для физиологии. Хотя часто неизвестны механистический детали таких «потока информации», генетические инструменты может использоваться приобрести проницательность в как организована эта сложные вычисления среди различных биологических компонентов. В нашей недавней работе мы показали, что daf-7 и tph-1 участвуют в передаче экологической информации о изобилие пищи через питание зондирования нейронные цепи, который модулирует продолжительность жизни в C. elegans12 , 13. Применяя математические основы теории информации14, мы смогли подсчитать объем экологической информации, с точки зрения бит, которые представляют изменения выражения гена в daf-7 и УНГ-1 в определенных нейронов на различных уровнях. Исходя из этого мы были тогда в состоянии раскрыть кодирования стратегия этой нейронной цепи и как это контролируется генетически (рис. 2).

В следующий протокол мы наметить шаги, необходимые чтобы понять, каковы последствия генов интерес, выраженный в конкретных нейронах и как они участвуют потока продовольствия информации из окружающей среды жизни. Широком смысле наши рамки делится на два экспериментальных протоколов и вычислительный процесс. Для экспериментальных аспектов, важно, чтобы мутанты генов интерес, который может рассматриваться под широким диапазоном доктор верующих transcriptional Репортеры необходимы также для количественной оценки уровня экспрессии генов на различных уровнях. Чтобы иметь возможность проводить Вычислительный анализ, обсуждались в нашем методе, набор данных должен быть достаточного размера для обеспечения значимого оценки выражения распределений. Даже несмотря на то, что мы предоставляем шаблон исходных кодов для анализов, пользователю необходимо быть знакомым с языком теории информации, который широко используется на протяжении нашей вычислительной инфраструктуры. Исходные коды записываются в R и C++. Таким образом определенный уровень знания программирования требуется также применять их в осмысленном виде.

Protocol

1. Подготовка бактериальных культур и пластины для общего червь культуры

  1. подготовить 100 мл lysogeny бульон (LB) СМИ в 250 мл стеклянной бутылке и стерилизация автоклавированием.
  2. Прививок бутылку с одной колонии штамма кишечной палочки ОР50 и инкубировать при 37 ° C ночь и затем сохранить культуру на 4 ° C до тех пор, пока требуется.
  3. Подготовить 5 Л стерильных нематоды роста средних (НГМ) агар 15 и Алиготе 12 мл томов в пластиковых чашек Петри стерильные 6 см.
  4. Позволяют агар на ночь и затем хранить при 4 ° C до тех пор, пока требуется.
  5. Семя NGM пластины по крайней мере 3 дней до использования с 225 мкл охлажденных ОР50 культуры. Хранить пластины при 20 ° C до тех пор, пока требуется.

2. Подготовка бактериальных культур и разведения для экспериментов

  1. подготовить два лота по 500 мл LB СМИ в колбу Эрленмейера 2 Л и стерилизация автоклавированием.
  2. Прививок каждый флакон с одной колонии ОР50 и расти при 37 ° C, тряски на 200 rpm для около 14 ч.
  3. Дополнение культур с антибиотиком стрептомицина до конечной концентрации 50 мкг/мл. За 30 минут при 37 ° C затем место колбы на льду на 15 мин по-прежнему пожимая
  4. Передачи 450 мл каждой культуры в отдельный стерильный центрифуги бутылки (идеально 500 мл бутылки потенциала во избежание расщепления культур). Сохранить остатки культуры на льду, как он будет использоваться для определения концентрации бактерий.
  5. Спин вниз бутылки на 4500 x g в наборе охлажденных центрифуги на 4 ° C на 25 мин удалить супернатант и хранить бутылки на ДВС.
  6. Разбавляют 100 мкл остатки культуры от каждого колбу в 900 мкл стерильных LB. использования 1 мл стерильного LB нулю спектрофотометра, а затем определить ОД 600 десятикратного разбавления каждой культуры. Если например, ОД 600 десятикратного разбавления ночь культуры 0.28 то культура имела фактический ОД 600 2.8.
    7. Использование рабочих Стоковый раствор бактерий 1.12 x 10
  7. 10 ОР50 клеток/мл, которая приравнивает к ОД 600 56. Таким образом используя пример ОД 600 2.8 сверху, Ресуспензируйте гранулы от культуры 450 мл в 20 го исходного тома, который в данном случае является 22.50 мл. Ресуспензируйте бактерий с стерильный раствор S базальной дополнена стрептомицина до 50 мкг/мл (SB + стрептококк).
  8. Ресуспензируйте гранулы в соответствующий объем стерильных SB + стрептококк.
  9. Делать все последующие концентрации, используемых в экспериментах с серийных разведений работы Фонда в SB + стрептококк помощью разбавления факторов, перечисленных в таблице 1.

3. Настройка до жизни экспериментов

Примечание: продолжительность жизни анализы выполняются на культуре ткани 6 см лечение заполнены с 12 мл NGM агар дополнена стрептомицина и carbenicillin (СНБ), оба в конечной концентрации 50 мкг/мл. Эти культуры ткани пластины хорошо подходит для жизни анализов на нет или очень низкой концентрации бактерий, как черви, значительно меньше подвержены прилипания к стене плиты и осушающий. Использование двух различных антибиотиков штамм ОР50 предотвращает развитие лекарственной устойчивости, который имеет решающее значение в борьбе бактериальных концентратов на плите. Кроме того инактивации бактерий с помощью антибиотиков, мы свести к минимуму воздействие на червя жизни благодаря патогенной инфекции 16. Это позволяет нам рассматривать только пищевых компонентов бактериальных концентратов в этих экспериментах. Многие исследования C. elegans старения дополнить NGM пластины с химической фтор-2 ′-дезоксиуридина (FUdR) для визуализации взрослых стерильные. Однако использование FUdR может быть проблематичным, как его использование может привести к несколько смешанным вопросам долголетия анализов, 17 , 18 ,, 19 , 20 , 21. Entchev et al. (2015) 12 обходят этот вопрос под воздействием L4 личинок RNAi яйцо-5 22 , 23, который препятствует Переход яйцеклеток и эмбрионов, блокируя формирования яичной скорлупы из оплодотворенной C. elegans яйцеклеток, что приводит к их смерти.

  1. Культуры C. elegans штаммов, которые будут assayed на посеян NGM пластины на 20 ° C. позволяют пластины голодать чтобы обеспечить, что все животные выращиваются в единообразной моде и потенциально счет для любых следующих эффектов условий развития.
  2. Передачи от голода L1 личинки новые посеян NGM пластины вырезать небольшой кусок агар (5 x 5 мм) с голоду пластины с использованием стерильным скальпель и поместив его вниз на новой пластинкой, процесс, именуемый ' фрагментация ' на C. elegans исследований comm единство 15. Растут червей, пока они достигают стадии L4. Пяти L4 личинок за штамм затем переданы отдельным посеян NGM пластины и хранится при температуре 20 ° C. Эти животные представляют поколение P0.
  3. Использование L4 потомства P0 поколения, чтобы настроить поколения F1. Отдельно место F1 L4 личинки штамма дикого типа N2 на 30 посеян NGM пластин.
    Примечание: Для мутантных штаммов, количество пластин требуется зависит от темпов их роста. К примеру daf-7(ok3125) животных проходят переходные срок ареста при 20 ° C. Таким образом, этот штамм производит меньше L4 личинок чем тарелку N2 дикого типа червей.
  4. Для компенсации этой разницы, набор пластин daf-7(ok3125) вверх на день раньше, чем N2 плиты и на большее число, хорошее соотношение рабочих составляет 3:1.
  5. Передачи синхронизированы L4-этап потомства F1 родителей NGM пластины с 1 мм ИПТГ и 50 мкг/мл carbenicillin (RNAi пластины), которые были посеяны с 225 мкл HT115 бактерий, выражая dsRNA ориентации яйцо-5 генов и хранится в 20 ° C в течение 24 ч. По крайней мере 360 червей в штамм, хранится на плотность 15 животных на пластину, необходимы за эксперимент.
  6. После лечения RNAi яйцо-5, черви передать НСК пластины семенами с 225 мкл обработанных стрептомицином ОР50 в концентрации 2 х 10 9 клеток/мл (Таблица 1) на дополнительные 24 часа при 20 ° C. Чтобы избежать повреждения червей в течение этого и все последующие переводы, нежно зачерпнуть животных из под червя, с помощью очень тонкой слегка изогнутые червь выбрать. Поплавок, выбрать животных от червя, погружая его в 10 мкл капли SB + стрептококк, расположенных на поверхности новой пластинки.
  7. Следующий день, распространять черви НСК пластины, представляющих каждую из l уровни продовольственнойIsted в таблице 1, а также набор НСК пластин, которые содержат не бактерии. Семена всех НСК пластины с 225 мкл соответствующей концентрации бактерий и семян бактерии, свободной НСК пластины с 225 мкл SB + стрептококк. Поддерживать червей на плотность 15 животных каждой пластины, что приводит к по крайней мере четыре пластины на состояние питания за штамм. Сдвиг пластины до желаемой температуры экспериментальной.
  8. Передачи черви свежие НСК пластины семенами с концентрацией соответствующих продуктов питания в соответствии с графиком, изложенным в таблице 2.
    9. Выбрать
  9. Оценка животных для движения, мягко подталкивая с проволокой. Непринятие мер оценивается как смерть. Оценка животных для смерти на каждой передаче точки и затем ежедневно после последней точки передачи.

4. Настройка вверх Imaging эксперименты

Примечание: шаги, описанные в этом разделе, являются достаточными для создания достаточно червей за напряжение для визуализации одно условие экспериментальной пищи при данной температуре. Этот протокол можно масштабировать по размеру количество условий, которые будут отражаться в любой день. Однако следует позаботиться о том, в экспериментальный дизайн, чтобы обеспечить разумные сроки и что животных через различные штаммы не имеют больше, чем 12 часов в день съемки разница в возрасте. Настоятельно рекомендуется, что transcriptional Репортеры изображаемого являются одной копии мутация, как это будет больше напоминать родной регулирование гена. Протокол изложенные ниже и кратко изложены в таблице 3, также обеспечивает рациональный метод для получения большой синхронной возраст соответствует населению штаммов, которые могут быть использованы для других экспериментальных рабочих процессов.

  1. Культуры животных в imaging эксперименты на 10 см лечение культуры ткани пластины для большей плотностью червей (∼ 100 животных на пластину) чем срок assays.
  2. Заполнить 10 см пластины с 30 мл с пятью 225 мкл аликвоты охлажденных ОР50 культуры в формировании кросс как плиты агара НГМ и семенной.

5. Начальная культуры репортер штаммов

  1. культуры C. elegans штаммов, которые будут assayed на посеян NGM пластины на 20 ° C. позволяют пластины голодать чтобы обеспечить, что все животные выращиваются в единообразной моде и потенциально счет для любого эффекты следующих условий развития.
  2. Кусок голодали L1 личинки семенами NGM пластины и расти, пока они достигают стадии L4. Передавать три L4 личинок за штамм двумя семенами NGM пластины при 20 ° C. Эти животные представляют поколение P0.
  3. Использовать L4 потомства P0 поколения для настройки поколения F1. Место F1 L4 личинки штамма репортер дикого типа на 4 семенами NGM пластины. Для мутантных штаммов количество пластин требуется зависит от темпов их роста. Используя предыдущий пример daf-7(ok3125), репортер штаммов в этом фоне требуют три раза номерные и нужно настроить два дня до штаммов дикого типа репортер, чтобы учитывать различия в темпы роста.

6. Яйцо сбора и синхронизации репортер штаммов

Примечание: некоторые гены интереса в C. elegans старения исследовательского сообщества привести к росту и яйцекладка дефекты когда мутировал, которые делает его более трудным для генерировать большой синхронной популяций животных различных генотипов. Например мутации daf-7(ok3125) вызывает серьезный дефект яйцекладка по сравнению с дикого типа N2 штамма. Таким образом чтобы получить достаточное количество синхронных L4 личинок различных штаммов для количественных тепловизионная экспериментов требует более надежной методологии чем вручную выбирать червей. По этой причине transcriptional репортер штаммы были подвергнуты гипохлорита натрия (NaClO) / лечение раствора гидроокиси натрия (NaOH) беременных взрослых разорвать открыть животных и освободить их яйца, процесс, обычно именуемый ' отбеливания ', C. elegans исследовательские сообщества 15.

  1. Счета для различий в темпах роста ставок между штаммов и рассчитать когда пластины каждого штамма должен быть собрано и отбеленная. Пример когда отбеливают штаммов дикого типа и daf-7(ok3125) репортер см. в таблице 3.
  2. Серийно моют червей Данный штамм от плит, на соответствующий день, используя 15 мл SB и собирать в стерильных 15 мл. Разрешить животных естественно отложениях и затем корректировать объем жидкости до 7 мл.
  3. Добавить 2 мл 5% NaClO и 1 мл 5 M NaOH в пробирку, содержащую беременных взрослых. Встряхните смесь при комнатной температуре в течение не более 3 мин. NaClO будет убивать бактерии и червей, в то время как NaOH вызывает черви развалится, выпуская оплодотворенные яйца, которые они содержат в жидкость. Хитин яичной вокруг эмбрионов защищает их от последствий лечения, пока остается относительно короткое время экспозиции. После инкубации 3-мин, вихревой трубе для ~ 30 s для облегчения дальнейшего распада червь туш.
  4. После 3-мин инкубации спин вниз смеси на 1000 x g за 1 мин до Пелле яйца. Аспирационная большинство супернатанта, с помощью стерильной стеклянной пипетки, подключенных к Склянка вакуума, оставляя ~0.5 мл в каждую пробирку, чтобы не нарушить яйца.
  5. Ресуспензируйте лепешка с 9,5 мл SB и затем повторите шаг центрифугирования и ресуспендирования шаги еще два раза, что яйца были вымыты с SB в общей сложности три раза.
  6. После того, как окончательный промыть, Пелле яйца путем центрифугирования и затем отменить все но 0,5 мл супернатант. Ресуспензируйте яйца в оставшиеся 0,5 мл SB и затем аликвота 100 мкл на три пластины NGM 10 см с семенами. Равномерно 100 мкл через все пять бактериальных газоны на каждой табличке. Для штаммов дикого типа, яйца не должны быть зачислены на плотностью больше чем 200 на пластину.
    1. Держать пластины при 20 ° C в течение 48 часов и получить весьма однородное население L4 личинок. Для штаммов с задержкой роста фенотипов желательно депозит как много яиц, как доступный и увеличить время инкубации. Например, держать daf-7(ok3125)-содержащих штаммов репортер при 20 ° C ~ 64 h разрешить яйца люк и достигают стадии L4.

7. Лечение репортер штаммов с яйцо-5 RNAi

  1. серийно моют червей от три пластины 15 мл SB и сбора жидкости в стерильных 15 мл. Разрешить L4 личинки естественно отложениях, а затем удалить все, кроме ~0.5 мл жидкости. В диких type репортер штаммов, этот шаг удаляет любые личинки моложе L4. В мутанта стола, этот шаг помогает удаления любого арестованного личинки например dauers в случае daf-7(ok3125).
  2. Ресуспензируйте червей с 9 мл SB. Опять же контролировать скорость оседания личинок L4 и затем аспирационная все но ~0.5 мл надосадке после того, как большая часть L4 личинки гранулированных. Повторите этот процесс еще раз. Затем аспирационная все но ~0.5 мл жидкости, после того как большинство L4 личинки поселились.
  3. Добавить 10 мкл стерильных S базальной дополнена 0,1% плюрониевого F-127 (SB + Plu) в жидкость, содержащую L4 личинки. Это действует как сурфактанта и предотвращает прилипание к внутренней поверхности пластиковые наконечники личинки.
    1. Нежно ресуспензируйте личинки, с помощью кончика пипетки низкой удержания Р200 и затем аликвота 150 мкл на три плиты RNAi 10 см, которые являются семенами с 5 x 225 мкл яйцо-5 RNAi бактерий. Обеспечения черви одинаково распределены по всех пяти бактериальных газоны.
  4. После того, как жидкость поглощается в агар, удалить любой не L4 личинок из пластин, которые не были устранены в установленном стирки вручную, выбирая их. Затем сохранить пластины при 20 ° C для 24 h.

8. Начало широкого диапазона DR

Примечание: после 24 ч яйцо-5 RNAi лечения, L4 личинки, которые первоначально были депонированы на тарелках станет 1 - день старых взрослых.

  1. Обрывать молодых личинок, которые избеубежали предварительного ручного удаления шаг на данном этапе, оставляя только 1 - дневных взрослых на тарелках.
  2. Для каждого штамма, вымыть 1 день старых взрослых из трех пластин с 15 мл стерильного SB + стрептококк в 15 мл трубку. Позволяют черви естественно отложений, а затем удалить все, кроме 0,5 мл супернатант. Ресуспензируйте червей с 9,5 мл SB + стрептококк и повторите шаги, седиментации и мыть.
  3. После того, как окончательный промыть, позволяют черви отложений и затем удалить все, кроме 0,5 мл супернатант. Добавить 10 мкл SB + Plu и нежно ресуспензируйте личинки, с помощью кончика пипетки Р200 и затем аликвота 100 мкл на НСК пластину, семенами с 5 x 225 мкл бактерий на 9 клеток/мл концентрация 2 x 10.
    1. Распределить 100 мкл равномерно во всех пяти бактериальных газонов. Под микроскопом оценить количество животных на пластину: цель заключается между 100-150 червей на пластину.
    2. Определить объем жидкости, необходимые для достижения плотности червь в пределах этого диапазона, а затем Алиготе на два дополнительных пластин. Регулировать количество червей на первой пластине также попадают в этот диапазон, а затем сохранить пластины при 20 ° C для 24 h.
  4. На следующий день, собирать 2 день старых взрослых и распространять новые пластины НСК семенами с желаемой концентрации экспериментальных продуктов питания (Таблица 1), повторно использовать методы, описанные в шагах 2 и 3. Как только жидкость впитывается в агар, сдвиг пластины для экспериментальных температуру за 24 ч.
  5. Следующий день, собрать 3 день старых взрослых и распространять свежие НСК пластины семенами с такой же концентрации экспериментальных продуктов питания, повторно использовать методы, описанные в шагах 8.3 и 8.4. Как только жидкость впитывается в агар, вернуть экспериментальной температуры за 48 ч. пластины
  6. Собирать 5 день старых взрослых и распространять свежие НСК пластины семенами с такой же концентрации экспериментальных продуктов питания, повторно использовать методы, описанные в шагах 8.3 и 8.4. После того, как жидкость впитывается в агар, вернуть экспериментальной температуры для 24 h. пластины

9. Microfluidic Imaging репортер штаммов

  1. на 6 день совершеннолетия, изображения животных, с использованием пользовательских microfluidic платформа 24 , 25. Физически обрывать животных из трех пластин и приостановить в 5 мл криогенных тубы 4,5 мл SB + стрептококк.
    1. Раз червей отложений, аспирационная все но ~0.5 мл супернатант и Ресуспензируйте животных в 4 мл SB + стрептококк. Это мыть удаляет избыток бактерий, которые в противном случае могут помешать с изображениями. Черви вводятся в пользовательской microfluidic устройство через управляемый поток 24 , 25 давления. Внутри устройства, направляется в и ловушке внутри изображений канала, условным давлением управляемые клапаны на чипе 26 под контролем заказного программного обеспечения отдельных червей.
  2. После того, как червь удерживается головой в визуализации канал, собирать флуоресцентный z стек, с 50 секций в 2 шагах мкм, с помощью стандартного эпифлуоресцентного микроскопа с 40 X нефти цель (1.3 NA) и камеры. Соберите красного и зеленого флуоресцентного изображения для каждого transcriptional репортеров, одновременно используя разделитель выбросов и сохраняются для анализа. Получение изображения автоматизирован с помощью программного обеспечения на заказ.
  3. Процесс изображения автоматически с помощью пользовательских MATLAB сценарии 27 (имеется на https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-стеки загружается в MATLAB и проанализированы для определить нейрон пар и их расположения в пределах плоскости изображения. Максимальная прогнозы затем вычисляются и Бинаризация алгоритм используется для обнаружения отдельных люминесцентные клеток. Идентификации клетки затем вычисляется на основе относительного расстояния и места в пределах червь ' руководитель ф.
  4. Для количественного определения репортер флуоресценции, экстракт трехмерный объем вокруг каждого сотовой местоположения из z стека. Интегрировать интенсивность над согласованное количество ярких пикселей, которые полностью инкапсулировать всю ячейку во всех случаях.
  5. Для устранения помех от экспериментальных условие конкретным или штамма изменения в кишечнике auto флуоресценции каждого животного, рассчитать интенсивность фона для ячейки пар ближайшего кишечник (ADF и АСИ) через оценки режима распределение интенсивности в томе вокруг нейрона. Вычитание этого значения интенсивности фон из комплексной флуоресценции для получения конечного результата.

10. Ассамблея данных

Примечание: интенсивностью флюоресценции всех нейронов, анализируемой программного обеспечения обработки изображений объединяются в файл данных отфильтрованного выражение (ФРС), который используется для оценки распределения профили гена выражение (шаблон R и C++ скрипты доступны на https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Вручную проверить каждый обработки изображения для подтверждения правильной идентификации для всех ячеек. Изображения с идентификации ошибочных клетки должны записываться в файл исключения. В Диана et al. (2017) 13 файл состоит из двоичной таблицы с ' 0 ' для правильной и ' 1 ' для идентификации неправильные клетки. Количество строк в таблице равен числу червей образы со столбцом для каждой ячейки образы (т.е. АСИ, АДФ и NSM).
  2. Создать файл ФРС:
    1. запустить bash скрипт " gen_data + время " для создания клеток конкретных файлов, сочетая выражение значения, полученные от каждого червь imaged фильтруются, с помощью исключения файла. Для каждой папки, порожденных программного обеспечения для обработки изображений, Баш скрипт читает файл аннотации < folderprefix > _EXP.txt для извлечения экспериментальные условия и исключения файла < folderprefix > _X.csv только правильно выбрать выявленных нейронов. Выражение значения считываются из файлов < folderprefix > _data_ < нейрона > .csv.
    2. Объединить все файлы в " FED_split.dat " и сортировать код партии эксперимент, червь этикетки и ячеек самобытности.
    3. Запуск " рода " (программы C++, использование:. / сортировать FED_split.dat FED_merged.dat) для выбора записей с нуля флуоресценции для каждой ячейки и объединить их в единый строк в FED_merged.dat.

11. Оценка информации кодируются

Примечание: Следующая процедура описывается количественную оценку информации о конкретных экологических условий, кодируемых набор выражений, ген. В Диана и др. (2017) было рассмотрено 13, информация, закодированная о изобилие пищи в окружающей среде, однако, сам метод применим к любой дискретной количество окружающей среды государств. Важным элементом для количественного определения информации теоретик переменных, таких как entropies информации или избыточность является распределение вероятностей совместных нейронных ответов под набор экологических раздражителей рассмотрены. Для выполнения такой оценки, важно иметь достаточные выборки ответа по всему населению червей. Гаусса распределение может быть оценена из относительно небольших образцов; Однако важно иметь представление о ожидаемых форма распределения выражение для количественного определения соответствующей выборки для оценки надежного плотности. Из-за неизбежной изменчивостью через различные испытания, это необходимо проверить, что значения Центральной распределений, полученных из различных повторов же эксперимента не сдвигаются систематически или что любой из статистической функции выражение распределения через испытания существенно не изменяется. В случае, если суд для судебного разбирательства изменчивость совместим с изменчивости в пределах каждого судебного разбирательства, важно сбалансировать количество судебных процессов против количество червей в рамках судебных процессов в среднем эти биологические/экологические факторы, которые влияют на судебное разбирательство и судебное разбирательство изменчивость. Undersampling эти факторы могли бы сильно смещения теоретико информации анализ.

  1. Сценарий как R " code3D.R " предоставляет шаблон для создания трехмерных плотности, основанный на файле " FED_merged.dat ", изменить этот шаблон в соответствии формат заголовка ФРС. Список " HeaderNames " представляет имена каждого поля в файле ФРС при " RONames " список индикацию. Сценарий использует пакет R ' ks ' 28 , 29 оценить многомерный распределений в пределах grid гиперкубической с GS бункеров в каждом измерении, разделение диапазона между минимальным и максимальным значения в наборе данных для каждой индикации. При внутренней переменной " группы " имеет значение 0, все данные используются для оценки плотности. Когда " группы " лейбл составляет от 1 до 5 набор данных состоит из 5 непересекающиеся множества, и выражение плотности оцениваются от 80% в результате исключения одного из пяти наборов данных. Эта функция используется в дальнейшем для оценки неопределенностей.
    Примечание: Использование code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < еда > < ОО > < outfolder > < лейбл > < группы > < ГРП > где GT представляет генотипа, еда является состояние окружающей среды, outfolder существующие папку, где будет храниться распределений, метка представляет собой имя файла префикс и ГРП является частью набора данных, используемого.
  2. Для каждого состояния окружающей среды создают многомерного распределения с различными сетки размерами GS (например 20,30,40 контейнеров). Для снижения вычислительной нагрузки, меньшие значения GS предпочтительны при тонкой резолюций не существенно изменить оценки информации. Экспрессии генов распределение записываются в папку < outfolder > указывается при запуске code3D.R как один столбец текстовых файлов с имя файла структуры < метка > _ < GT > _ < еда > _GS < ОО > _group < Группа >. dat.
    Примечание: предыдущие шаги дают оценку условных вероятностей Equation 1 где g обозначает вектор всех read-outs и f состояния окружающей среды. Однако чтобы вычислить взаимного обмена информацией между экспрессии генов и окружающей среды 30 , 31.
    Equation 2
    нам нужно распределение входного Equation 3 который также определяет (вход-) в среднем ген выражение < IMG alt = «Уравнение 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg» / >. Когда входной распределение не доступен напрямую, значимого количества характеризовать особенности кодирования является пропускной способности канала, которые могут быть получены путем максимального обмена информацией во всех возможных входных распределений.
  3. С использованием выражения гена распределения, применяют Аримото-Blahut 32 алгоритм оценки пропускной способности канала системы и распределение экологических ввода, которая максимизирует информации. Пример реализации алгоритма можно найти в программе C++ " Ccap3D.cpp " для трехмерной экспрессии генов-код анализируется в Диана et al. (2017) 13. Пример: Если дистрибутивы от генотипа GT123 получаются из 80% данных (Группа 3) с размер сетки равно 30 и хранится в папке ". /pdf/ " с помощью префикса метки = " PDF ". Команда вычислить информацию, закодированную в заднем GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Примечание: оценки информация, закодированная в системе зависит от нескольких источников неопределенности, включая выбор оценки плотности алгоритм и образца размер смещения. Следует повторить шаги 11.1-11.2 для оценки размера систематической предвзятости, представленного каждым алгоритмом с использованием методов оценки различных плотность.
  4. Для оценки неопределенности из-за размера выборки, перерасчет информации от шагов 11.1-11.2 с группы от 1 до 5. Изменчивость через эти пять независимых выборок 80% данных будет отражать влияние размера выборки по оценке информации.
  5. Вычислить информацию, используя шаги 11.1-11.2 над увеличивая долю данных (как в шаге 5) для коррекции смещения размер выборки (Jack-knife метод) 33.

12. Расчет избыточности, шума и корреляции сигнала

  1. использования оптимальных входных распределений полученные из оценки максимального информацию для расчета взаимной информации Equation 5 между ввода и ген выражение ответ каждого нейрона N. Исходный файл C++ " GetMI1D.c " представляет собой образец программы для получения маргинальных взаимной информации от совместного распределения вероятностей.
  2. Расчет избыточности, взяв на сумму взаимной информации для каждого нейрона, полученные выше и затем вычесть пропускной способности канала.
  3. Расчет " shuffle " информации термин Equation 6 13 , 34. Исходный файл шаблона C++ можно найти в " GetShuffle.c ".
  4. Использования " shuffle " термин для вычисления корреляции сигнала и шума. Для Синьяl корреляции, у нас есть Equation 7 и для корреляции шум, у нас есть Equation 8.
  5. Неопределенности на избыточность, получить шум и корреляции для общей информации (шаг 11.3 из предыдущего раздела) от нескольких выборок 80% данных и принимая стандартное отклонение сигнала.

Representative Results

Проводя эксперименты продолжительность жизни на мутантов генов интерес наряду с дикого типа N2 штамм, можно установить ли эти гены играют роль в продовольственной ответ на широкий диапазон DR. Ответ дикого типа должны быть сопоставимыми с показано на рисунке 1A. Любое модуляции этой реакции мутантов, отражение неравномерное влияние различных условий питания, указывает, что эти гены влияют на способность червь правильно реагировать на изменения в изобилии продовольствия, в которых точка дальнейшего расследования выражение ответы этих генов на широкий диапазон DR является оправданным. Если, однако, ответ долголетия мутанты не существенно отличается от дикого типа гены имеют никакой роли в преобразователя последствий широкого диапазона DR, по крайней мере на уровне средней продолжительности жизни. Если мутации вызывают равномерное смещение весь срок ответа гены имеют эффект пищи независимые на долговечность. Это не исключает возможность того, что выражение генов интерес еда отзывчивым, в этом случае, информация, которую эти гены не передается на продолжительность жизни.

Следующий этап протокола необходимо определить, как изменить уровни выражения под широкий диапазон DR для гены интереса. Рисунок 1Bпроиллюстрируем это через уровни выражения transcriptional корреспондент daf-7, который показывает в ответ на изменения в уровне питания в ASI сенсорных нейронов. В daf-7(-) мутанта изменяется выражение ответ transcriptional репортер. Если гены интереса действительно еда реагировать на уровне жизни один можно ожидать, что их выражение изменится с пищей. Соответственно транскрипционный анализ репортер черепашки фоне должны иметь профиль измененное выражение в ответ на широкий диапазон DR. Однако это также возможно, что transcriptional Репортер ген интереса в фоне дикого типа не показывать любой пищи отзывчивым изменения в выражении. В этой ситуации это может означать post-transcriptional регулирования эффект, который выходит за рамки настоящего Протокола.

В Диана et al. (2017)13, мы извлекли значения выражения для daf-7 в ASI и tph-1 в ADF и NSM. В рисунке 2Aпроиллюстрируем оценки распределения выражение в АСИ и ADF для уровня заданного пищи. Имея несколько показаний от одного червя изображения позволяет нам анализировать не только количество информации кодируются независимо каждый нейрон, но и комбинаторные информацию о целом нейронные цепи (рис. 2Б-2). Сочетание этих двух мер теоретико информация позволяет характеризовать системы в плане кодирования стратегия нейроны передают информацию о еде. Количество избыточности в контуре можно получить сумму взаимной информации для каждого нейрона и вычитания совместной взаимной полученная (пропускной способности канала), рассматривая комбинаторной индикацию цепи. Положительное значение такой разницы обозначает избыточных символов кодировки стратегии, потому что Накопительная информация среди части больше, чем фактическая информация кодируется по всей цепи. И наоборот отрицательное значение отражает синергических стратегии, потому что истинный информация, закодированная больше чем сумма его компонентов (Рисунок 2B). Информация и резервирование можно сравнить через различных генотипов для изучения возможной роли высшего порядка регуляции генов, например в Диана et al. (2017) 13 эффект daf-7 мутации переключает кодирования стратегия от избыточных синергетический (рис. 2C-2D).

Figure 1
Рисунок 1 : Ответ выражения жизни и гена под широкий диапазон доктора (A) средняя продолжительность жизни дикого типа N2 штамм (черная линия) отображает сложный ответ на широкий диапазон DR. Масштабы этого ответа гасится в null мутант гена daf-7 (красная линия). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения, Объединенные данные из Entchev et al. (2015) 12. (B) означает выражение уровня transcriptional Репортер ген daf-7 в дикого типа фона (черная линия) также отображать сложные немонотонных ответ на широкий диапазон DR. В daf-7(-) генетический фон выражение этот транскрипционный анализ репортер очень смягчены и показывает мало ответ на изменения в уровне питания. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения, данные из одного суда в Entchev et al. (2015) 12. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Вычислительной методологии. (A) Иллюстрация оценки двумерных плотности tph-1 выражения экспрессии АДФ и daf-7 в ASI, полученные от «ks» R пакета с помощью сетки измерения 30 x 30. Визуализация (B) информация, закодированная выражением совместного tph-1 и daf-7 (всего) и индивидуально (сумма частей) для ADF, ASI и NSM нейронов. Резервированием и синергических символы кодировки представлены разница между высотой накоплением на право и информация, закодированная в полной цепи. (C) сравнение между продовольственной информации, кодируемых животных дикого типа и мутантов daf-7(-) . (D) сокращение взаимной информации, наблюдается в мутантов сопровождается переключатель к синергетический кодирования. Группы B-D приспособлены от Диана и др. (2017) 13. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Бактериальные Концентрация (клеток/мл) Оптическая плотность (600nm) Коэффициент разрежения (от предыдущих)
1.12E + 10 56.000 0.00
2.00E + 09 10.000 5.60
6.32E + 08 3,160 3.16
6.32E + 07 0.316 10.00
2.00E + 07 0.100 3.16
0 (S базальную) 0,000 NA

Таблица 1: уровни продовольственной и разбавления факторы используются в широком диапазоне доктор Бактерииl концентрации (клеток/мл) используется в протоколе DR широкий диапазон, наряду с их соответствующих измерений600 ОД и коэффициент разрежения, необходимые для достижения каждой концентрации от предыдущего.

Экспериментальная температуры продолжительность жизни
День 12,5 ° C 15° C 17.5° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27.5° C
-12 Кусок всех штаммов свежие NGM пластины и поддерживать при 20° C
-11
-10 Настройка P0 поколения daf-7(-) штаммов и поддерживать при 20° C (1 L4 каждой пластины, 5 плит)
-9 Настройка P0 поколения штаммов дикого типа и поддерживать при 20° C (1 L4 каждой пластины, 5 плит)
-8
-7
-6
-5 Настройка поколения F1 daf-7(-) штаммов и поддерживать при 20° C (1 L4 каждой пластины, 90 пластин)
-4 Настройка поколения F1 штаммов дикого типа и поддерживать при 20° C (1 L4 каждой пластины, 30 пластин)
-3
-2
-1
0 Выберите F2 L4 личинки > яйцо-5 RNAi плиты и поддерживать при 20° C (15 L4 каждой пластины, 24 пластин)
1 Шаг 1 - дневных взрослых НСК пластины семенами с 2.0E + 9 уровень питания клеток/мл и поддерживать при 20 ° C
2 Шаг 2 - дневных взрослых к НСК пластины семенами с условиями экспериментальной продовольствия и экспериментальной температуры
3 Передача Передача Передача Передача Передача Передача Передача
4
5 Передача Передача Передача Передача Передача Передача Передача
6
7 Передача Передача Передача Передача Передача Передача Передача
8
9 Передача Передача Передача Передача Передача Передача Передача
10
11 Передача Передача Передача Передача Передача Передача
12
13
14 Передача Передача Передача Передача
15
16
17
18 Передача Передача
19
20
21
22 Передача

Таблица 2: график для продолжительности жизни, проведенного при разных температурах. Схематический план шагов, необходимых для создания широкий диапазон DR жизни экспериментов при разных температурах с использованием daf-7(-) и дикого штаммов в качестве примеров. Количество передач на свежие пластины каждого уровня экспериментальных продовольствия уменьшается с ростом температуры. Это должна учитывать тот факт, что более стремительно устаревает животных при более высоких температурах и поэтому более склонны к физический ущерб за перевод.

Дней IMA
Джинг трубопровода -14 Кусок репортер штаммов daf(-) фоне. Сохранять при 20 ° C. -13 Кусок репортер штаммов дикого типа фоне. Сохранять при 20 ° C. -12 Настройка P0 поколения daf-7(-) репортер штаммов. Используйте 3 L4 личинок на 10 см NGM пластину. Использовать 2 пластины и поддерживать при 20 ° C. -11 -10 Настройка P0 поколения репортер штаммов дикого типа. Используйте 3 L4 личинок на 10 см NGM пластину. Использовать 2 пластины и поддерживать при 20 ° C. -9 -8 Настройка поколения F1 daf-7(-) репортер штаммов. Используйте 3 L4 личинок на 10 см NGM пластину. Используйте 12 пластин и поддерживать при 20 ° C. -7 -6 Настройка поколения F1 репортер штаммов дикого типа. Используйте 3 L4 личинок на 10 см NGM пластину. Используйте 4 пластины и поддерживать при 20 ° C. -5 -4 -3 Блич daf-7(-) репортер штаммов в послеобеденное время (~ 5 вечера) и хранение яиц на 3 10 см пластины НГМ и поддерживать при 20 ° C. -2 Отбеливатель дикого типа репортер штаммов утром (~ 10 am) и депозит яйца на 3 10 см пластины НГМ и поддерживать при 20 ° C. -1 0 L4 мыть тарелки RNAi яйцо-5 10 см. Используйте 3 пластины на штамм и поддерживать при 20 ° C. 1 Вымыть 1-день взрослых к НСК пластины семенами с 2.0E + 9 клеток / мл. использовать 3 пластины на штамм и поддерживать при 20 ° C. 2 Мыть 2 день взрослых к НСК пластины семенами с уровнями экспериментальных продуктов питания. Используйте 3 пластины на штамм и смену экспериментальной температуры. 3 Переезд в свежий НСК пластины. Используйте 3 пластины на штамм и поддерживать экспериментальные температуре. 4 5 Переезд в свежий НСК пластины. Используйте 3 пластины на штамм и поддерживать экспериментальные температуре. 6 Забрать животных от плиты и подготовить для изображений.

Таблица 3: расписание для визуализации трубопровода. Схематический план шагов, необходимых для создания широкого диапазона DR изображений эксперименты с использованием флуоресцентных transcriptional репортер штаммов в daf-7(-) и дикого типа стола при различных температурах в качестве примеров.

Discussion

Здесь мы представляем новый метод для диетическое ограничение, инкапсулирующий гораздо более широкий спектр концентрации пищи чем ранее опубликованные протоколы. Этот метод связывает два ранее отдельные явления, видели в C. elegans доктор литературы, бактериальных лишений и классической диетическое ограничение, позволяя как диетическое эффекты, чтобы быть изучены под одним протоколом. С помощью новой парадигмы DR широкого диапазона, мы представляем общие рамки для изучения экспрессии генов одну ячейку в ответ на конкретные экологические биток и определить, каким образом эта ячейка кодирует информацию. Наша платформа состоит из двух экспериментальных протоколов, которые показывают, как продолжительность жизни и выполнять количественные изображений, соответственно, под широким диапазоном данных Доктор из этих экспериментальных протоколов могут быть проанализированы с вычислительной анализы, в Эти рамки для количественной оценки информацию, закодированную изменения в уровнях выражения гена или продолжительности жизни в различных условиях.

Продолжительность жизни экспериментов с использованием широкого диапазона DR парадигмы включают шесть различных продуктов питания уровни (Таблица 1). Это требует более трудоемкий подход, чем изучению долголетия под меньше пищи уровнях, например диетических лишение10,11 или используя генетический фон есть 2 35. Однако изучения на срок под одно условие может ограничить интерпретации роль гена в DR. Например мы недавно показал, что мутанты daf-7 имеют двунаправленные затухания реакции на питание концентрации по сравнению с дикого типа животных12 (Рисунок 1A). В отсутствие пищи daf-7 мутантов отображения сокращение их жизни по сравнению с животными дикого типа. Если мы только рассматривала диетических лишения, мы бы интерпретировать что daf-7 ген как необходимые расширения только в жизни, , когда в действительности роль daf-7 является более сложным. Таким образом критический исход этой части протокола является установить ли ген интереса участвующих в модулирует общую реакцию жизни изменения в изобилии продовольствия.

Одним из основных преимуществ этого протокола, по сравнению с другими методами является, что она использует новый метод для ликвидации производства потомства в животных, проходят анализ жизни. Большинство исследований использовать препарат FuDR чтобы препятствовать распространению микрофлорой в взрослых, делая их стерильными. Однако недавние исследования показали, что лечение FuDR может иметь условие - и ген специфического воздействия на продолжительность жизни17,18,19,20,21, вызов вопрос его общей применимости. В этом протоколе, ликвидация производства потомства достигается через 24 ч лечение животных с RNAi ориентации яйцо-5 ген, который подавляет формирование хитин яичной скорлупы из оплодотворенных яйцеклеток C. elegans , что приводит к их смерти22,23. Преимуществом этого метода является, что он действует очень поздно- и так не вмешиваться с микрофлорой, который является основным регулятором долголетия в C. elegans.

Одно предостережение потенциальных широкий диапазон DR протокола является ее опора на использование антибиотиков для контроля бактерий распространения обеспечить жесткий контроль над бактериальных концентратов. Бактериальные распространения червя в кишечнике как известно быть основной причиной смерти в C. elegans16. Таким образом использование Бактериостатические антибиотики, такие как carbenicillin, в НГМ агар предотвращает бактериальное распространения и увеличивает продолжительность жизни червей, по сравнению с16-антибиотик элементов управления. Некоторые виды антибиотиков, таких как рифампицин36 и членами Тетрациклин семьи37,38, было показано, чтобы продлить срок службы в C. elegans независимо от их влияния на бактериальные распространение. Однако нет никаких доказательств в литературе, что стрептомицина или carbenicillin может увеличить долговечность независимо от их воздействия на распространение бактерий.

Продолжительность жизни можно рассматривать как результат сложных вычислений где экологической информации, маршрутизируются по экспрессии генов в нейронных сетях, препровожден физиология. Наш протокол обеспечивает методологию понять как конкретные гены влияют на этот поток экологической информации. Чтобы решить этот вопрос, нам нужно надежной обработки для определения распределения ответов выражение гена на уровне одной ячейки. Находясь в состоянии оценить не только среднее время ответа экспрессии генов для изменения в изобилии пищи, но также полную статистическую распределение от больших групп населения является важным требованием для применимости нашего метода. Это точное описание ответов выражение гена к изобилию пищи позволяет применение теории информации для количественного определения информации, кодируемых конкретных нейронов, а также кодирования стратегия нейронной цепи.

Изображений и вычислительные аспекты методов, изложенных в настоящем Протоколе, применимы к больший набор биологических контекстов. В нашей работе мы сосредоточены на небольшой нейронной сети участвующих в пищу зондирования, однако, анализ особенностей обработки информации не ограничиваются конкретной ячейки типа или конкретные экологические сигналы. В будущем эти методологии потенциально может распространяться на большее разнообразие входных переменных, влияющих на любые физиологические вывода. Эти подходы будут способствовать более глубокому пониманию как кодирование гена регулирования сети, процесс и передавать информацию.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Баргманн и Хорвиц лаборатории для реагентов. Некоторые штаммы были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Мы также благодарим м. Lipovsek за комментарии по рукописи. Это исследование было поддержано Уэллком траст (проект Грант 087146 в Королевский адвокат), СИББН (BB/H020500/1 и BB/M00757X/1-Королевский адвокат), Европейский исследовательский совет (NeuroAge 242666 в Королевский адвокат), нас национальных институтов здравоохранения (R01AG035317 и R01GM088333 к H.L.) и США Национальный научный фонд (0954578 л, 0946809 GRFP м.з.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

Генетика выпуск 126 диетическое ограничение высок объём изображений теория информации неврологии микрофлюидика нейронные кодирования экспрессии генов
Количественная оценка информации, кодируемых ген выражение уровня во время жизни модуляции под широкий диапазон диетическое ограничение в <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter