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Genetics

Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en C. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un marco que se relacionan con restricción dietética de la amplio-gama de vida y expresión génica. Se describen los protocolos para la restricción dietética de la amplio-gama y para la proyección de imagen cuantitativa de la expresión génica bajo este paradigma. Contorneamos más análisis computacionales para revelar subyacentes características de procesamiento de información de los circuitos genéticos implicados en la detección de alimentos.

Abstract

Los sistemas sensoriales permiten animales detectar, procesar y responder a su entorno. Abundancia de alimentos es una señal ambiental que tiene profundos efectos sobre la conducta y fisiología animal. Recientemente, demostró que la modulación de la longevidad en el nematodo Caenorhabditis elegans por abundancia de alimentos es más complejo que reconocido previamente. La capacidad de respuesta de la vida a los cambios en el nivel de alimento está determinado por genes específicos que actúan mediante el control de procesamiento dentro de un circuito neural de la información. Nuestro marco combina el análisis genético, proyección de imagen de alto rendimiento cuantitativo y teoría de la información. Aquí, describimos cómo estas técnicas pueden utilizarse para caracterizar cualquier gen que tiene una relevancia fisiológica a la restricción dietética de amplia gama. Específicamente, este flujo de trabajo está diseñado para mostrar cómo un gen de interés regula vida útil bajo restricción dietética de la amplio-gama; a continuación, para establecer cómo la expresión del gen varía con el nivel de alimentación; y por último proporcionar una cuantificación objetiva de la cantidad de información transmitida por genes sobre abundancia de alimento en el medio ambiente. Cuando varios genes se examinan simultáneamente en el contexto de un circuito neural, este flujo de trabajo puede descubrir la estrategia de codificación empleada por el circuito.

Introduction

Todos los organismos deben ser capaces de detectar y responder a los cambios en el entorno para asegurar su supervivencia. En los animales, el sistema nervioso es el detector primario y el transductor de información sobre el medio ambiente y coordina la respuesta fisiológica a cualquier cambio que pudiera afectar supervivencia1 del organismo. Abundancia de alimentos es un cue ambiental que se ha estudiado bien en varios contextos que no sólo regula comportamientos relacionados con la alimentación, como forrajeo2, sino que también afecta a la longevidad de un animal. La modulación de duración por los cambios en la abundancia de alimentos es un fenómeno conocido como restricción dietética (DR) y tiene amplia conservación evolutiva3.

El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema potente para resolver cuestiones biológicas fundamentales. Se han desarrollado una gran cantidad de técnicas que permiten la manipulación del genoma del gusano, como gene de RNAi y en vivo técnicas de edición. El pequeño tamaño físico de la lombriz y su transparencia óptica también se prestan en vivo la proyección de imagen de tanto transcripcionales y traduccional reporteros fluorescentes y utilidad de las tecnologías de alto rendimiento como la microfluídica4. Juntos, se pueden aprovechar estas herramientas para examinar cómo neuronal circuitos directo comportamiento de los animales.

C. elegans es un bacterivore y se han publicado varios métodos que permiten el control preciso de la abundancia de alimentos mediante la manipulación de concentración bacteriana5,6,7,8 . Dentro de la comunidad de investigación de C. elegans , DR ha sido estudiado en dos contextos diferentes. El primero puede ser denominado 'clásico DR', refleja los cambios en respuesta a la disminución de los niveles de alimentos en otros organismos. En este contexto, disminuir la abundancia de alimentos de los niveles de ad libitum resulta en una vida cada vez más hasta que se llega a un grado óptimo, después de que la longevidad de este punto disminuye con la reducción adicional de alimentos6,7, 9. El segundo contexto bajo el cual el Dr. ha sido estudiado en C. elegans es privación dietética en la que se incrementa la longevidad de los gusanos de la eliminación completa de cualquier fuente de alimentación bacteriana10,11. En Entchev et al., (2015)12, demostramos que la complejidad de la DR resultante de estos dos paradigmas diferentes puede examinarse simultáneamente bajo un contexto llamamos 'amplia gama DR'. Mediante el protocolo descrito a continuación, identificamos una nueva clase de genes Dr. eso bidireccional modular la respuesta de vida a la abundancia de comida y participan en circuitos neurales que percibir alimentos12 (figura 1).

La respuesta de un animal a los cambios en el ambiente integra una secuencia de procesos biológicos que vinculan el sistema sensorial a complejas interacciones reguladoras transmitir información ambiental a la fisiología. Aunque los detalles mecanicistas de tal "flujo de información" son a menudo desconocidos, herramientas genéticas pueden utilizarse para adquirir una visión de cómo está organizado este cómputo complejo entre diferentes componentes biológicos. En nuestro reciente trabajo, mostramos que daf-7 y tph-1 están implicadas en la transmisión de información ambiental sobre la abundancia de alimentos a través de un circuito neural detección de alimentos que modula la esperanza de vida en C. elegans12 , 13. aplicando el marco matemático de la teoría de la información14, hemos sido capaces de cuantificar la cantidad de información ambiental, en términos de bits, que está representado por los cambios de expresión génica en daf-7 y tph-1 en las neuronas específicas a través de niveles diferentes. De esta forma, entonces fuimos capaces de descubrir la estrategia de codificación empleada por este circuito neural y cómo se controla genéticamente (figura 2).

En el siguiente protocolo, describiremos los pasos necesarios para entender cuáles son los efectos de los genes de interés expresado en neuronas específicas y cómo participan para el flujo de información de alimentos del entorno a la vida. En términos generales, nuestro marco se divide en dos protocolos experimentales y un flujo de trabajo computacional. Para los aspectos experimentales, es crítico contar con mutantes de los genes de interés que puede ser examinado bajo amplia gama reporteros transcripcionales DR. Faithful también son necesarias para cuantificar el nivel de expresión de los genes a nivel de diferentes alimentos. Para poder llevar a cabo el análisis computacional en nuestro método, el conjunto de datos debe ser de tamaño suficiente para proporcionar estimaciones significativas de distribuciones de expresión. Aunque proporcionamos códigos de fuente de plantilla para el análisis, el usuario debe estar familiarizado con el lenguaje de la teoría de la información que se utiliza ampliamente a lo largo de nuestro marco computacional. El código fuente escrito en R y C++. Por lo tanto, un cierto nivel de conocimientos de programación es también necesario para aplicarlos de una manera significativa.

Protocol

1. preparación de culturas bacterianas y placas para General Worm cultura

  1. preparar 100 mL de medio de caldo (LB) Lisogenia en una botella de vidrio de 250 mL y esterilizar en autoclave.
  2. Inocular la botella con una sola Colonia de la cepa de Escherichia coli OP50, incubar a 37 ° C durante la noche y luego almacenar a 4 ° C hasta que se necesite la cultura.
  3. Preparar 5 L de crecimiento nematodo estéril mediano (NGM) agar 15 alícuota 12 mL volúmenes y en platos de Petri plástico estéril 6 cm.
  4. Permitir que el agar durante la noche y luego almacenar a 4 ° C hasta que sea necesario.
  5. Semilla de NGM placas de al menos 3 días antes 225 μL de la cultura OP50 refrigerada. Almacenar las placas a 20 ° C hasta que sea necesario.

2. Preparación de cultivos bacterianos y diluciones para los experimentos de

  1. preparar dos porciones de 500 mL de medio LB en un matraz de Erlenmeyer de 2 L y esterilizar en autoclave.
  2. Inocular cada frasco con una sola Colonia de OP50 y crecen a 37 ° C, agitación a 200 rpm por alrededor de 14 h.
  3. Complementar las culturas con la estreptomicina antibiótico a una concentración final de 50 μg/mL. Continuar agitando por 30 min a 37 ° C luego coloque los frascos en hielo por 15 minutos
  4. Transferencia de 450 mL de cada cultivo en botellas de centrífuga estéril separada (idealmente botellas de 500 mL capacidad para evitar rajaduras las culturas). Conservar la cultura sobra en el hielo, ya que se utilizará para determinar la concentración de las bacterias.
  5. Desactivación de las botellas a 4500 x g en un sistema de centrífuga refrigerada a 4 ° C por 25 min descartar sobrenadante y almacenar las botellas en el hielo.
  6. Diluir 100 μL de cultura sobra cada frasco en 900 μL de estéril lb uso 1 mL de LB estéril a cero el espectrofotómetro y luego determinar el OD 600 de la dilución de 10 veces de cada cultura. Si por ejemplo, el OD 600 de la dilución de 10 veces de la cultura durante la noche es 0.28 entonces la cultura tenía un real OD 600 2.8.
  7. Uso una solución de reserva de trabajo de las bacterias de 1.12 x 10 10 OP50 células/mL, que equivale a un OD 600 de 56. Por lo tanto, usando el ejemplo OD 600 de 2.8 desde arriba, Resuspender el precipitado de la cultura de 450 mL en un 20 th del volumen original, que en este caso es de 22,50 mL. Resuspender las bacterias con una solución basal estéril S suplementada con estreptomicina a 50 μg/mL (SB + strep).
  8. Resuspender el precipitado en el volumen adecuado de SB estéril + strep.
  9. Hacen todas las posteriores concentraciones utilizadas en experimentos de diluciones seriadas de la bolsa de trabajo en SB + estreptococos utilizando los factores de dilución figuran en la tabla 1.

3. Ajuste para arriba vida experimentos

Nota: se realizan ensayos de vida útil en cultivo de tejidos de 6 cm tratado con 12 mL de agar NGM suplementado con estreptomicina y carbenicilina (NSC), ambos a una concentración final de 50 μg/mL. Estas placas de cultivo de tejidos son adecuadas para ensayos de vida útil sin ningún o muy baja concentración bacteriana, como los gusanos son significativamente menos propensos a pegarse a la pared de la placa y desecación. El uso de dos antibióticos diferentes evita que la cepa OP50 desarrollando resistencia a los fármacos, que es fundamental en el control de la concentración bacteriana en la placa. También, mediante la inactivación de las bacterias con los antibióticos, minimizar los efectos sobre la vida de gusano debido a la infección por patógenos 16. Esto nos permite considerar sólo los componentes relacionados con la alimentación de la concentración bacteriana en estos experimentos. Muchos estudios de envejecimiento C. elegans suplen placas NGM con el fluoro químicos-2 ′-desoxiuridina (FUdR) para representar los adultos estériles. Sin embargo, el uso de FUdR puede ser problemático ya que su uso puede causar varios problemas de confusión con longevidad ensayos 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al., (2015) 12 eludido este problema por la exposición de las larvas L4 a ARNi de huevo-5 22 , 23, que inhibe la transición de ovocitos al embrión mediante el bloqueo de la formación de la cáscara del huevo de fertilizado oocitos de C. elegans, dando por resultado su muerte.

Sembradas de cepas
  1. cultura el C. elegans que se analiza en planchas NGM 20 ° C. permitir que las placas a morir de hambre hacia fuera para asegurar que todos los animales son cultivados de una manera uniforme y que potencialmente representan efectos transgeneracionales de condiciones del desarrollo.
  2. Transferencia de hambre las larvas L1 nuevas placas sembradas de NGM cortando un pequeño trozo de agar (5 mm x 5 mm) de la placa hambrienta con un bisturí estéril y depositarla sobre una placa nueva, un proceso conocido como ' trozos ' por el comm de la investigación de C. elegans unidad 15. Crecen los gusanos hasta que lleguen a la etapa de L4. Cinco larvas L4 por tensión son luego transferidas a placas NGM semillas individuales y mantuvo a 20 ° C. Estos animales representan la generación P0.
  3. Uso L4 progenie de la generación de P0 para configurar la generación F1. Coloque individualmente las larvas L4 de F1 de la cepa de tipo salvaje N2 a 30 placas sembradas de NGM.
    Nota: Para las cepas mutantes, el número de platos necesarios depende de su tasa de crecimiento. Por ejemplo, daf-7(ok3125) los animales experimentan una detención transitoria dauer a 20 ° C. Así, esta variedad produce menos larvas L4 de una placa del tipo salvaje de N2 gusanos.
  4. Para compensar esta diferencia, configurar placas de daf-7(ok3125) hasta un día antes que N2 placas y en un número mayor, una buena relación de trabajo es de 3:1.
  5. Transferencia sincronizada progenie L4-etapa de los padres de la F1 a NGM placas suplementados con 1 mM IPTG y carbenicilina μg/mL 50 (placas de RNAi) que fueron sembradas con 225 μL de bacterias HT115 expresando dsRNA contra el gen del huevo-5 y mantenerse en 20 ° C por 24 h. Al menos 360 lombrices por tensión, a una densidad de 15 animales por placa, se necesitan por experimento.
  6. Después el huevo-5 tratamiento de ARNi, transferir los gusanos a NSC placas sembradas con 225 μL de la OP50 tratados con estreptomicina en una concentración de 2 x 10 9 células/mL (tabla 1) por 24 horas a 20 ° C. Para evitar daños a los gusanos durante esta y todas las transferencias posteriores, suavemente primicia animales de debajo del gusano usando un gusano muy fino suavemente curvado pick. Flotador de los animales del gusano pick sumergiendo en una gota de 10 μl de SB + estreptococos colocados en la superficie de la placa nueva.
  7. Al día siguiente, redistribuir los gusanos a las placas de NSC que representa cada uno de lo alimentos los niveles lISTEC en la tabla 1 como un conjunto de placas de NSC que no contienen bacterias. Todas las placas de NSC con 225 μL de la concentración relevante de bacterias de la semilla y las placas de NSC libre de bacterias con SB 225 μL + estreptococos la semilla. Mantener los gusanos con una densidad de 15 animales por placa, dando como resultado al menos cuatro placas por condición del alimento por cepa. Cambiar las placas a la temperatura experimental.
  8. Transferencia de gusanos a platos frescos de NSC sembradas con concentración de alimento apropiado según el horario que se indica en la tabla 2.
    9. Escoger animales de puntaje
  9. movimiento por insistencia suavemente con un alambre. Falta de respuesta se anotó como la muerte. Puntuación de animales para la muerte en cada transferencia punto y entonces todos los días después del último punto de transferencia.

4. Ajuste por proyección de imagen experimentos

Nota: los pasos descritos en esta sección son suficientes para generar suficientes lombrices por cepa para la proyección de imagen una condición experimental alimentos a una temperatura determinada. Este protocolo puede escalarse para adaptarse a la cantidad de condiciones que será reflejada en cualquier día dado. Sin embargo, se debe tener cuidado en el diseño experimental para asegurarse de que el plazo es razonable y que los animales a través de diferentes cepas no tienen una diferencia de edad mayor de 12 horas en el día de la proyección de imagen. Se recomienda que los reporteros transcripcionales se va a examinar son solo copia transgénicos, como esto asemeja más a la regulación natural del gen. El protocolo descrito a continuación y resumidas en la tabla 3, proporciona también un método optimizado para la obtención de poblaciones de edad sincrónico grande emparejado de cepas, que se pueden utilizar para otros flujos de trabajo experimentales.

  1. Animales en experimentos realizados en placas de cultivo de tejidos de 10 cm tratada para permitir una mayor densidad de gusanos la proyección de imagen de la cultura (∼ 100 animales por placa) de ensayos de la vida.
  2. Llenan 30 mL de placas de agar NGM y semilla con alícuotas de 5 225 μL de refrigerados OP50 cultura en una cruz-como la formación de las placas de 10 cm.

5. Inicial cultura de reportero cepas

  1. cultura el C. elegans cepas que se analizaron en semillas planchas NGM 20 ° C. permitir que las placas a morir de hambre hacia fuera para asegurar que todos los animales son cultivados de una manera uniforme y que potencialmente son responsables de cualquier efectos transgeneracionales de las condiciones del desarrollo de.
  2. Pedazo la L1 hambrienta larvas sembradas planchas NGM y crecen hasta llegar a la etapa de L4. Transferencia de tres larvas L4 por tensión a dos placas NGM sembradas a 20 ° C. Estos animales representan la generación P0.
  3. Utilice la progenie de L4 de la generación de P0 para configurar la generación F1. Coloque las larvas L4 de F1 de la cepa de tipo salvaje reportero a 4 placas sembradas de NGM. Cepas mutantes, el número de platos necesarios depende de su tasa de crecimiento. Usando el ejemplo anterior de daf-7(ok3125), cepas de reportero en este fondo requiere tres veces el número de la placas y necesita configurar dos días antes de las cepas tipo salvaje de reportera, para tener en cuenta las diferencias en la tasa de crecimiento.

6. Recolección de huevo y sincronización de reportero cepas

Nota: algunos genes de interés en la comunidad de investigación de envejecimiento C. elegans como resultado defectos puesta de huevos cuando mutó y crecimiento que hace más difícil generar grandes poblaciones sincrónicas de animales de diferentes genotipos. Por ejemplo, la mutación de daf-7(ok3125) causa un grave defecto de puesta de huevos en comparación con el tipo tensión de N2. Por lo tanto, para obtener suficiente número de síncronos larvas L4 de diferentes cepas para experimentos cuantitativos de imagen requiere de una metodología más robusta que manualmente recogiendo gusanos. Por esta razón, las cepas transcripcional reportero fueron sometidas a un hipoclorito de sodio (NaClO) y tratamiento de solución de hidróxido de sodio (NaOH) de adultos grávidos para romper abierto los animales liberan sus huevos, un proceso que se conoce comúnmente como ' del blanqueo ' por el C. elegans investigación comunidad 15.

  1. Cuenta de las diferencias en crecimiento las tasas entre cepas y calcular cuando las placas de cada cepa deben ser cosechadas y blanqueadas. Un ejemplo de cuando se blanquean cepas de tipo salvaje y daf-7(ok3125) reportero ver tabla 3.
  2. En serie Lave los gusanos de una cepa determinada de las placas, en el día apropiado, usando 15 mL de SB y recoger en un tubo de 15 mL estéril. Permite que los animales naturalmente sedimento y ajuste el volumen de líquido a 7 mL.
  3. Añadir 2 mL de NaClO de 5% y 1 mL de 5 M NaOH en el tubo que contiene a los adultos grávidos. Muévalo suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante no más de 3 minutos. El NaClO se mata a las bacterias y gusanos, mientras que el NaOH provoca los gusanos para romperse aparte de soltar los huevos fertilizados que contienen al líquido. La quitina de cáscara de huevo alrededor de los embriones les protege de los efectos del tratamiento, siempre y cuando el tiempo de exposición es relativamente corto. Después de la incubación de 3-min, vortex tubo de ~ 30 s para facilitar la ruptura de los cadáveres del gusano.
  4. Después de la rotación de incubación de 3-min la mezcla a 1.000 x g durante 1 min para que sedimenten los huevos. Aspirar más lejos del sobrenadante con una pipeta de vidrio estéril conectada a un frasco de vacío, dejando ~0.5 mL en cada tubo, para no molestar los huevos.
  5. Resuspender el precipitado con 9,5 mL de SB y luego repetir el paso de centrifugación y resuspensión pasos adicionales dos veces para que los huevos han sido lavados con SB un total de tres veces.
  6. Después de la final lavado, pellets los huevos a través de centrifugación y luego deseche todo pero 0,5 mL del sobrenadante. Resuspender los huevos en el restante 0,5 mL de SB y luego alícuota 100 μL en tres placas NGM 10 cm cabeza de serie. Distribuir 100 μl igualmente sobre todo cinco césped bacteriano en cada plato. Para las cepas de tipo salvaje, huevos no deben ser depositados en densidades mayores de 200 por caja.
    1. Mantener las placas a 20 ° C por 48 h y para obtener una población altamente homogénea de larvas L4. Para cepas con fenotipos de retraso en el crecimiento, es recomendable depositar tantos huevos como disponible y aumentar el tiempo de incubación. Por ejemplo, mantener daf-7(ok3125)-que contiene cepas de reportero a 20 ° C ~ 64 h permitir que los huevos eclosionan y alcanzan la etapa L4.

7. Tratamiento de las cepas de reportero con huevo-5 ARNi

  1. en serie lavar los gusanos de las tres placas con 15 mL de SB y recoger el líquido en un tubo de 15 ml estéril. Que las larvas L4 natural de sedimentos y luego aspirar todo pero ~0.5 mL del líquido. En el tipo salvajecepas de reportero e este paso elimina cualquier larvas menores de L4. En fondos mutantes, este paso ayuda a la eliminación de cualquier arrestadas larvas como dauers en el caso de daf-7(ok3125).
  2. Resuspender los gusanos con 9 mL de SB. Otra vez, controlar la velocidad de sedimentación de las larvas L4 y luego aspirar todo pero ~0.5 mL del sobrenadante una vez que la mayoría de las larvas L4 ha peleteado. Repita este proceso una vez más. Luego aspirar todo pero ~0.5 mL del líquido una vez que se ha establecido la mayoría de las larvas L4 de.
  3. Añadir 10 μl de basal estéril S suplementado con 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) al líquido que contienen las larvas L4. Esto actúa como un surfactante y evita que las larvas se adhiera a la superficie interior de las puntas de pipeta plástico.
    1. Resuspender suavemente las larvas con una punta de pipeta P200 baja retención y luego alícuota 150 μL sobre tres placas de ARNi de 10 cm que se siembran con 5 x 225 μL de bacterias de ARNi de huevo-5. Asegurar que los gusanos se distribuyen igualmente por todo césped bacteriano cinco.
  4. Una vez en el agar ha absorbido el líquido, retire cualquier larvas L4 no de las placas que no fueron eliminadas por el procedimiento de lavado por recolección manual. Luego almacenar las placas a 20 ° C por 24 h.

8. Iniciación de la amplio-gama DR

Nota: después de las 24 h huevo-5 tratamiento de ARNi, las larvas L4 que originalmente fueron depositadas en las placas se habrá convertido en adultos 1 - viejos.

  1. Pick off cualquier larvas jóvenes que escaparon el paso previo de extracción manual apagado en esta etapa, dejando sólo los adultos 1 día - la vieja en las placas de.
  2. Para cada cepa, lave los adultos 1 día de edad de las tres placas con 15 mL de estéril SB + estreptococos en un tubo de 15 mL. Que los gusanos naturalmente sedimento y luego aspirar todo pero 0,5 mL del sobrenadante. Suspender las lombrices con 9,5 mL de SB + estreptococos y repita los pasos de sedimentación y lavado de.
  3. Después de la final de lavado, permite los gusanos al sedimento y luego aspirar todo pero 0,5 mL del sobrenadante. Añadir 10 μl SB + Plu y resuspender suavemente las larvas usando una punta de pipeta P200 y luego alícuota de 100 μL en una placa de NSC sembrada con bacterias 5 x 225 μL en una concentración 2 x 10 9 células/mL.
    1. Distribuir 100 μl uniformemente a través de todos cinco césped bacteriano. Bajo el microscopio, estimar el número de animales presentes en la placa: el objetivo es tener entre 100-150 gusanos en la placa de.
    2. Determinar la cantidad de líquido necesaria para conseguir una densidad de gusano dentro de esta gama y luego alícuota sobre dos placas adicionales. Ajustar el número de gusanos en la primera placa también caen en este rango y luego almacenar las placas a 20 ° C por 24 h.
  4. Al día siguiente, recoger los adultos 2 días de edad y distribuir a placas de NSC nuevas sembradas con la concentración experimental de alimentos (tabla 1), reutilizando los métodos establecidos en los pasos 2 y 3. Una vez que el líquido es absorbido por el agar, cambiar las placas a la temperatura experimental de 24 h.
  5. Al día siguiente, recoger los adultos 3 días de edad y distribuir a placas de NSC frescas sembradas con la misma concentración experimental de la comida, reutilizando los métodos establecidos en los pasos 8.3 y 8.4. Una vez que el líquido es absorbido por el agar, retomar las placas la temperatura experimental para 48 h.
  6. Recoger a los adultos 5 días de edad y distribuir a placas de NSC frescas sembradas con la misma concentración experimental de la comida, reutilizando los métodos establecidos en los pasos 8.3 y 8.4. Una vez que el líquido es absorbido por el agar, retomar las placas la temperatura experimental de 24 h.

9. Microfluidos imagen de reportero cepas

  1. el día 6 de la edad adulta, la imagen animales usando un encargo microfluídicos plataforma 24 , 25. Físicamente recoger animales de las tres placas y suspender en un tubo criogénico de 5 mL conteniendo 4,5 mL de SB + strep.
    1. Una vez que los gusanos sedimento, aspirar todo pero ~0.5 mL del sobrenadante y resuspender los animales en 4 mL de SB + estreptococos. Este elimina las bacterias de exceso que de lo contrario pueden interferir con la proyección de imagen. Los gusanos se introducen en un dispositivo de microfluidos personalizado mediante presión por flujo 24 , 25. Dentro del dispositivo, gusanos individuales dirigidas hacia y atrapados dentro de un canal de cerrado por presión-conducido de la en-viruta válvulas 26 bajo el control de software a la medida.
  2. Una vez un gusano está atrapado de cabeza en el canal de proyección de imagen, recoger un fluorescente z-stack, con secciones de 50 en 2 pasos de μm, utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar con un 40 X objetivo de aceite (NA 1.3) y una cámara. Recoger imágenes fluorescentes rojas y verdes para cada uno de los reporteros transcripcionales simultáneamente utilizando un separador de emisión y almacenados para su análisis. Adquisición de imágenes es automático mediante software a la medida.
  3. Proceso de la imagen automáticamente uso de secuencias de comandos MATLAB personalizado 27 (disponible en https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-pilas se carga en MATLAB y analizadas para identificar pares de neuronas y sus ubicaciones en el plano de proyección de imagen. Luego se calculan las proyecciones máximas y un algoritmo de umbral se utiliza para localizar las células fluorescentes individuales. Identificación de la célula entonces se calcula basada en distancias relativas y ubicaciones en el gusano ' cabeza.
  4. Para cuantificar la fluorescencia del reportero, extraiga el volumen tridimensional alrededor de cada localización celular de la z-pila. Integrar la intensidad en un número constante de los píxeles más brillantes, que encapsulan totalmente toda la célula en todos los casos.
  5. Para eliminar la interferencia de los cambios cepa específica o condición experimentales en la tripa auto-fluorescencia de cada animal, calcular la intensidad de fondo para los pares de la célula más cercana de la tripa (ADF y ASI) mediante la estimación del modo de la distribución de la intensidad en un volumen alrededor de la neurona. Restar este valor de intensidad del fondo de la fluorescencia integrada para obtener la salida final.

10. Datos de la Asamblea

Nota: las intensidades de fluorescencia de neuronas todas analizadas por el software de procesamiento de imágenes se combinan en el archivo de datos de expresión filtrada (FED) que se utiliza para estimar los perfiles de distribución de genes expresión (plantilla R y secuencias de comandos de C++ están disponibles en https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Manualmente revise cada procesado de imagen para confirmar la correcta identificación de todas las células. Imágenes con la identificación errónea de la célula deben grabarse en un archivo de exclusión. En Diana et al., (2017) 13 el archivo de exclusión consiste en una tabla binaria con ' 0 ' para corregir y ' 1 ' para la identificación de celda incorrecta. El número de filas de la tabla es igual al número de gusanos con una columna para cada celda de imagen (es decir ASI, ADF y NSM).
  2. Generar el archivo de la reserva federal:
    1. ejecutar el bash script " gen_data + tiempo de " generar archivos específicos de célula combinando los valores de expresión obtenidos de cada gusano imagen filtrada utilizando el archivo de exclusión. Para cada carpeta generada por el software de procesamiento de imágenes, la secuencia de comandos de bash lee el archivo de anotaciones < folderprefix > _EXP.txt para extraer las condiciones experimentales y el archivo de exclusión < folderprefix > _X.csv para seleccionar solamente correctamente identificado las neuronas. Valores de expresión se pueden leer los archivos < folderprefix > _data_ < neurona > .csv.
    2. Concatenar todos los archivos en " FED_split.dat " y ordenar por el código de lote del experimento, gusano de etiqueta y la célula de identidad.
    3. Run " tipo " (programa C++, uso:. / ordenar FED_split.dat FED_merged.dat) para seleccionar las entradas con fluorescencia cero para cada celda y combinarlos en filas solo en FED_merged.dat.

11. Estimación de información codificada

Nota: el siguiente procedimiento describe cómo cuantificar la información sobre las condiciones ambientales específicas codificadas por el conjunto de expresiones del gene. En Diana et al. (2017) examinaron a 13, la información sobre abundancia de alimento en el medio ambiente, sin embargo, el método sí mismo es aplicable a cualquier número discreto de Estados ambientales. El ingrediente esencial para cuantificar información teórica variables como entropías de información o la redundancia es la distribución de probabilidad conjunta de las respuestas neuronales en el sets estímulos ambientales considerados. Para realizar dicha estimación, es fundamental contar con una muestra suficiente de la respuesta a través de las poblaciones de gusanos. Se pueden estimar las distribuciones Gaussianas de muestras relativamente pequeñas; sin embargo, es importante tener una idea de la forma esperada de la distribución de expresión para cuantificar el tamaño de muestra apropiado para una estimación confiable de la densidad. Debido a la inevitable variabilidad a través de diferentes ensayos, es esencial para comprobar que los valores centrales de las distribuciones de diversas repeticiones del mismo experimento no son sistemáticamente cambiados o que ninguna de las características estadísticas de la distribución de la expresión no se alteran significativamente a través de ensayos. En el caso de la variabilidad del juicio a prueba es compatible con la variabilidad dentro de cada ensayo, es fundamental equilibrar el número de ensayos frente al número de gusanos dentro de los ensayos en un promedio de los factores ambientales y biológicas que afectan el juicio a prueba variabilidad. Undersampling esos factores fuertemente podría sesgar el análisis de información teórica.

  1. Secuencia de comandos como el R " code3D.R " proporciona una plantilla para generar densidades tridimensionales basadas en el archivo " FED_merged.dat ", modificar esta plantilla según el formato de encabezado específico de FED. La lista de " HeaderNames " representa los nombres de cada campo en el archivo de la FED mientras " RONames " es la lista de las lecturas. La secuencia de comandos utiliza el paquete de R ' ks ' 28 , 29 estimar distribuciones multivariantes dentro de una cuadrícula hypercubic con GS de cubos de cada dimensión subdividiendo el rango entre el mínimo y máximo valores en el conjunto de datos para cada lectura. Cuando la variable interna " grupo " se establece en 0, todos los datos son utilizados para la estimación de la densidad. Cuando la " grupo " label es entre 1 a 5 el conjunto de datos se divide en 5 conjuntos disjuntos, y se estiman las densidades de expresión desde el 80% de los datos resultantes de la exclusión de uno de los cinco conjuntos. Esta característica se utiliza posteriormente para estimar incertidumbres.
    Nota: El uso de code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < comida > < GS > < outfolder > < etiqueta > < grupo > < frac > donde GT representa el genotipo, el alimento es la condición ambiental, outfolder es el preexistente carpeta donde se almacenarán las distribuciones, la etiqueta es un prefijo de nombre de archivo y frac es la fracción del conjunto de datos utilizado.
  2. Para cada condición ambiental generan las distribuciones multivariantes con rejilla diferentes tamaños GS (e.g. 20,30,40 contenedores). Para reducir la carga computacional, valores más pequeños de GS son preferibles cuando resoluciones más finas no cambian significativamente la valoración de la información. Distribución de la expresión génica se escriben en la carpeta < outfolder > especificado al ejecutar code3D.R como solos archivos de texto de la columna con la estructura de nombre de archivo < etiqueta > _ < GT > _ < alimentos > _GS < GS > _group < grupo de >. dat.
    Nota: los pasos anteriores proporcionan la estimación de las distribuciones de probabilidad condicional Equation 1 donde g denota el vector de toda lectura y f es la condición ambiental. Sin embargo, para calcular la información mutua entre genes y el medio ambiente 30 , 31.
    Equation 2
    tenemos la distribución de la entrada Equation 3 que también determina el (input-) un promedio de expresión génica < IMG alt = "Ecuación 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Cuando la distribución de entrada no es directamente, una cantidad significativa para caracterizar las características de codificación es la capacidad del canal, que puede ser obtenida maximizando la información mutua entre todas las distribuciones de entrada posible.
  3. Utilizando la distribución de la expresión génica, aplicar el algoritmo de 32 Arimoto Blahut para estimar la capacidad del sistema y la distribución de la entrada de medio ambiente que maximiza la información. Un ejemplo de implementación del algoritmo se puede encontrar en el programa de C++ " Ccap3D.cpp " para la expresión de genes tridimensional código analizado en Diana et al (2017) 13. Ejemplo: si se obtienen distribuciones de genotipo GT123 del 80% de los datos (grupo 3) con el tamaño de la cuadrícula igual 30 y almacenado en la carpeta ". /pdf/ " con un prefijo de etiqueta = " PDF ". Es el comando para calcular la información codificada en el fondo de GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Nota: la estimación de la información codificada por el sistema se ve afectada por múltiples fuentes de incertidumbre, incluyendo la elección de la estimación de la densidad algoritmo y muestra sesgo de tamaño. Se deben repetir usando métodos de estimación de densidad diferente para evaluar el tamaño del sesgo sistemático introducido por cada algoritmo pasos 11.1-11.2.
  4. Para estimar la incertidumbre debido al tamaño de la muestra, calcular información de pasos 11.1-11.2 con grupos de entre 1 a 5. La variabilidad a través de estos cinco muestreos independientes del 80% de los datos que reflejan el impacto del tamaño de muestra en la valoración de la información.
  5. Calcular información pasos 11.1-11.2 sobre aumento de fracción de los datos (como en el paso 5) para corregir por sesgo de tamaño de la muestra (jack-knife método) 33.

12. Cálculo de la redundancia, ruido y señal de correlación

distribuciones entradas
  1. uso el óptimo obtienen en la estimación de la máxima información para calcular la información mutua Equation 5 entre la entrada y gene respuesta de expresión de cada neurona N. El archivo de origen C++ " GetMI1D.c " es un programa de muestra para obtener información mutua marginal de las distribuciones de probabilidad conjunta.
  2. Calcular redundancia tomando la suma de la información mutua para cada neurona obtenida anteriormente y luego restar la capacidad de canal.
  3. Calcular el " shuffle " término información Equation 6 13 , 34. Un archivo de código fuente de plantillas C++ puede encontrarse en " GetShuffle.c ".
  4. Uso el " shuffle " plazo para calcular la correlación de la señal y el ruido. Para el signacorrelación de l tenemos Equation 7 y para la correlación del ruido que tenemos Equation 8.
  5. Incertidumbres en redundancia, obtener ruido y correlación en cuanto a la información total (paso 11.3 de la sección anterior) de múltiples muestreos del 80% de los datos y tomar la desviación estándar de la señal.

Representative Results

Mediante la realización de experimentos de vida en los mutantes de los genes de interés junto con el tipo tensión de N2, uno puede establecer si estos genes tienen un papel en la respuesta alimentaria al DR de la amplio-gama. La respuesta de tipo salvaje debe ser comparable a la representada en la figura 1A. Cualquier modulación de esta respuesta por los mutantes, reflejado por un efecto no uniforme en condiciones de alimentación, indica que estos genes afectan la capacidad del gusano de responder correctamente a los cambios en la abundancia de alimentos, en que punto de la posterior investigación de la las respuestas de la expresión de estos genes a DR de la amplio-gama está garantizado. Si, sin embargo, la respuesta de la longevidad de los mutantes no es significativamente diferente del tipo salvaje los genes no tienen ningún papel en la transducción de los efectos de la amplio-gama DR, al menos en el nivel de vida promedio. Si las mutaciones causan un cambio uniforme de la respuesta de vida todo los genes tienen un efecto independiente de la alimentación sobre la duración. Esto no descarta la posibilidad de que la expresión de los genes de interés es alimentos sensibles, en cuyo caso la información transportada por estos genes no se transmite a la vida.

La próxima etapa del protocolo es determinar cómo cambian los niveles de expresión bajo amplia gama de DR para los genes de interés. En la figura 1B, ilustramos esto a través de los niveles de expresión de un reportero transcripcional de daf-7, que muestra una respuesta a los cambios en el nivel de alimento en las neuronas sensoriales ASI. En un mutante de daf-7(-) , se altera la respuesta de la expresión del reportero transcripcional. Si los genes de interés son realmente en capacidad de respuesta en el nivel de vida se puede esperar que su expresión también cambiará con la comida. Correspondientemente, un reportero transcripcional en el fondo mutante debe tener un perfil de expresión alterada en respuesta a DR de la amplio-gama. Sin embargo, también es posible que el reportero transcripcional del gen de interés en un fondo de tipo salvaje no muestra los alimentos sensibles cambios en la expresión. En esta situación, esto puede indicar un efecto regulador postranscripcional que cae fuera del alcance de este protocolo.

En Diana et al., (2017)13, se obtuvieron valores de expresión para daf-7 en ASI y tph-1 ADF y NSM. En la figura 2A, ilustramos la estimación de la distribución de la expresión en ASI y ADF para un nivel determinado de alimentos. Tener múltiples lecturas de imágenes único gusano nos permite analizar no sólo la cantidad de información codificada en forma independiente por cada neurona, sino también la información combinatoria del circuito entero neuronal (figura 2B-2 C). La combinación de estas dos medidas información teórica nos permite caracterizar el sistema en términos de la estrategia de codificación empleado por las neuronas para transmitir información sobre la comida. La cantidad de redundancia en el circuito puede obtenerse tomando la suma de la información mutua para cada neurona y restando la información mutua común (capacidad de canal) obtenida considerando las lecturas combinatorias del circuito. Un valor positivo de tal diferencia denota un carácter redundante de la estrategia de codificación debido a que la información acumulada entre las partes es mayor que la real información codificada por todo el circuito. Por el contrario, un valor negativo refleja una estrategia sinérgica porque la verdadera información es mayor que la suma de sus componentes (figura 2B). Información y redundancia pueden ser comparados a través de diferentes genotipos para explorar posibles funciones de orden superiores de regulación génica, por ejemplo en Diana et al. (2017) 13 el efecto del daf-7 mutación cambia la estrategia de codificación de redundancia sinérgica (figura 2C-2D).

Figure 1
Figura 1 : Respuesta de esperanza de vida y expresión genética bajo amplia gama DR. (A) la media vida del salvaje tipo tensión de N2 (línea negra) muestra una respuesta compleja a DR de la amplio-gama. Se atenúa la magnitud de esta respuesta en un mutante nulo del gen daf-7 (línea roja). Barras de error representan el error estándar de la media, los datos agrupados de Entchev et al. (2015) 12. niveles de expresión (B) la media de un reportero transcripcional del gen daf-7 fondo de tipo salvaje (línea negra) también muestran una respuesta no monotónica complejo a DR de la amplio-gama. En fondo genético daf-7(-) la expresión de este reportero transcripcional es altamente atenuada y muestra poca respuesta a los cambios en el nivel de alimento. Barras de error representan el error estándar de la media, los datos de un único ensayo en Entchev et al. (2015) 12. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Metodología computacional. (A) ilustración de la estimación de densidad de dos dimensiones de expresión de la tph-1 en ADF y daf-7 expresión ASI como obtener el paquete de 'ks' R con una dimensión de rejilla 30 x 30. (B) visualización de la información codificada por la expresión conjunta de tph-1 y 7 de daf (entero) e individualmente (suma de partes) para las neuronas ADF, ASI y NSM. Caracteres redundantes y sinérgicos de la codificación están representadas por la diferencia entre la altura de las barras apiladas a la derecha y la información codificada por el circuito completo. (C) comparación entre información alimentaria de animales de tipo silvestre y mutantes daf-7(-) . (D) la reducción de la información mutua observado en los mutantes es acompañado por un interruptor hacia codificación sinérgico. Paneles B, D se adaptan de Diana et al. (2017) 13. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración bacteriana (células/ml) Densidad óptica (600 nm) Factor de dilución (de anterior)
1.12E + 10 56.000 0.00
2.00E + 09 10.000 5.60
6.32E + 08 3.160 3.16
6.32E + 07 0,316 10.00
2.00E + 07 0.100 3.16
0 (S basal) 0.000 NA

Tabla 1: niveles de alimentación y factores de dilución utilizados en el DR. de la amplio-gama Bacteriasl las concentraciones (células/mL) utilizadas en el protocolo del DR de amplia gama, junto con sus respectivas mediciones de600 de OD y el factor de dilución requerido para alcanzar cada concentración de la anterior.

Temperatura experimental de vida útil
Día 12,5 ° C 15° C 17,5 ° C 20° C 22.5° C 25° C 27,5 ° C
-12 Pedazo de todas las cepas a placas NGM frescas y se mantiene a 20° C
-11
-10 Configurar P0 generación de cepas daf-7(-) y mantener a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)
-9 Configurar P0 generación de cepas de tipo salvaje y mantener a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)
-8
-7
-6
-5 Configurar la generación F1 de cepas daf-7(-) y mantener a 20° C (1 L4 por placa, 90 placas)
-4 Configurar la generación F1 de las cepas de tipo salvaje y mantener a 20° C (1 L4 por placa, placas de 30)
-3
-2
-1
0 Recoger las larvas L4 de F2 a > ARNi de huevo-5 placas y mantener a 20° C (15 L4 por placa, placas de 24)
1 Hacia adultos 1 día - la vieja de NSC placas sembradas con 2, 0E + nivel de alimentos de 9 células/ml y se mantiene a 20 ° C
2 Pasar 2 días de edad adultos NSC placas sembradas con las condiciones experimentales alimentaria y temperatura experimental
3 Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia
4
5 Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia
6
7 Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia
8
9 Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia
10
11 Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia
12
13
14 Transferencia Transferencia Transferencia Transferencia
15
16
17
18 Transferencia Transferencia
19
20
21
22 Transferencia

Tabla 2: calendario de duración de la vida llevó a cabo a diferentes temperaturas. Resumen esquemático de los pasos necesarios para configurar amplia gama DR vida experimentos a diferentes temperaturas, utilizando cepas de tipo salvaje y daf-7(-) como ejemplos. El número de transferencias a platos frescos de cada nivel de comida experimental disminuye con el aumento de temperatura. Esto es para tener en cuenta el hecho de que los animales a temperaturas más altas están envejeciendo más rápidamente y por lo tanto más propensas a daños por transferencia.

Días IMA
Ging tubería -14 Pedazo reportero cepas en daf(-) fondo. Mantener a 20 ° C. -13 Pedazo reportero cepas tipo salvaje de fondo. Mantener a 20 ° C. -12 Configurar P0 generación de cepas de reportero daf-7(-). Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas y se mantiene a 20 ° C. -11 -10 Configurar P0 generación de cepas de tipo salvaje reportero. Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas y se mantiene a 20 ° C. -9 -8 Configurar la generación F1 de daf-7(-) cepas de reportero. Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 12 placas y se mantiene a 20 ° C. -7 -6 Configurar la generación F1 de cepas de tipo salvaje reportero. Utilice 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Use placas de 4 y se mantiene a 20 ° C. -5 -4 -3 Bleach daf-7(-) cepas de reportero en la tarde (~ 5 pm) y depositar huevos en 3 planchas NGM de 10cm y se mantiene a 20 ° C. -2 Bleach tipo salvaje reportero cepas mañana (~ 10 m) y depósito de huevos en cm 3 10 planchas NGM y mantener a 20 ° C. -1 0 Lavar L4 a placas de ARNi de huevo-5 de 10 cm. Usar 3 placas por cepa y mantener a 20 ° C. 1 Lavar 1 día adultos NSC placas sembradas con 2, 0E + 9 células / ml. Utilice 3 placas por cepa y mantener a 20 ° C. 2 Lavado 2 días adultos a placas de NSC sembradas con niveles de alimento experimental. Utilice 3 placas por cepa y cambio a temperatura experimental. 3 Traslado a nuevas placas de NSC. Utilizar 3 placas por tensión y se mantiene a temperatura experimental. 4 5 Traslado a nuevas placas de NSC. Utilizar 3 placas por tensión y se mantiene a temperatura experimental. 6 Recoger animales de las placas y prepararse para la proyección de imagen.

Tabla 3: calendario de tubería la proyección de imagen. Resumen esquemático de los pasos necesarios para configurar la amplio-gama DR experimentos utilizando cepas fluorescentes reportero transcripcional en fondos daf-7(-) y tipo salvaje a diferentes temperaturas como ejemplos la proyección de imagen.

Discussion

Aquí, presentamos un nuevo método de restricción dietética que encapsula una gama mucho más amplia de alimentos concentraciones de protocolos previamente publicados. Este método enlaza dos fenómenos separados previamente vistos en literatura Dr. C. elegans , bacteriana privación y restricción dietética clásica, permitiendo ambos efectos dietéticos a ser estudian bajo un protocolo. Con el nuevo paradigma del Dr. amplio-gama, presentamos un marco general para examinar la expresión de gene de la célula en respuesta a una señal ambiental específica y determinar cómo este celular codifica la información. Nuestro marco consta de dos protocolos experimentales que ilustran cómo realizar las esperanzas de vida y la proyección de imagen cuantitativa, respectivamente, bajo amplia gama DR. Data de estos protocolos experimentales se pueden examinar luego con el análisis computacionales en este marco para cuantificar la información codificada por los cambios en los niveles de expresión génica o duración de la vida en condiciones diferentes.

Experimentos de la vida útil utilizando amplia gama Dr. paradigma implican seis niveles distintos alimentos (tabla 1). Esto requiere un enfoque más intensivo que examinando longevidad bajo menos niveles de alimentos, tales como privación dietética10,11 o usando el fondo genético de comer-2 35. Sin embargo, examinar en vida útil bajo una única condición puede limitar las interpretaciones del papel de un gen en República Dominicana. Por ejemplo, recientemente demostró que daf-7 mutantes tienen una atenuación bidireccional de la respuesta a la concentración de alimento en comparación con el tipo salvaje animales12 (figura 1A). En ausencia de alimentos, daf-7 mutantes muestran un acortamiento de su vida útil en comparación con animales de tipo silvestre. Si sólo habíamos considerado privación dietética, habría interpretado que el gen daf-7 como sea necesario para sólo extensión de vida útil, cuando en realidad el papel de la daf-7 es más complejo. Por lo tanto, el resultado fundamental de esta parte del protocolo es establecer si un gen de interés involucrados en la modulación de la respuesta de vida a los cambios en la abundancia de alimentos.

Una ventaja importante de este protocolo en comparación con otros métodos es que utiliza un novedoso método para eliminar la producción de progenie en los animales sometidos a análisis de vida útil. Mayoría de los estudios usa la droga FuDR para inhibir la proliferación de la línea germinal en adultos hace estéril. Sin embargo, estudios recientes han demostrado FuDR tratamiento puede tener efectos de condición gene-específicas y vida17,18,19,20,21, en cuestionar su aplicabilidad general. En este protocolo, eliminación de la producción de progenie se logra a través de una 24 h tratamiento de animales con RNAi contra el gen del huevo-5 , que inhibe la formación de la cáscara de huevo de quitina de fertilizado C. elegans ovocitos resultantes en su la muerte de22,23. La ventaja de este método es que es muy tarde y así no interferir en la línea germinal, que es un regulador importante de la longevidad en C. elegans.

Una advertencia potencial del protocolo amplia gama DR es su dependencia en el uso de los antibióticos para controlar la proliferación bacteriana para garantizar un control estricto de la concentración bacteriana. Proliferación bacteriana en el intestino del gusano es conocido por ser una de las principales causas de muerte en C. elegans16. Así, el uso de antibióticos bacteriostáticos, como carbenicilina, en agar NGM previene la proliferación bacteriana y aumenta la vida útil de gusanos en comparación con controles no antibiótico16. Ciertos tipos de antibióticos como la rifampicina36 y miembros de la familia37,de tetraciclina38, se ha demostrado para prolongar esperanza de vida en C. elegans independientemente de su efecto sobre bacterias proliferación. Sin embargo, no hay ninguna evidencia en la literatura que carbenicilina o estreptomicina puede aumentar la longevidad independientemente de su efecto sobre la proliferación bacteriana.

Vida útil puede verse como el resultado de un cálculo complejo donde la información ambiental, encaminado por la expresión génica en redes neuronales, se transmite a la fisiología. Nuestro protocolo proporciona una metodología para entender cómo determinados genes afectan este flujo de información ambiental. Para abordar esta cuestión, necesitamos imagen fiable de procesamiento para determinar la distribución de las respuestas de expresión génica a nivel unicelular. Ser capaz de calcular no sólo la respuesta promedio de la expresión génica a cambios en la abundancia de alimentos sino también la distribución completa estadística de grandes poblaciones representa un requisito importante para la aplicabilidad de nuestro método. Esta descripción exacta de las respuestas de expresión génica a la abundancia de alimentos permite la aplicación de la teoría de la información cuantificar la información codificada por las neuronas específicas, así como la estrategia de codificación empleada por el circuito neural.

Los aspectos de imagen y computacionales de los métodos descritos en este protocolo son aplicables a un conjunto mayor de contextos biológicos. En nuestro trabajo, nos centramos en una pequeña red neuronal en alimentos detección, sin embargo, el análisis de las características de procesamiento de la información no se limitan a un tipo de célula específica o señales ambientales específicos. En el futuro, estas metodologías pueden extenderse potencialmente a una mayor variedad de variables de entrada, que afectan a cualquier salida fisiológica. Estos enfoques contribuirá a una mayor comprensión de cómo codificar redes reguladoras del gene, proceso y transmitir información.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a los laboratorios de Bargmann y Horvitz de reactivos. Algunas cepas fueron proporcionadas por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). También agradecemos a M. Lipovsek para comentarios sobre el manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Wellcome Trust (proyecto de subvención 087146 a Q.C.), BBSRC (1/H020500/BB y BB/M00757X/1 a Q.C.), Consejo Europeo de investigación (NeuroAge 242666 a Q.C.), nos institutos nacionales de salud (R01AG035317 y R01GM088333 a H.L.) y Estados Unidos Fundación de ciencia nacional (0954578 a H.L., 0946809 GRFP a M.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

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Genética número 126 restricción dietética proyección de imagen de alto rendimiento teoría de la información neurociencia microfluídica codificación neuronal expresión génica
Cuantificación de la información codificada por el Gene expresión niveles durante la vida útil modulación bajo amplia gama dieta restricción en <em>C. elegans</em>
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Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

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