Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kvantifiering av Information kodas av genen uttryck nivåer under livslängden modulering enligt bred-range kosttillskott begränsning i C. elegans

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56292
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3,4, 2,3,4, 1
1Centre for Developmental Neurobiology, King's College London, 2Interdisciplinary Bioengineering Graduate Program, Georgia Institute of Technology, 3Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 4School of Chemical & Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi en ram för att avse genuttryck och livslängd bred-range dietrestriktioner. Vi beskriver protokoll för bred-range dietrestriktioner och kvantitativ avbildning av genuttryck under detta paradigm. Vi beskriva ytterligare computational analyser för att avslöja underliggande information bearbetning funktioner av genetiska kretsar involverade i mat-sensing.

Abstract

Sensoriska system tillåter djur till upptäcka, behandla och bemöta sin omgivning. Mat överflöd är en miljömässig cue som har djupgående konsekvenser för djurens fysiologi och beteende. Vi visade nyligen att modulering av livslängd i Nematoden Caenorhabditis elegans av mat överflöd är mer komplex än tidigare erkänt. Lyhördheten för livslängden till förändringar i mat-nivå bestäms av specifika gener som fungerar genom att kontrollera informationsbehandling inom en neural krets. Vår ram kombinerar genetiska analyser, hög genomströmning kvantitativa imaging och informationsteori. Här beskriver vi hur dessa tekniker kan användas för att karaktärisera någon gen som har en fysiologisk relevans för bred-range dietrestriktioner. Specifikt, är detta arbetsflöde utformad för att avslöja hur en gen av intresse reglerar livslängd under bred-range dietrestriktioner; sedan att fastställa hur uttrycket av genen varierar med mat nivå. och slutligen att ge en objektiv kvantifiering av mängden information förmedlas av genuttryck om mat överflöd i miljön. När flera gener granskas samtidigt under en neural krets kontext, kan detta arbetsflöde avslöja den kodning strategi anställd av kretsen.

Introduction

Alla organismer behöver för att kunna känna och reagera på förändringar i miljön att säkerställa deras överlevnad. Djur, nervsystemet är den primära detektorn och givaren av information om miljön och samordnar den fysiologiska respons till någon förändring som kan påverka organismens överlevnad1. Mat överflöd är en miljömässig cue som är väl studerat i flera kontexter som inte bara reglerar mat-relaterade beteenden, t ex födosökande2, utan påverkar även livslängden hos ett djur. Moduleringen av livslängden av förändringar i mat överflöd är ett fenomen som kallas dietrestriktioner (DR), och har bred evolutionära bevarande3.

Nematoden Caenorhabditis elegans är en kraftfull modell för grundläggande biologiska frågor. En uppsjö av tekniker har utvecklats som tillåter manipulering av masken genomet, såsom RNAi och i vivo gen redigering tekniker. Den små fysiska storleken på masken och dess optisk transparens lämpar sig också för i vivo imaging av både transkriptionell och translationell fluorescerande reportrar och verktyg av hög genomströmning teknik såsom mikrofluidik4. Tillsammans, kan dessa verktyg utnyttjas för att undersöka hur neurala kretsar direkt djurs beteende.

C. elegans är en bacterivore och flera metoder har publicerats som möjliggör exakt kontroll av mat överflöd genom att manipulera bakteriell koncentration5,6,7,8 . Inom forskarsamhället C. elegans , har DR studerats i två olika sammanhang. Först kan betecknas 'klassiskt DR', eftersom den speglar de förändringar sett svar på fallande mat nivåer i andra organismer. I detta sammanhang fallande mat överflöd från ad libitum nivåer resulterar i en ökande livslängd fram till en optimal nås, efter denna punkt livslängd minskar med ytterligare minskning av mat6,7, 9. Andra samband som DR har undersökts i C. elegans är kosten frihetsberövande som ökas livslängden av maskar med fullständig borttagning av någon bakterie mat källa10,11. I Entchev et al. (2015)12, visade vi att komplexiteten i DR som härrör från dessa två olika paradigm kan prövas samtidigt i en annan kontext vi benämner 'bred-range DR'. Med hjälp av protokollet som beskrivs nedan, vi identifierat en ny klass av gener involverade i DR att dubbelriktat modulera livslängd svaret till mat överflöd och är involverade i neurala kretsar känsla mat12 (figur 1).

Ett djur reagerar på förändringar i miljön integrerar en sekvens av biologiska processer som länkar det sensoriska systemet till komplexa regulatoriska interaktioner förmedla miljöinformation till fysiologi. Trots de mekanistiska detaljerna av sådana ”informationsflödet” är ofta okända, kan genetiska verktyg användas för att förvärva en inblick i hur denna komplexa uträkning är organiserade bland olika biologiska komponenter. I vårt senaste arbete visade vi att daf-7 och tph-1 är inblandade i överföringen av miljöinformation om mat överflöd genom en mat-sensing neural krets som modulerar livslängd i C. elegans12 , 13. genom att tillämpa matematiska ramen för informationsteori14, vi har kunnat kvantifiera mängden miljöinformation, i termer av bits, som representeras av gen uttryck förändringarna i daf-7 och tph-1 i specifika nervceller över olika mat nivåer. Från detta kunde vi sedan avslöja kodning strategin anställd av denna neural krets och hur den styrs genetiskt (figur 2).

I följande protokoll beskriva vi de åtgärder som krävs för att förstå vad effekterna av gener av intresse som uttrycks i särskilda nervceller är och hur de delta till mat informationsflödet från miljö till livslängd. Broady, vårt ramverk är uppdelad i två experimentella protokoll och en computational arbetsflöde. För de experimentella aspekterna, är det viktigt att ha mutanter av generna som kan undersökas under bred-intervall DR. Faithful transkriptionell reportrar är också nödvändigt att kvantifiera nivån uttryck av gener på olika nivåer. För att kunna genomföra den computational analys diskuteras i vår metod, måste datamängden vara av tillräcklig storlek för att ge meningsfull uppskattningar av uttryck-distributioner. Även om vi tillhandahåller mallen källkoder för analyserna, behöver användaren vara förtrogen med språket i informationsteori som används flitigt i hela vår computational ram. Källkoder skrivs i R och C++. Därför krävs också en viss nivå av programmering färdighet att tillämpa dem på ett meningsfullt sätt.

Protocol

1. beredning av bakteriekulturer och plattor för allmänna Worm kultur

  1. bereda 100 mL lysogeny buljong (LB) media i en 250 mL glasflaska och sterilisera i autoklav.
  2. Inokulera flaskan med en enda koloni Escherichia coli stam OP50 och inkubera vid 37 ° C över natten, och sedan lagra kultur vid 4 ° C tills behövs.
  3. Förbereda 5 L sterila nematoder tillväxt medium (NGM) agar 15 och alikvot 12 mL volymer i sterila 6 cm plast petriskålar.
  4. Tillåta ägarn att ställa över natten och sedan förvaras vid 4 ° C tills behövs.
  5. Utsäde NGM plattor minst 3 dagar före användning med 225 μL av kylda OP50 kultur. Lagra plattorna vid 20 ° C tills behövs.

2. Beredning av bakteriekulturer och spädningar för experiment

  1. förbereda två massor av 500 mL LB media i en 2 L Erlenmeyerkolv och sterilisera i autoklav.
  2. Inokulera varje kolv med en enda koloni av OP50 och växa vid 37 ° C skakar på 200 rpm för omkring 14 h.
  3. Komplettera kulturerna med den antibiotikum streptomycin till en slutlig koncentration på 50 μg/mL. Fortsätt skaka för 30 min vid 37 ° C sedan placera kolvar på is för 15 min.
  4. Överföra 450 mL varje kultur i separata sterila centrifug flaskor (helst 500 mL kapacitet flaskor att undvika delning kulturerna). Behålla den överblivna kulturen på is, eftersom den kommer att användas för att bestämma koncentrationen av bakterier.
  5. Snurra ner flaskorna vid 4500 x g i en kyld centrifug vid 4 ° C i 25 min. Kassera supernatanten och lagra flaskorna på ice.
  6. Späd 100 μL av överblivna kultur från varje kolv i 900 μl sterilt LB. Använd 1 ml steril LB till noll spektrofotometern, och sedan bestämma OD 600 av 10-faldig utspädning av varje kultur. Om exempelvis den OD 600 av 10-faldig utspädning av övernattning kulturen är 0,28 då kulturen hade en faktisk OD 600 för 2.8.
  7. Använda en fungerande stamlösning av bakterier av 1,12 x 10 10 OP50 celler/mL, vilket motsvarar en OD 600 56. Därför använder exempel OD 600 för 2.8 från ovan, återsuspendera pelleten från 450 mL kulturen i en 20 th av den ursprungliga volymen, som i detta fall är 22,50 mL. Återsuspendera bakterier med en steril S basala lösning kompletteras med streptomycin till 50 μg/mL (SB + strep).
  8. Återsuspendera pelleten i lämplig volym av steril SB + strep.
  9. Göra alla efterföljande koncentrationer används i experiment från seriespädningar av arbetande beståndet i SB + strep via utspädningsfaktorer som anges i tabell 1.

3. Inställningen upp livslängd experiment

Obs: livslängd analyser utförs på 6 cm behandlade vävnaden kultur fylld med 12 mL av NGM agar kompletterad med streptomycin och carbenicillin (NSC), båda med en slutlig koncentration på 50 μg/mL. Dessa vävnadsodling plåtar är väl lämpade för livslängd analyser på nr eller mycket låg bakterie koncentrationer, som maskar är betydligt mindre benägna att hålla sig till väggen i plattan och desiccating. Användning av två olika antibiotika förhindrar OP50 stammen utveckla läkemedelsresistens, vilket är avgörande i att kontrollera bakteriell koncentrationen på plattan. Också, genom inactivating bakterierna med antibiotika, vi minimera effekterna på masken livslängd på grund av patogena infektion 16. Detta tillåter oss att betrakta endast de livsmedelsrelaterade komponenterna av bakteriell koncentration i dessa experiment. Många C. elegans åldrande studier komplettera NGM plattor med kemiska fluoro-2 ′-deoxiuridin (FUdR) för att återge vuxna sterila. Men kan användningen av FUdR vara problematiskt eftersom dess användning kan orsaka flera förbryllande problem med livslängden analyser 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al. (2015) 12 kringgått problemet genom exponering av L4 larver till RNAi ägg-5 22 , 23, som hämmar den äggcell-till-embryo övergången genom att blockera bildandet av äggskalet av befruktade C. elegans oocyter som resulterar i döden.

  1. Kultur i C. elegans stammar som kommer att analyseras på seedade NGM plattorna vid 20 ° C. tillåta plattorna att svälta ut så att alla djur är odlade på ett enhetligt sätt och att potentiellt konto transgenerationell effekter av utvecklingsmässiga förutsättningar.
  2. Överföring svultit L1 larver till nya seedade NGM plattor genom att skära ut en liten bit av agar (5 x 5 mm) från utsvultna plattan med en steril skalpell och att placera den nere på en ny platta, en process som kallas ' spaltning ' av den C. elegans forskning comm Unity 15. Växer maskarna tills de når L4 scenen. Fem L4 larver per stam sedan överförs till enskilda seedade NGM plattor och hålls vid 20 ° C. Dessa djur representerar den P0 generationen.
  3. Användning L4 avkomma av P0 generationen att ställa in F1-generationen. Individuellt placera F1 L4 larver av vildtyp N2 stammen vidare till 30 seedade NGM plattor.
    Obs: För mutant stammar, antalet plattor som krävs beror på deras tillväxttakt. Exempelvis genomgå daf-7(ok3125) djur en övergående dauer gripande vid 20 ° C. Således, denna stam producerar mindre L4 larver än en tallrik med N2 vildtyp maskar.
  4. För att kompensera för denna skillnad, Ställ in daf-7(ok3125) plattor upp en dag tidigare än N2 plattor och på ett större antal, är ett bra fungerande förhållande 3:1.
  5. Överföring synkroniseras L4-scenen avkomma av F1 föräldrarna till NGM plattor kompletteras med 1 mM IPTG och 50 µg/mL carbenicillin (RNAi pläterar) som var seedad med 225 µL av HT115 bakterier uttrycker dsRNA inriktning ägg-5 genen och höll på 20 ° C under 24 h. Minst 360 maskar per stam, hålls på en densitet på 15 djur per platta, behövs per experiment.
  6. Efter den ägg-5 RNAi behandling, överföra maskar till NSC plattor som ympats med 225 µL av den streptomycin-behandlade OP50 vid en koncentration på 2 x 10 9 celler/mL (tabell 1) för ytterligare 24 timmar vid 20 ° C. För att undvika skador på maskar under detta och alla efterföljande överföringar, försiktigt scoop djur från undersidan av masken med en mycket tunn försiktigt böjd mask plocka. Float djuren utanför masken plocka genom nedsänkning i en 10 µL droplet SB + strep placeras på ytan av den nya plattan.
  7. Nästa dag, omfördela maskar till NSC plattor som representerar var och en av mat nivåer lfunnits i tabell 1 samt en uppsättning av NSC plattor som innehåller inga bakterier. Seed alla NSC plattor med 225 µL av relevanta koncentrationen av bakterier, och utsäde bakteriefria NSC plattorna med 225 µL SB + strep. Upprätthålla maskar med en täthet på 15 djur per platta, vilket resulterar i minst fyra plattor per mat tillstånd per stam. Skifta plattorna till önskad experimentella temperatur.
  8. Överföring maskar till färska NSC plattor som ympats med lämplig mat koncentration enligt det schema som anges i tabell 2.
  9. Poäng djur för förflyttning av försiktigt petade med en tråd plocka. Underlåtenhet att svara poängsätts som döden. Poäng djur för död vid varje överföring punkt och sedan dagligen efter sista överföringspunkten.

4. Inställningen upp Imaging experiment

Obs: stegen i detta avsnitt är tillräckliga för att generera tillräckligt maskar per stam för imaging en experimentell mat tillstånd vid en given temperatur. Detta protokoll kan skalas för att passa antalet villkor som ska avbildas på en given dag. Dock bör försiktighet iakttas vid experimentell design att säkerställa att tidsramen är rimlig och att djur över olika stammar inte har en åldersskillnad som är större än 12 timmar på dagen för imaging. Det rekommenderas starkt att transkriptionell reportrar som avbildas är singel-kopia transgenics, eftersom detta kommer mer liknar infödda regleringen av genen. Protokollet beskrivs nedan och sammanfattas i tabell 3, ger också en smidig metod för att erhålla stora synkrona ålder matchade populationer av stammar, som kan användas för andra experimentella arbetsflöden.

  1. Kultur djur i imaging experiment på 10 cm behandlade vävnadsodling plattor som möjliggör en större täthet av avmaskar (∼ 100 djur per platta) än livslängd analyser.
  2. Fyller 10 cm plattorna med 30 mL av NGM agarplattor och utsäde med fem 225 µL portioner av kylda OP50 kultur i en cross-liknande formation.

5. Inledande kultur av Reporter stammar

  1. kultur i C. elegans stammar som kommer att analyseras på seedade NGM plattorna vid 20 ° C. tillåta plattorna att svälta ut så att alla djur är odlade på ett enhetligt sätt och att potentiellt konto för någon transgenerationell effekterna av utvecklingstoxicitet villkor.
  2. Chunk de utsvultna L1 larver till seedade NGM plattor och växa tills de når L4 scenen. Överföra tre L4 larver per stam till två seedade NGM plattor vid 20 ° C. Dessa djur representerar den P0 generationen.
  3. Använd L4 avkomman av P0 generationen för att ställa in F1-generationen. Placera F1 L4 larver av vildtyp reporter stammen vidare till 4-seedade NGM tallrikar. För mutant stammar beror antalet plattor som krävs på deras tillväxttakt. I det tidigare exemplet av daf-7(ok3125), reporter stammar i denna bakgrund kräver tre gånger registreringsskyltarna och behöver sättas upp två dagar innan de vildtyp reporter stammarna, att ta hänsyn till skillnader i tillväxttakt.

6. Insamling av ägg och synkronisering av Reporter stammar

Obs: vissa gener av intresse i forskarvärlden C. elegans åldrande leda till tillväxt och äggläggningen defekter när muterade, vilket gör det svårare att generera stora synkrona populationer av djur av olika genotyper. Daf-7(ok3125) mutationen orsakar exempelvis en svår äggläggningen defekt i jämförelse med den vilda typen N2 stam. Därför, för att få tillräcklig nummer av synkron L4 larver av olika stammar för kvantitativa imaging experiment kräver en mer robust metod än manuellt plocka maskar. Av denna anledning transkriptionell reporter stammar utsattes för en natriumhypoklorit (NaClO) / natriumhydroxid (NaOH) lösning behandling av dräktig vuxna att bryta öppna djuren och befria sina ägg, en process som ofta kallas ' blekning ' av den C. elegans forskning gemenskapen 15.

  1. Konto för skillnaderna i tillväxt mellan stammar och beräkna när plattor av varje stam bör skördas och blekt. Ett exempel på när vildtyp och daf-7(ok3125) reporter stammar är blekt se tabell 3.
  2. Seriellt tvätta maskar av en viss stam av plattorna, lämplig dag, med 15 mL SB och samla i en steril 15 mL tub. Att djuren till naturligt sediment och justera sedan volymen av vätska 7 ml.
  3. Tillsätt 2 mL 5% NaClO och 1 mL 5 M NaOH till röret som innehåller de dräktiga vuxna. Skaka blandningen i rumstemperatur i mer än 3 min. NaClO kommer att döda bakterier och maskar, medan NaOH orsakar maskar att bryta isär släppa alla befruktade ägg som de innehåller i vätskan. Chitinen äggskal runt embryona skyddar dem från effekterna av behandlingen, så länge exponeringstiden är relativt kort. Efter 3 minuters inkubering, vortex röret för ~ 30 s för att underlätta ytterligare upplösning av masken slaktkroppar.
  4. Efter 3 minuters inkubation spin ner blandningen vid 1 000 x g för 1 min till pellet äggen. Aspirera bort de flesta av supernatanten med sterilt glas pipett ansluten till en termoskanna, lämnar ~0.5 mL i varje rör, så att inte störa äggen.
  5. Återsuspendera pelleten med 9,5 mL SB och sedan upprepa den centrifugeringssteget och resuspension steg ytterligare två gånger så att äggen har tvättats med SB totalt tre gånger.
  6. Efter finalen tvätta, pellet äggen genom centrifugering och sedan kasta alla utom 0,5 mL av supernatanten. Återsuspendera äggen i de återstående 0,5 mL av SB och sedan alikvotens 100 µL vidare till tre 10 cm urkärnad NGM plattor. Fördela den 100 µL lika över alla fem bakteriell gräsmattor på varje tallrik. För vildtyp stammar, bör ägg inte deponeras vid tätheter större än 200 per platta.
    1. Hålla plattorna vid 20 ° C för 48 h och för att få en mycket homogen befolkning av L4 larver. För stammar med fördröjd tillväxt fenotyper är det lämpligt att deponera så många ägg som tillgänglig och öka inkubationstiden. Till exempel behåller daf-7(ok3125)-innehållande reporter stammar vid 20 ° C för ~ 64 h att låta Äggen kläcks och nå L4 scenen.

7. Behandling av Reporter stammar med ägg-5 RNAi

  1. seriellt tvätta maskar av tre plattorna med 15 mL SB och samlar vätskan i en steril 15 ml tub. Tillåta L4 larverna till naturligt sediment, och sedan aspirera alla utom ~0.5 mL av vätskan. I det vilda type reporter stammar, detta steg tar bort eventuella larver som är yngre än L4. I mutant bakgrunder, detta steg underlättar avlägsnandet av alla arresterade larver såsom dauers vid daf-7(ok3125).
  2. Resuspendera maskar med 9 mL av SB. Igen, övervaka sänkningsreaktion larvaena L4 och sedan aspirera alla utom ~0.5 mL av supernatanten när de flesta av larvaena L4 har pelleterat. Upprepa proceduren en gång till. Sedan aspirera alla utom ~0.5 mL av vätskan när majoriteten av L4 larver har fast.
  3. Lägg till 10 µL sterilt s basala kompletteras med 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) till vätskan som innehåller larvaena L4. Detta fungerar som ett ytaktivt ämne och förhindrar larverna fastnar till den inre ytan av plast pipettspetsar.
    1. Försiktigt Omsuspendera larver med en P200 låg retention pipettspetsen och sedan alikvotens 150 µL till tre 10 cm RNAi plattor som är seedade med 5 x 225 µL av ägg-5 RNAi bakterier. Säkerställa att maskar är lika fördelad över alla fem bakteriell gräsmattor.
  4. När vätskan har absorberas ägarn, ta bort alla icke-L4 larver från plattorna som inte avlägsnades genom förfarandet för tvätt av manuellt plocka dem bort. Förvara sedan plattorna vid 20 ° C under 24 h.

8. Inledande av bred-range DR

Obs: efter den 24 h ägg-5 RNAi behandling, L4 larverna som ursprungligen sattes in på plattorna kommer att ha blivit 1 - dag-gammal vuxna.

  1. Plocka bort alla unga larver som undgått det tidigare manuell borttagning steget bort i detta skede, lämnar endast de 1 - dag-gammal vuxna på plattorna.
  2. För varje stam, tvätta de 1 dag gammala vuxna från de tre plattorna med 15 mL steril SB + strep i en 15 mL tub. Tillåta maskar till naturligt sediment, och sedan aspirera alla utom 0,5 mL av supernatanten. Återsuspendera maskar med 9,5 mL SB + strep och upprepa sedimentering och tvätta stegen.
  3. Efter finalen tvätta, tillåta maskar till sediment och sedan aspirera alla utom 0,5 mL av supernatanten. Lägg till 10 µL SB + Plu och försiktigt Omsuspendera larverna med hjälp av en P200 pipettspetsen och sedan alikvotens 100 µL på en NSC plattan seedade med 5 x 225 µL bakterier vid en koncentration 2 x 10 9 celler/mL.
    1. Fördela 100 µL jämnt över alla fem bakteriell gräsmattor. Under ett Mikroskop uppskatta antalet djur som finns på plattan: målet är att ha mellan 100-150 maskar på tallriken.
    2. Bestäm volymen av vätska som krävs för att uppnå en mask densitet inom detta intervall och sedan alikvot på två ytterligare plattor. Justera antalet maskar på första plattan också falla i detta intervall och sedan lagra plattorna vid 20 ° C under 24 h.
  4. Nästa dag, samla de 2 dagar gamla vuxna och distribuera till nya NSC plattor som ympats med önskad experimentella koncentration av livsmedel (tabell 1), återanvända de metoder som beskrivs i steg 2 och 3. När vätskan absorberas ägarn, skifta plattorna till önskad experimentell temperatur för 24 h.
  5. Nästa dag, samla de 3 dagar gamla vuxna och distribuera till färska NSC plattor som ympats med samma experimentella koncentrationen av mat, återanvända de metoder som anges i steg 8.3 och 8.4. När vätskan absorberas ägarn, tillbaka plåtarna till den experimentella temperaturen för 48 h.
  6. Samla 5 dagar gamla vuxna och distribuera till färska NSC plattor som ympats med samma experimentella koncentrationen av mat, återanvända de metoder som anges i steg 8.3 och 8.4. När vätskan absorberas ägarn, tillbaka plåtarna till den experimentella temperaturen för 24 h.

9. Mikroflödessystem Imaging av Reporter stammar

  1. på dag 6 av vuxenlivet, bild djur använder en anpassad mikroflödessystem plattform 24 , 25. Fysiskt plocka bort djur från de tre plattorna och suspendera i en 5 mL kryogen slang som innehåller 4,5 mL av SB + strep.
    1. En gång maskar sediment, sug ut alla utom ~0.5 mL av supernatanten och återsuspendera djuren i 4 mL SB + strep. Denna wash avlägsnar överflödig bakterier som annars kan störa imaging. Maskarna införs i en anpassad mikroflödessystem enhet via trycket driven flöde 24 , 25. Inom enheten, enskilda maskar är riktade till och instängd i en tänkbar kanal gated med tryck-driven på chip ventiler 26 under kontroll av anpassad programvara.
  2. När en mask är fångade headfirst i imaging kanalen, samla en fluorescerande z-stack, med 50 sektioner i 2 µm-steg, med en standard epifluorescensmikroskop med en 40 X olja mål (1.3 NA) och en kamera. Samla röd och grön fluorescerande bilder för varje transkriptionell reportrar samtidigt använder en utsläpp-splitter och lagras för analys. Bild förvärv är automatiserad använder anpassade programvara.
  3. Bearbeta bilden automatiskt med hjälp av anpassade MATLAB skript 27 (finns på https://github.com/meizhan/SVMelegans). Z-stackarna är laddad i MATLAB och analyseras för att identifiera neuron-par och deras platser inom imaging planet. De maximala prognoserna beräknas sedan och ett tröskelvärde algoritm används för att lokalisera enskilda fluorescerande celler. Cell identifiering beräknas sedan utifrån relativa avstånd och platser inom masken ' s huvud.
  4. Att kvantifiera reporter fluorescens, extrahera den tredimensionella volymen runt varje cellulära läge från z-stacken. Integrera intensitet över ett konsekvent antal ljusaste pixlarna, som fullt kapsla hela cellen i alla fall.
  5. Att eliminera störningar från experimentella villkor-specifika eller stamspecifika förändringar i tarmen auto-fluorescensen av varje djur, beräkna bakgrund intensiteten för de cellen par närmaste tarmen (ADF och ASI) via uppskattning av funktionsläget av den intensitet distribution i en volym runt neuron. Subtrahera bakgrunden intensitetsvärdet från den integrera fluorescensen att erhålla slutresultatet.

10. Data församling

Obs: fluorescens stödnivåerna alla neuroner analyseras av bildbehandling programvara kombineras till filtrerade uttryck datafilen (FED) som används för att uppskatta fördelningen profiler av gen uttryck (mall R och C++ skript finns på https://github.com/giovannidiana/templates).

  1. Manuellt kontrollera varje bearbetade bilden att bekräfta korrekt identifiering för alla celler. Bilder med felaktig cell identifiering måste registreras i en utslagning-fil. I Diana et al. (2017) 13 filen uteslutande består av ett binärt bord med ' 0 ' för rätta och ' 1 ' för felaktiga cell identifiering. Antalet rader i tabellen är lika med antalet maskar avbildas med en kolumn för varje cell som avbildas (i.e ASI, ADF och NSM).
  2. Generera FED filen:
    1. Kör bash skript " gen_data + tid " att generera-specifika filer att kombinera de uttrycksvärden som erhålls från varje mask som avbildas filtreras med hjälp av utslagning fil. För varje mapp som genereras av bildbehandling programvara, läser det bash-scriptet filen anteckning < folderprefix > _EXP.txt till extraktet de experimentella förhållandena och utslagning filen < folderprefix > _X.csv att välja endast korrekt identifierade nervceller. Uttryckets värden läses från filer < folderprefix > _data_ < neuron > .csv.
    2. Sammanfoga alla filer i " FED_split.dat " och sortera det batch experimentkoden, mask etikett och cell identitet.
    3. Kör " sortera " (C++-program, användning:. / sortera FED_split.dat FED_merged.dat) att välja poster med noll fluorescens för varje cell och kombinera dem till enstaka rader i FED_merged.dat.

11. Uppskattning av Information kodad

Obs: I följande procedur beskrivs hur man kvantifiera information om särskilda miljövillkor som kodas av uppsättningen genuttryck. I Diana o.a. (2017) 13, informationen kodas om mat överflöd i miljön undersöktes, men själva metoden är tillämplig på någon diskret antal miljömässiga stater. Den grundläggande ingrediensen för att kvantifiera information teoretiska variabler såsom information entropies eller redundans är joint sannolikhetsfördelningen av neurala Svaren under de inställda stimuli från omgivningen ansåg. För att utföra sådan uppskattning, är det viktigt att ha ett tillräckligt urval av svaret hela populationer av maskar. Gaussiska fördelningar kan uppskattas från relativt små prover; Det är dock viktigt att ha en idé om förväntade formen Fördelningens uttryck att kvantifiera lämpliga urvalsstorleken för en pålitlig täthet uppskattning. På grund av oundvikliga variationer över olika prövningar, det är viktigt att kontrollera att de centrala värderingar av de distributioner som erhålls från olika repetitioner av samma experiment inte systematiskt skiftas eller att någon av de statistiska funktionerna i den uttryck distribution är inte signifikant över prövningar. Rättegång-till-rättegång variabiliteten är kompatibel med variabiliteten inom varje prövning, är det viktigt att balansera antalet prövningar jämfört med antalet maskar inom prövningar i genomsnitt ut dessa miljömässiga och biologiska faktorer som påverkar rättegång-till-rättegång variabilitet. Undersampling dessa faktorer kunde tungt bias information-teoretiska analys.

  1. Som the R skript " code3D.R " ger en mall för att skapa tredimensionella tätheter baserat på filen " FED_merged.dat ", ändra denna mall enligt det särskilda formatet som FED sidhuvud. Listan " HeaderNames " representerar namnen på varje fält i filen FED samtidigt " RONames " är en lista över avläsning. Skriptet använder R paketet ' ks ' 28 , 29 att uppskatta multivariat fördelningen inom ett hypercubic rutnät med GS lagerplatser i varje dimension underindela spänna mellan minimum och maximum värdena i datamängden för varje avläsning. När variabeln interna " gruppen " är satt till 0 alla data används för densitet uppskattning. När den " gruppen " etikett är mellan 1 till 5 datamängden är indelad i 5 osammanhängande uppsättningar, och uttrycket tätheterna beräknas från 80% av de uppgifter som härrör från uteslutandet av en av de fem uppsättningarna. Denna funktion används senare att uppskatta osäkerheter.
    Obs: Användning av code3D.R: Rscript code3D.R < GT > < mat > < GS > < outfolder > < etikett > < gruppen > < frac > där GT representerar genotypen, mat är det miljö-villkoret, outfolder är den existerande mapp där distributionerna kommer att lagras, etikett är en filnamnsprefix och frac är del av datamängden används.
  2. För varje miljö-villkora generera de multivariata distributionerna med olika rutnät storlekar GS (e.g. 20,30,40 lagerplatser). För att minska computational belastning, är mindre värden för GS att föredra när finare resolutioner inte ändra signifikant information uppskattning. Genuttryck distribution skrivs i mappen < outfolder > anges när du kör code3D.R som enstaka kolumn textfiler med filnamn struktur < etikett > _ < GT > _ < mat > _GS < GS > _group < grupp >. dat.
    Obs: föregående steg ge uppskattningen av de villkorliga sannolikhetsfördelningar Equation 1 där g betecknar vektorn av alla Läs-outs och f är det miljö-villkoret. Dock att beräkna den ömsesidig informationen mellan genuttryck och den miljö 30 , 31.
    Equation 2
    vi måste fördelningen av ingående Equation 3 som också avgör den (input) i genomsnitt genuttryck < img alt = ”ekvation 4” src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg” / >. När ingående fördelningen inte är direkt tillgängliga, en meningsfull kvantitet att karakterisera kodning funktioner är kanal kapaciteten, som kan erhållas genom att maximera den ömsesidig informationen över alla möjliga input distributioner.
  3. Med hjälp av genuttryck distribution, tillämpa Arimoto-Blahut 32 algoritmen att uppskatta fördelningen av den miljömässiga ingång som maximerar information och systemet kanal kapacitet. Ett exempel på implementation av algoritmen kan hittas i C++ program " Ccap3D.cpp " för det tredimensionella genuttrycket analyseras kod i Diana et al. (2017) 13. Exempel: om utdelningar från genotyp GT123 erhålls från de 80% av data (grupp 3) med stödrastrets storlek lika 30 och lagras i mappen ". /pdf/ " med en prefixet etikett = " PDF ". Kommandot för att beräkna den information kodad i GT123 bakgrunden är. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
    Obs: uppskattning av informationen kodas av systemet påverkas av flera källor till osäkerhet, inklusive valet av densitet uppskattning algoritm och prov storlek bias. Steg 11,1-11,2 bör upprepas med olika densitet uppskattningsmetoder för att utvärdera storleken på systematiska bias infördes genom varje algoritm.
  4. Att uppskatta osäkerheten på grund av urvalsstorlek, omberäkna information från steg 11,1-11,2 med grupper mellan 1 till 5. Variationen i dessa fem oberoende provtagningar av 80% av data kommer att återspegla effekten av stickprovsstorlek på information uppskattning.
  5. Beräkna information hjälp steg 11,1-11,2 över ökande bråkdel av data (som i steg 5) att korrigera för urvalsstorlek bias (Jack-knife metod) 33.

12. Beräkning av redundans, buller och Signal korrelation

  1. Använd den optimala ingående distributioner erhållits från uppskattningen av den maximala informationen för att beräkna den ömsesidig informationen Equation 5 mellan input och gen uttryck svar av varje neuron N. C++ källfilen " GetMI1D.c " är prov program att få marginell ömsesidig information från de gemensamma sannolikhetsfördelningar.
  2. Beräkna redundans genom att ta summan av den ömsesidiga informationen för varje neuron som erhållits ovan och subtrahera sedan kanal kapacitet.
  3. Beräkna den " shuffle " informationen benämner Equation 6 13 , 34. En mall C++ källfilen kan hittas i " GetShuffle.c ".
  4. Användning av " shuffle " term för att beräkna signal och brus korrelation. För att signal samband vi har Equation 7 och för buller korrelationen har vi Equation 8.
  5. Osäkerhet på redundans, få buller och signal samband när det gäller den totala informationen (steg 11.3 i föregående avsnitt) från flera provtagningar av de 80% av data och tar standardavvikelsen.

Representative Results

Av utför livslängd experiment på mutanter av generna sevärdheter tillsammans med den vilda typen N2 stam, kan man fastställa om dessa gener har en roll i bred-range DR mat svar. Vildtyp svaret bör vara jämförbar med den som avbildas i figur 1A. Någon modulering av detta svar av mutanter, reflekteras av en icke-enhetlig effekt över mat villkor, anger att dessa gener påverkar masken förmåga att korrekt besvara ändringar i mat överflöd, vid vilken punkt ytterligare utredning av den uttryck Svaren av dessa gener till bred-range DR är befogad. Om livslängd svaret av mutanter inte är dock signifikant från den vilda typen då generna har ingen roll i transducing effekterna av bred-range DR, åtminstone på nivån för genomsnittlig livslängd. Om mutationer orsakar en enhetlig förskjutning av hela livslängd svaret då har generna en mat-oberoende effekt på livslängden. Detta utesluter inte möjligheten att uttrycket av gener av intresse är mat-lyhörda, i vilket fall informationen som bärs av dessa gener inte överförs till livslängd.

Nästa steg i protokollet är att bestämma hur uttrycket nivåer förändras under bred-range DR för generna av intresse. I figur 1Billustrera vi detta genom uttrycket nivåer av transkriptionell reporter av daf-7, som visar ett svar på förändringar i mat-nivå i ASI sensoriska nervceller. I en daf-7(-) mutant ändras uttrycket svaret av transkriptionell reporter. Om generna av intresse verkligen mat-svarar på nivån för livslängden då kan man förvänta sig att deras uttryck ändras också med mat. På motsvarande sätt bör transkriptionell reporter i mutant bakgrunden har en förändrad uttryck-profil som svar på bred-range DR. Det är dock också möjligt att transkriptionell reportern av genen av intresse i en vildtyp bakgrund inte visar ändringar mat-lyhörd i uttryck. I den här situationen kan det indikera en post-transcriptional reglerande effekt som faller utanför tillämpningsområdet för detta protokoll.

I Diana et al. (2017)13, extraherades uttryckets värden för daf-7 i ASI och tph-1 i ADF och NSM. I figur 2Aillustrerar vi uppskattning av uttrycket distributionen i ASI samt ADF för ett visst livsmedel. Att ha flera utläsningar från enda mask bilder tillåter oss att analysera inte bara mängden information kodad självständigt av varje neuron men också den kombinatoriska informationen av hela neural krets (figur 2B-2 C). Att kombinera dessa två information-teoretiska åtgärder tillåter oss att karakterisera systemet när det gäller kodning strategin anställd av nervceller för att förmedla information om mat. Redundansen i kretsen kan erhållas genom att ta summan av den ömsesidiga informationen för varje neuron och subtrahera den gemensamma ömsesidiga information (kanal kapacitet) som erhålls genom att betrakta kombinatoriska avläsning av kretsen. Ett positivt värde av sådan skillnad betecknar en redundant karaktär av kodning strategi eftersom den samlade informationen bland delarna är större än den faktiska informationen kodas av hela kretsen. Omvänt återspeglar ett negativt värde en synergistisk strategi eftersom den sann information kodad är större än summan av dess delar (figur 2B). Information och redundans kan jämföras över olika genotyper att utforska möjliga högre ordning roller av genreglering, exempelvis i Diana o.a. (2017) 13 effekten av daf-7 mutation växlar kodning strategin från redundanta till synergistisk (figur 2C-2D).

Figure 1
Figur 1 : Svar av livslängd och gen uttryck under bred-range DR. (A) Genomsnittligt livslängden av wild typ N2 stam (svart linje) visar en komplex reaktion på bred-range DR. Omfattningen av detta svar är försvagade i en null mutant av daf-7 genen (röda linjen). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet, poolade data från Entchev et al. (2015) 12. (B) Genomsnittligt uttrycksnivåerna för transkriptionell reporter för daf-7 genen i vildtyp bakgrunden (svart linje) också visa komplexa icke-monoton svar på bred-range DR. I daf-7(-) genetiska bakgrunden uttryck för denna transkriptionell reporter är mycket försvagade och visar lite svar på förändringar i mat-nivå. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet, data från en enskild prövning i Entchev et al. (2015) 12. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Tillämpad metodik. (A) Illustration av tvådimensionella densitet uppskattning av tph-1 uttryck i ADF och daf-7 uttryck i ASI som erhållits från 'ks' R-paketet med hjälp av ett rutnät dimensionen 30 x 30. (B) visualisering av informationen kodas av gemensamma uttryck för tph-1 och daf-7 (hela) och individuellt (summan av delar) för ADF, ASI och NSM nervceller. Redundant och synergistisk tecken av kodning representeras av skillnaden mellan höjden av staplade staplarna till höger och den information som kodas av hela kretsen. (C) jämförelse mellan livsmedelsinformation som kodas av vildtyp djur och daf-7(-) mutanter. (D), minskning av ömsesidig information hos mutanter åtföljs av en switch mot synergistisk kodning. Paneler B-D är anpassade från Diana o.a. (2017) 13. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Bakteriella koncentration (celler/ml) Optisk densitet (600nm) Utspädningsfaktor (från tidigare)
1.12E + 10 56.000 0.00
2.00E + 09 10.000 5,60
6.32E + 08 3.160 3.16
6.32E + 07 0,316 10,00
2.00E + 07 0,100 3.16
0 (S basal) 0.000 NA

Tabell 1: mat nivåer och utspädningsfaktorer som används i bred-range DR. Bakterierl koncentrationer (celler/mL) används i bred-range DR protokollet, tillsammans med deras respektive OD600 mätningar och utspädningsfaktorn krävs för att uppnå varje koncentration från den föregående.

Experimentell temperatur av livslängd
Dag 12,5 ° C 15° C 17,5 ° C 20° C 22,5 ° C 25° C 27,5 ° C
-12 Chunk alla stammar till färska NGM plattor och upprätthålla vid 20° C
-11
-10 Ställa in P0 generation av daf-7(-) stammar och underhålla vid 20° C (1 L4 per platta, 5 plattor)
-9 Ställa in P0 generation av vildtyp stammar och underhålla vid 20° C (1 L4 per platta, 5 plattor)
-8
-7
-6
-5 Ställa in F1-generationen av daf-7(-) stammar och underhålla vid 20° C (1 L4 per platta, 90 plattor)
-4 Ställa in F1-generationen av vildtyp stammar och underhålla vid 20° C (1 L4 per platta, 30 plattor)
-3
-2
-1
0 Plocka F2 L4 larver till > ägg-5 RNAi plattor och underhålla vid 20° C (15 L4 per platta, 24 tallrikar)
1 Flytta 1 - dag-gammal vuxna till NSC plattor som ympats med 2.0E + 9 celler/ml mat nivå och upprätthålla vid 20 ° C
2 Flytta 2 - dag-gammal vuxna NSC plattor som ympats med experimentell mat villkor och experimentella temperatur
3 Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring
4
5 Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring
6
7 Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring
8
9 Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring
10
11 Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring Överföring
12
13
14 Överföring Överföring Överföring Överföring
15
16
17
18 Överföring Överföring
19
20
21
22 Överföring

Tabell 2: schema för livslängder bedrivs vid olika temperaturer. Schematisk översikt över de steg som behövs för att ställa in bred-range DR livslängd experiment vid olika temperaturer med daf-7(-) och vildtyp stammar som exempel. Antalet överföringar till färska plattor av varje experimentell mat nivå minskar med ökande temperatur. Detta är att redogöra för det faktum att djur vid högre temperaturer åldras snabbare och så en mer benägna att fysiska skador per överföring.

Dagar IMA
Ging Pipeline -14 Chunk reporter stammar i daf(-) bakgrund. Underhåll vid 20 ° C. -13 Chunk reporter stammar i vildtyp bakgrunden. Underhåll vid 20 ° C. -12 Ställa in P0 generation av daf-7(-) reporter stammar. Använd 3 L4 larver per 10cm NGM platta. Använda 2 plattor och underhålla vid 20 ° C. -11 -10 Ställa in P0 generation av vildtyp reporter stammar. Använd 3 L4 larver per 10cm NGM platta. Använda 2 plattor och underhålla vid 20 ° C. -9 -8 Ställa in F1-generationen av daf-7(-) reporter stammar. Använd 3 L4 larver per 10cm NGM platta. Använda 12 tallrikar och underhålla vid 20 ° C. -7 -6 Ställa in F1-generationen av vildtyp reporter stammar. Använd 3 L4 larver per 10cm NGM platta. Använda 4 tallrikar och underhålla vid 20 ° C. -5 -4 -3 Bleach daf-7(-) reporter stammar i eftermiddag (~ 5 pm) och deponera äggen på 3 10cm NGM tallrikar och underhålla vid 20 ° C. -2 Blekmedel vildtyp reporter stammar i morgon (~ 10 am) och insättning ägg på 3 10 cm NGM plattor och underhålla vid 20 ° C. -1 0 Tvätta L4 till 10 cm ägg-5 RNAi plattor. Använda 3 plattor per stam och underhålla vid 20 ° C. 1 Tvätta 1 dag vuxna till NSC plattor som ympats med 2.0E + 9 celler / ml. använda 3 plattor per stam och underhålla vid 20 ° C. 2 Tvätta 2 dag vuxna till NSC plattor seedade med experimentell mat nivåer. Använd 3 plattor per stam och Skift till experimentella temperatur. 3 Överföra till färska NSC plattor. Använda 3 plattor per stam och underhålla vid experimentell temperatur. 4 5 Överföra till färska NSC plattor. Använda 3 plattor per stam och underhålla vid experimentell temperatur. 6 Välj djur av plattor och förbereda för avbildning.

Tabell 3: schema för imaging pipeline. Schematisk översikt över de steg som behövs för att ställa in bred-range DR imaging experiment med fluorescerande transkriptionell reporter stammar i daf-7(-) och vildtyp bakgrunder vid olika temperaturer som exempel.

Discussion

Här presenterar vi en ny metod för dietrestriktioner som kapslar in ett mycket bredare utbud av mat koncentrationer än tidigare publicerade protokoll. Denna metod länkar två tidigare separata fenomen sett i C. elegans DR litteratur, bakteriell deprivation och klassiskt dietrestriktioner, tillåter både kosten effekter vara studerade under ett protokoll. Med den nya breda utbud DR paradigmen, presenterar vi en allmän ram för att undersöka enstaka cell genuttryck som svar på en specifik miljö cue och avgöra hur denna cell kodar information. Vår ram består av två experimentella protokoll som illustrerar hur du utför livslängder och kvantitativa imaging, respektive, enligt bred-range Dr Data från dessa experimentella protokoll kan sedan granskas med computational analyser i denna ram att kvantifiera den information kodad av förändringar i genen uttrycksnivåerna eller livslängder över olika mat villkor.

Livslängd experiment med bred-range DR paradigm involverar sex distinkta mat nivåer (tabell 1). Detta kräver en mer arbetsintensiva metod än att undersöka livslängd under färre mat nivåer, till exempel kosten deprivation10,11 eller använda de äter-2 genetiska bakgrund35. Att pröva på livslängd under ett enda villkor kan dock begränsa tolkningar av en genens roll i DR. Till exempel, visade vi nyligen att daf-7 mutanter har en dubbelriktad dämpning av svar till mat koncentration jämfört med vildtyp djur12 (figur 1A). I avsaknad av mat visas daf-7 mutanter en förkortning av sin livslängd jämfört med vildtyp djur. Om vi hade bara tänkt kosten deprivation, vi skulle ha tolkat som daf-7 genen som nödvändigt för bara livslängd förlängning, när i själva verket daf-7 roll är mer komplex. Kritiska resultatet av denna del av protokollet är därför att fastställa huruvida en gen av intresse är involverad i modulerande livslängd samlade respons på förändringar i mat överflöd.

En stor fördel med detta protokoll jämfört med andra metoder är att den använder en ny metod för att eliminera avkomma produktion i djur som genomgår livslängd analys. De flesta studier använda drogen FuDR för att hämma spridningen av könsceller hos vuxna gör dem sterila. Senare studier har dock visat FuDR behandling kan ha tillstånd - och gen-specifika effekter på livslängd17,18,19,20,21, ringa in fråga dess allmänna tillämplighet. I detta protokoll, eliminering av avkomman produktion uppnås genom en 24 h behandling av djur med RNAi inriktning genen ägg-5 , som hämmar bildandet av de kitin äggskalet av befruktade C. elegans oocyter vilket resulterar i deras död22,23. Fördelen med denna metod är att det är mycket sent verkande och så stör inte de könsceller, som är en viktig regulator av livslängd i C. elegans.

En potentiell varning i bred-range DR protokollet är dess beroende av användningen av antibiotika att styra bakteriell spridning för att säkerställa strikt kontroll av bakteriell koncentration. Bakteriell spridning i tarmen av masken är kända för att vara en viktig orsak till dödsfall i C. elegans16. Således, användning av bakteriostatiska antibiotika, såsom carbenicillin, i NGM agar förhindrar bakteriell spridning och ökar livslängden på maskar jämfört med icke-antibiotika kontroller16. Vissa typer av antibiotika, såsom rifampicin36 och medlemmar av tetracyklin familj37,38, har visat sig förlänga livslängd i C. elegans oberoende av deras inverkan på bakteriell spridning. Det finns dock inga bevis i litteraturen att antingen carbenicillin eller streptomycin kan öka livslängden oberoende av deras effekt på bakteriell spridning.

Livslängd kan ses som resultatet av en komplicerad uträkning där miljöinformation, dirigeras av gen-uttryck i neuronala nätverk överförs till fysiologi. Våra protokoll ger en metod för att förstå hur specifika gener påverkar detta flöde av miljöinformation. För att lösa denna fråga, behöver vi pålitliga bildbehandling för att bestämma fördelningen av gen uttryck svaren på enskild cell nivå. Att kunna uppskatta inte bara den genomsnittliga Svaren av genuttryck till förändringar i mat överflöd men fullständig statistisk fördelningen från stora befolkningar utgör också en viktig förutsättning för tillämpligheten av vår metod. Detta korrekt beskrivning av gen uttryck Svaren till mat överflöd tillåter informationsteori att kvantifiera informationen kodas av specifika nervceller samt kodning strategin anställd av neural krets.

De imaging och computational aspekterna av de metoder som anges i detta protokoll är tillämpligt till en större uppsättning biologiska sammanhang. I vårt arbete, har vi fokuserat på ett litet neurala nätverk involverade i mat avkänning, analyser av information-processing funktioner är dock inte begränsad till en viss cell eller särskilda miljömässiga ledtrådar. I framtiden kan dessa metoder potentiellt utvidgas till en större mängd ingående variablerna, som påverkar alla fysiologiska utdata. Dessa metoder kommer att bidra till en större förståelse för hur gen regleringsnät koda, process och överföra information.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Bargmann och Horvitz labben för reagenser. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Vi tackar också M. Lipovsek för synpunkter på manuskriptet. Denna forskning stöddes av den Wellcome Trust (Project Grant 087146 till Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 och BB/M00757X/1 till Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 till Q.C.), oss National Institutes of Health (R01AG035317 och R01GM088333 att H.L.) och U.S. National Science Foundation (0954578 att H.L., 0946809 GRFP att M.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin di-Sodium salt Sigma-Aldrich C1389-5G Antibiotic
Streptomycin Sulphate salt Sigma-Aldrich S6501-50G Antibiotic
 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758-10G Inducer for RNAi plates
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 71380-1KG-M Used in S basal, and NGM agar
di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) Sigma-Aldrich 1.05104.1000 Used in S basal, and NGM agar
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791-1KG Used in S basal, and NGM agar
Magnesium Sulphate (MgSO4) Sigma-Aldrich M2643-1KG Used in NGM agar
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G Used in NGM agar
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 71687-500G Used for bleaching
Pluronic-F127 Sigma-Aldrich P2443-1KG Used in imaging
Sodium Hypochlorite (NaClO) Sigma-Aldrich 1.05614.2500 Used for bleaching
LB Broth Invitrogen 12780052 Used to grow bacteria
Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 628960 Plates for lifespan
CellStar 10cm Tissue Culture plates Greiner Bio-One 664160 Plates for imaging
Low Retention P200 tips Brandt 732832 Tips for handling worms in liquid
Agar BD 214510 Agar for NGM, RNAi and NSC plates
Bacto-peptone BD 211820 Peptone for NGM, RNAi and NSC plates

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
  2. Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
  3. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  4. Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
  5. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
  6. Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
  7. Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
  8. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
  9. Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
  10. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  11. Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
  12. Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
  13. Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
  14. Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
  15. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  16. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  17. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
  18. Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
  19. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
  20. Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  21. van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
  22. Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
  23. Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
  24. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  25. Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
  26. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  27. Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
  28. Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
  29. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
  30. Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
  31. Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
  32. Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
  33. Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
  34. Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
  35. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
  36. Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
  37. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
  38. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).

Tags

Genetik fråga 126 dietrestriktioner High-throughput Imaging informationsteori neurovetenskap mikrofluidik neurala kodning genuttryck
Kvantifiering av Information kodas av genen uttryck nivåer under livslängden modulering enligt bred-range kosttillskott begränsning i <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. … More

Patel, D. S., Diana, G., Entchev, E. V., Zhan, M., Lu, H., Ch'ng, Q. Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans. J. Vis. Exp. (126), e56292, doi:10.3791/56292 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter