Summary
Qui, presentiamo un quadro per correlare la restrizione dietetica di ampio spettro di espressione genica e la durata della vita. Descriviamo i protocolli per la restrizione dietetica di ampio spettro e imaging quantitativo di espressione genica in questo paradigma. Abbiamo ulteriormente delineare analisi computazionali per rivelare alla base di funzionalità di elaborazione di informazioni dei circuiti genetici coinvolti nel rilevamento di cibo.
Abstract
Sistemi sensoriali permettere agli animali di rilevare, elaborare e rispondere al loro ambiente. Abbondanza di cibo è un segnale ambientale che ha effetti profondi sul comportamento e fisiologia animale. Recentemente, abbiamo dimostrato che la modulazione della longevità nel nematode Caenorhabditis elegans di abbondanza di cibo è più complesso di quanto precedentemente riconosciuto. La reattività della vita ai cambiamenti a livello alimentare è determinata da geni specifici che agiscono controllando l'informatica all'interno di un circuito neurale. Il nostro framework combina l'analisi genetica, imaging quantitativo elevato throughput e teoria dell'informazione. Qui, descriviamo come queste tecniche possono essere utilizzate per caratterizzare qualsiasi gene che ha una rilevanza fisiologica alla restrizione dietetica vasto-gamma. In particolare, questo flusso di lavoro è progettato per rivelare come un gene di interesse regola la durata della vita sotto restrizione dietetica di ampio spettro; quindi per stabilire come l'espressione del gene varia con il livello di cibo; e infine, per fornire una quantificazione obiettiva della quantità di informazioni trasmesse da espressione genica sull'abbondanza di cibo nell'ambiente. Quando diversi geni sono esaminati contemporaneamente nel contesto di un circuito neurale, questo flusso di lavoro consente di individuare la strategia di codifica impiegata dal circuito.
Introduction
Tutti gli organismi devono essere in grado di percepire e rispondere ai cambiamenti nell'ambiente per assicurare la loro sopravvivenza. Negli animali, il sistema nervoso è il rivelatore primario e trasduttore di informazioni sull'ambiente e coordina la risposta fisiologica a qualsiasi cambiamento che potrebbe influire sulla sopravvivenza1 dell'organismo. Abbondanza di cibo è un segnale ambientale che è ben studiato in più contesti che non solo regola i comportamenti legati al cibo, ad esempio foraggiamento2, ma influisce anche la longevità di un animale. La modulazione della durata della vita dai cambiamenti in abbondanza di cibo è un fenomeno noto come restrizione dietetica (Dott) e ha ampia conservazione evolutiva3.
Il nematode Caenorhabditis elegans è un sistema potente modello per affrontare questioni biologiche fondamentali. Una pletora di tecniche sono state sviluppate che consentono per la manipolazione del genoma del verme, come gene RNAi e in vivo , tecniche di editing. Le piccole dimensioni fisiche della sua trasparenza ottica e la vite senza fine si prestano anche ad in vivo imaging di reporter fluorescenti sia trascrizionale e traslazionale e utilità delle tecnologie high-throughput come microfluidica4. Insieme, questi strumenti possono essere sfruttati per esaminare il comportamento animale diretta di circuiti neurali come.
C. elegans è un bacterivore e sono stati pubblicati diversi metodi che consentono il controllo preciso di abbondanza alimentare manipolando concentrazione batterica5,6,7,8 . All'interno della comunità di ricerca di c. elegans , DR è stato studiato in due contesti diversi. Il primo può essere definito 'classica DR', come rispecchia i cambiamenti veduti in risposta a diminuire i livelli di cibo in altri organismi. In questo contesto, diminuendo l'abbondanza di cibo da livelli ad libitum si traduce in un aumento di durata della vita fino a quando viene raggiunto un risultato ottimale, dopo questa punto longevità diminuisce con ulteriore riduzione di cibo6,7, 9. Il secondo contesto in cui DR è stato studiato in c. elegans è privazione dietetica in cui la longevità dei vermi è aumentata tramite la rimozione completa di qualsiasi cibo batterica fonte10,11. In Entchev et al (2015)12, abbiamo mostrato che la complessità in DR derivanti da questi due paradigmi differenti possa essere esaminata simultaneamente in un contesto definiamo 'vasto-gamma DR'. Utilizzando il protocollo descritto qui di seguito, abbiamo identificato una nuova classe di geni coinvolti nella DR che in modo bidirezionale modulare la risposta di durata per l'abbondanza di cibo e sono coinvolti nei circuiti neurali che senso alimentare12 (Figura 1).
La risposta di un animale ai cambiamenti nell'ambiente integra una sequenza di processi biologici che collegano il sistema sensoriale a complesse interazioni regolamentazione trasmettere informazioni ambientali alla fisiologia. Anche se i dettagli meccanicistici di tali "flusso di informazioni" sono spesso sconosciuti, strumenti genetici possono essere utilizzati per acquisire uno spaccato di come è organizzato questo calcolo complesso tra i diversi componenti biologici. Nel nostro recente lavoro, abbiamo mostrato che daf-7 e tph-1 sono coinvolti nella trasmissione delle informazioni ambientali relative abbondanza alimentare attraverso un circuito neurale cibo-sensing che modula la durata della vita in c. elegans12 , 13. applicando la struttura matematica della teoria dell'informazione14, siamo stati in grado di quantificare la quantità di informazioni ambientali, in termini di bit, che sono rappresentati da cambiamenti di espressione genica in daf-7 e tph-1 in neuroni specifici attraverso i livelli differenti dell'alimento. Da questo, quindi eravamo in grado di scoprire la strategia di codifica impiegata da questo circuito neurale e come è geneticamente controllato (Figura 2).
Nel seguente protocollo, abbiamo delineare i passaggi necessari per capire quali sono gli effetti dei geni di interesse espresso nei neuroni specifici e come essi partecipano al flusso di informazioni sugli alimenti dall'ambiente alla durata della vita. In generale, il nostro quadro è diviso in due protocolli sperimentali e un flusso di lavoro computazionale. Per gli aspetti sperimentali, è fondamentale disporre di mutanti dei geni di interesse che possono essere esaminati sotto vasto-gamma Dr. Faithful trascrizionali giornalisti sono anche necessari per quantificare il livello di espressione dei geni a livelli differenti dell'alimento. Per essere in grado di svolgere l'analisi computazionale discusso nel nostro metodo, il dataset deve essere di dimensioni sufficienti a fornire stime significative delle distribuzioni di espressione. Anche se forniamo i codici sorgente di modello per le analisi, l'utente deve avere familiarità con il linguaggio della teoria dell'informazione che viene ampiamente utilizzato in tutto il nostro framework computazionale. I codici sorgente sono scritti in R e c + +. Di conseguenza, un certo livello di competenza di programmazione è anche richiesto di applicarli in modo significativo.
Protocol
1. preparazione delle colture batteriche e piastre per cultura generale Worm
- preparare 100 mL di media di brodo (LB) di Lisogenesi in un flacone di vetro da 250 mL e sterilizzare in autoclave.
- Inoculare la bottiglia con una singola Colonia del ceppo Escherichia coli OP50 e incubare a 37 ° C durante la notte e quindi memorizzare cultura a 4 ° C fino a quando necessario.
- Preparare 5 L di crescita del nematode sterile (NGM) agar 15 e aliquota 12ml volumi medi in capsule di Petri in plastica sterile 6 cm.
- Consentire l'agar impostare durante la notte e quindi conservare a 4 ° C fino a quando necessario.
- Seme NGM piastre almeno 3 giorni prima di utilizzare con 225 μL della cultura OP50 refrigerato. Conservare le piastre a 20 ° C fino a quando necessario.
2. Preparazione di colture batteriche e diluizioni per esperimenti
- preparare due lotti di 500 mL di LB media in una beuta da 2 L e sterilizzare in autoclave.
- Inoculare ciascuna beuta con una singola colonia di OP50 e crescere a 37 ° C in agitazione a 200 giri/min per circa 14 h.
- Integrare le culture con l'antibiotico streptomicina ad una concentrazione finale di 50 μg/mL. Continuare ad agitare per 30 min a 37 ° C quindi posto le beute in ghiaccio per 15 min.
- Trasferire 450 mL di ogni cultura in bottiglie separate centrifuga sterili (idealmente capacità bottiglie da 500 mL per evitare la suddivisione delle culture). Conservare la cultura avanzo sul ghiaccio, come verrà utilizzato per determinare la concentrazione dei batteri.
- Rotazione verso il basso le bottiglie a 4500 x g in un set di centrifuga refrigerata a 4 ° C per 25 min surnatante di scartare e conservare le bottiglie sul ghiaccio.
- Diluire 100 μL di cultura avanzo da ciascuna beuta in 900 μL di sterile lb uso 1 mL di LB sterile a zero lo spettrofotometro e quindi determinare il OD 600 della diluizione 10 volte di ogni cultura. Se ad esempio, il OD 600 della diluizione 10 volte della cultura durante la notte è 0.28 quindi la coltura ha avuta un effettivo OD 600 del 2.8.
- Uso una soluzione madre di lavoro dei batteri di 1,12 x 10 10 OP50 cellule/mL, che equivale a un OD 600 di 56. Pertanto, utilizzando l'esempio OD 600 di 2,8 dall'alto, risospendere il pellet dalla cultura 450 mL in un 20 th del volume originale, che in questo caso è mL 22,50. Risospendere i batteri con soluzione sterile S basale completata con streptomicina a 50 μg/mL (SB + strep).
- Risospendere il pellet nel volume appropriato di sterile SB + streptococco.
- Rendere tutte le concentrazioni successive utilizzate negli esperimenti da diluizioni seriali dello stock lavoro in SB + strep utilizzando i fattori di diluizione elencati nella tabella 1.
3. Impostazione a durata della vita esperimenti
Nota: durata analisi vengono eseguite su coltura tissutale 6 cm trattati riempito con 12 mL di agar NGM completati con streptomicina e carbenicillina (NSC), entrambi ad una concentrazione finale di 50 μg/mL. Queste piastre di coltura del tessuto sono particolarmente adatte per saggi di durata della vita a no o molto basse concentrazioni batteriche, i vermi sono significativamente meno inclini ad attaccarsi alla parete della piastra ed essiccare. L'uso di due diversi antibiotici impedisce che il ceppo OP50 lo sviluppo di farmaco-resistenza, che è fondamentale nel controllo della concentrazione batterica sulla piastra. Inoltre, inattivando i batteri con antibiotici, minimizzare gli effetti sulla durata della vita di vite senza fine a causa di infezione patogena 16. Questo permette di considerare solo i componenti di concentrazione batterica in questi esperimenti legati al cibo. Molti studi di invecchiamento di c. elegans supplemento piastre NGM con i chimici fluoro-2 ′-deoxyuridine (FUdR) per eseguire il rendering gli adulti sterile. Tuttavia, l'uso di FUdR può essere problematico in quanto il suo utilizzo può causare diversi problemi di confusione con longevità saggi 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Entchev et al (2015) 12 aggirato questo problema tramite l'esposizione delle larve L4 a RNAi di uovo-5 22 , 23, che inibisce la transizione dell'oocita a embrione bloccando la formazione del guscio d'uovo di fertilizzato ovociti di c. elegans causandone la morte.
Ceppi di- cultura c. elegans che verranno saggiati su seminato piastre NGM a 20 ° C. lasciate le piastre affamare per garantire che tutti gli animali sono coltivati in modo uniforme e potenzialmente conto per eventuali effetti transgenerazionali di circostanze inerenti allo sviluppo.
- Trasferimento di fame le larve L1 nuove piastre di NGM seminati tagliando fuori un piccolo pezzo di agar (5 x 5 mm) dalla piastra affamata usando un bisturi sterile e poggiare su una piastra, un processo citato come ' chunking ' dal comm di ricerca di c. elegans unità 15. Crescono le viti senza fine fino a raggiungere la fase di L4. Cinque L4 larve per ceppo sono poi trasferite a piatti NGM seminati individuali e mantenute a 20 ° C. Questi animali rappresentano la generazione di P0.
- Uso L4 progenie della generazione P0 per impostare la generazione F1. Posto singolarmente larve L4 F1 del ceppo selvaggio tipo N2 a 30 piastre NGM seminati.
Nota: Per ceppi mutanti, il numero di piatti necessari dipende dal loro tasso di crescita. Ad esempio, daf-7(ok3125) animali subiscono un arresto di dauer transitoria a 20 ° C. Così, questo ceppo produce meno larve L4 che un piatto di tipo selvaggio N2 worm. - Per compensare questa differenza, set up piastre in daf-7(ok3125) su un giorno prima rispetto N2 piatti e a un numero maggiore, un buon rapporto di lavoro è 3:1.
- Trasferimento sincronizzato progenie L4-fase dei genitori F1 a NGM piastre completati con 1 mM IPTG e carbenicillina di 50 µ g/mL (piastre di RNAi) che sono stati seminati con 225 µ l di batteri HT115 esprimendo dsRNA targeting per il gene di uovo-5 e mantenuto a 20 ° C per 24 h. Almeno 360 worm al ceppo, mantenuto ad una densità di 15 animali per piastra, sono necessari per esperimento.
- Dopo l' uovo-5 trattamento RNAi, trasferire i vermi a NSC piastre inoculate con 225 µ l della streptomicina-trattati OP50 ad una concentrazione di 2 x 10 9 cellule/mL (tabella 1) per altre 24 ore a 20 ° C. Per evitare danni fisici ai vermi durante questo e tutti i trasferimenti successivi, delicatamente scoop animali su da sotto il worm usando un verme molto sottile leggermente curvo pick. Galleggiante gli animali fuori il worm pick immergendolo in una goccia di 10 µ l di SB + mal posizionato sulla superficie della piastra nuova.
- Il giorno successivo, ridistribuire i vermi a piastre NSC che rappresentano ciascuno del cibo livelli listed in tabella 1, nonché una serie di piastre di NSC che non contengono nessun batterio. Tutte le piastrine di NSC con 225 µ l della rilevante concentrazione di batteri di semi e le piastre di NSC esente da batteri con µ l 225 SB + strep del seme. Mantenere i vermi ad una densità di 15 animali per piastra, con conseguente almeno quattro piastre a condizione di cibo al ceppo. Spostare le piastre alla temperatura desiderata sperimentale.
- Trasferimento vermi piatti freschi di NSC seminato con concentrazione di cibo appropriato secondo il calendario indicato nella tabella 2.
- Animali di punteggio per il movimento di incitamento delicatamente con un filo di scegliere. La mancata risposta è segnata come morte. Punteggio ottenuto di animali per ogni trasferimento di morte punto e poi tutti i giorni dopo l'ultimo punto di trasferimento.
4. Impostazione di esperimenti di Imaging
Nota: la procedura descritta in questa sezione è sufficiente per generare abbastanza worm al ceppo per imaging una condizione sperimentale cibo ad una data temperatura. Questo protocollo può essere ridimensionato in base il numero di condizioni che potranno essere imaged in un dato giorno. Tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione nel disegno sperimentale per garantire che il lasso di tempo è ragionevole e che gli animali attraverso diversi ceppi non hanno una differenza di età maggiore di 12 ore il giorno dell'imaging. Si consiglia vivamente che i giornalisti trascrizionali essere imaged sono copia singola transgenetica, come questo assomiglierà più strettamente il regolamento nativo del gene. Il protocollo descritto qui di seguito e riassunti nella tabella 3, fornisce anche un metodo semplificato per l'ottenimento di popolazioni pari grande età sincrono dei ceppi, che possono essere utilizzati per altri flussi di lavoro sperimentale.
- Cultura animali in esperimenti sulle piastre di coltura del tessuto 10 cm trattati per consentire una maggiore densità di vermi di imaging (∼ 100 animali per piastra) di durata della vita saggi.
- Riempire le piastre di 10 cm con 30 mL di piastre di agar NGM e seme con aliquote di cinque 225 µ l di refrigerati OP50 cultura in una croce-come formazione.
5. Iniziale cultura di ceppi Reporter
- cultura c. elegans ceppi che verranno saggiati su seminato piastre NGM a 20 ° C. lasciate le piastre affamare per garantire che tutti gli animali sono coltivati in modo uniforme e potenzialmente conto per qualsiasi effetti transgenerazionali di circostanze inerenti allo sviluppo.
- Chunk L1 affamato larve a seminato piastre NGM e crescono fino a raggiungere la fase di L4. Trasferire tre L4 larve per ceppo a due piastre NGM seminati a 20 ° C. Questi animali rappresentano la generazione di P0.
- Utilizzare la progenie di L4 della generazione P0 per impostare la generazione F1. Posto F1 L4 larve del ceppo selvaggio tipo reporter a 4 teste di serie piastre NGM. Per ceppi mutanti, il numero di piatti necessari dipende dal loro tasso di crescita. Utilizzando l'esempio precedente di daf-7(ok3125), ceppi di reporter in questo sfondo richiedono tre volte le targhe e bisogno di essere impostati fino a due giorni prima i tipo selvaggio ceppi reporter, per tenere conto delle differenze nel tasso di crescita.
6. Raccolta delle uova e sincronizzazione di ceppi Reporter
Nota: alcuni geni di interesse per la comunità di ricerca di invecchiamento di c. elegans risultato in crescita e deposizione delle uova difetti quando mutato, che lo rende più difficile generare sincroni grandi popolazioni di animali di differenti genotipi. Ad esempio, la mutazione di daf-7(ok3125) causa un grave difetto di deposizione delle uova rispetto al wild type ceppo N2. Pertanto, per ottenere sufficiente numero di larve di L4 sincrone di diversi ceppi per esperimenti di imaging quantitativi richiede una metodologia più robusta rispetto raccogliendo manualmente vermi. Per questo motivo, ceppi trascrizionale reporter sono stati sottoposti ad un ipoclorito di sodio (NaClO) / trattamento di soluzione di idrossido di sodio (NaOH) di gravid adulti per rompere aprire gli animali e liberare le loro uova, un processo noto come ' sbiancamento ' di c. elegans ricerca comunità 15.
- Conto delle differenze di crescita i tassi tra i ceppi e calcolare quando piastre di ogni ceppo dovrebbero essere raccolte e sbiancati. Per un esempio di quando vengono sbiancati wild type e daf-7(ok3125) ceppi reporter Vedi tabella 3.
- In serie lavare i vermi di un determinato ceppo fuori le piastre, il giorno appropriato, usando 15 mL di SB e raccogliere in una provetta sterile 15 mL. Consentire agli animali di naturalmente sedimentare e poi regolare il volume di liquido a 7 mL.
- Aggiungere 2 mL di 5% NaClO e 1 mL di NaOH M 5 nella provetta contenente gli adulti gravid. Scuotere delicatamente la miscela a temperatura ambiente per non più di 3 min. Il NaClO uccide i batteri e vermi, mentre il NaOH provoca i vermi a rompersi a parte rilasciando eventuali uova fecondate contengono nel liquido. La chitina guscio d'uovo intorno gli embrioni li protegge dagli effetti del trattamento, finché il tempo di esposizione rimane relativamente breve. Dopo l'incubazione di 3-min, vortice il tubo per ~ 30 s per agevolare ulteriormente il disfacimento delle carcasse worm.
- Dopo lo spin di incubazione 3-min giù la miscela a 1.000 x g per 1 minuto agglomerare le uova. Aspirare via la maggior parte del surnatante con una pipetta di vetro sterile collegata ad un thermos, lasciando ~0.5 mL in ogni provetta, per non disturbare le uova.
- Risospendere il sedimento con 9,5 mL di SB e quindi ripetere la centrifugazione e risospensione passi un ulteriore due volte affinché le uova sono state lavate con SB un totale di tre volte.
- Dopo la finale lavare, pellet le uova attraverso centrifugazione e poi scartare tutti ma 0,5 mL del surnatante. Risospendere le uova nel restante 0,5 mL di SB e quindi aliquota 100 µ l a tre piastre NGM 10cm seminato. Distribuire il 100 µ l ugualmente sopra tutti cinque i prati inglesi batterici su ogni piatto. Per i ceppi di tipo selvaggio, uova non devono essere depositate a densità superiore a 200 per ciascuna piastra.
- Tenere piastre a 20 ° C per 48 h e di ottenere una popolazione altamente omogenea delle larve L4. Per i ceppi con i fenotipi di ritardo della crescita, si consiglia di depositare le uova come molti come disponibile e aumentare il tempo di incubazione. Ad esempio, tenere daf-7(ok3125)-contenenti ceppi reporter a 20 ° C per ~ 64 h per consentire le uova si schiudono e raggiungere la fase di L4.
7. Trattamento di ceppi Reporter con uovo-5 RNAi
- in serie lavare i vermi fuori le tre piastre con 15 mL di SB e raccogliere il liquido in una provetta sterile 15 ml. Consentire le larve L4 naturalmente sedimentare e poi aspirare tutto ma ~0.5 mL del liquido. Nel selvaggio typceppi di reporter e, questo passaggio rimuove qualsiasi delle larve più giovani di L4. Nel mutanti sfondi, questo passaggio aiuta la rimozione delle eventuali larve arrestate come dauers nel caso di daf-7(ok3125).
- Risospendere i vermi con 9 mL di SB. Ancora una volta, monitorare il tasso di sedimentazione delle larve L4 e quindi aspirare tutti ma ~0.5 mL del surnatante, una volta che la maggior parte delle larve L4 hanno pellettati. Ripetere questo processo una volta di più. Poi aspirare tutto ma ~0.5 mL del liquido una volta liquidato la maggior parte delle larve L4.
- Aggiungere 10 µ l di sterile S basale completati con 0,1% Pluronic F-127 (SB + Plu) al liquido che contiene le larve L4. Questo agisce come un tensioattivo e impedisce le larve di attaccarsi alla superficie interna dei puntali in plastica.
- Risospendere delicatamente le larve con una punta di pipetta bassa ritenzione P200 e quindi aliquota 150 µ l su tre piastre di RNAi di 10 cm che sono seminati con 5 x 225 µ l di uovo-5 RNAi batteri. Garantire che i vermi sono equamente distribuiti tra tutti i cinque prati batterici.
- Una volta che il liquido è assorbito nell'agar, rimuovere qualsiasi non-L4 larve delle placche che non sono state eliminate tramite la procedura di lavaggio selezionando manualmente. Quindi memorizzare le piastre a 20 ° C per 24 h.
8. L'inizio della vasto-gamma DR
Nota: dopo 24 h uovo-5 trattamento RNAi, le larve L4 che erano originariamente depositate sulle placche saranno diventato adulti 1 - vecchi giorno.
- Pick off qualsiasi giovani larve che sfuggito il passaggio previa rimozione manuale fuori in questa fase, lasciando solo gli adulti 1 - giorno-vecchi sulle piastre.
- Per ogni ceppo, lavare gli adulti 1 giorno di età da tre lastre con 15 mL di sterile SB + strep in una provetta da 15 mL. Consentire i vermi naturalmente sedimentare e poi aspirare tutto ma 0,5 mL del surnatante. Risospendere i vermi con 9,5 mL di SB + strep e ripetere i passaggi di sedimentazione e wash.
- Dopo la finale lavare, consentire i vermi di sedimenti e quindi aspirare tutti ma 0,5 mL di surnatante. Aggiungere 10 µ l SB + Plu e Risospendere delicatamente le larve usando una punta di pipetta P200 e quindi aliquota 100 µ l su un piatto di NSC seminato con batteri 5 x 225 µ l a una concentrazione di 2 x 10 9 cellule/mL.
- Distribuisci i 100 µ l uniformemente attraverso tutti i cinque prati batterici. Sotto un microscopio stimare il numero di animali presenti sulla piastra: l'obiettivo è di avere tra 100-150 vermi sulla piastra.
- Determinare il volume di liquido richiesto per ottenere una densità di vite senza fine all'interno di questa gamma e quindi aliquota su due piatti aggiuntivi. Regolare il numero di vermi sul primo piatto anche rientrano in questa gamma e quindi archiviare le piastre a 20 ° C per 24 h.
- Il giorno successivo, i 2 giorno vecchi adulti di raccogliere e distribuire a nuove piastre di NSC seminati con la concentrazione sperimentale di cibo (tabella 1), riutilizzando i metodi descritti in passaggi 2 e 3. Una volta che il liquido è assorbito nell'agar, spostare le piastre alla temperatura desiderata sperimentale per 24 h.
- Il giorno successivo, gli adulti 3 giorno precedente di raccogliere e distribuire a piatti freschi di NSC seminati con la stessa concentrazione sperimentale di cibo, riutilizzare i metodi descritti in passaggi 8.3 e 8.4. Una volta che il liquido è assorbito nell'agar, restituire le piastre alla temperatura sperimentale per 48 h.
- I 5 giorno vecchi adulti di raccogliere e distribuire a piatti freschi di NSC seminati con la stessa concentrazione sperimentale di cibo, riutilizzare i metodi descritti in passaggi 8.3 e 8.4. Una volta che il liquido è assorbito nell'agar, restituire le piastre alla temperatura sperimentale per 24 h.
9. Microfluidica Imaging di ceppi Reporter
- il giorno 6 dell'età adulta, immagine animali utilizzando un personalizzato microfluidici piattaforma 24 , 25. Fisicamente selezionare fuori gli animali dalle tre piastre e sospendere in un tubo criogenico 5 mL contenente 4,5 mL di SB + streptococco.
- Una volta i vermi sedimento, aspirare tutti ma ~0.5 mL del surnatante e risospendere gli animali in 4 mL di SB + streptococco. Questo lavaggio rimuove batteri in eccesso che altrimenti potrebbero interferire con l'imaging. I vermi vengono introdotti in un dispositivo microfluidico personalizzato tramite pressione guidato flusso 24 , 25. All'interno del dispositivo, vermi individuali sono diretto in e intrappolati all'interno di un canale imaging dipendente da valvole di pressione-driven su chip 26 sotto il controllo di software personalizzato.
- Una volta che un verme è intrappolato a capofitto nel canale imaging, raccogliere un fluorescente z-stack, con 50 sezioni di 2 µm, utilizzando un microscopio a epifluorescenza standard con un 40 X olio obiettivo (1,3 NA) e una macchina fotografica. Raccogliere immagini fluorescente rosse e verde per ciascuno dei reporter trascrizionale simultaneamente utilizzando uno splitter di emissione e memorizzati per analisi. Acquisizione di immagini è automatizzato utilizzando software personalizzato.
- Elaborare l'immagine automaticamente utilizzando personalizzato MATLAB script 27 (disponibile presso https://github.com/meizhan/SVMelegans). Gli Z-stack vengono caricati in MATLAB e analizzati per individuare coppie di neuroni e le loro posizioni all'interno del piano di formazione immagine. Le proiezioni massime vengono quindi calcolate e un algoritmo di soglia è utilizzato per individuare le singole cellule fluorescenti. Identificazione di cella viene quindi calcolata basata su distanze relative e posizioni all'interno del worm ' testa di s.
- Per quantificare la fluorescenza del reporter, estrarre il volume tridimensionale intorno ogni posizione cellulare dallo z-stack. Integrare l'intensità su un consistente numero di pixel più luminosi, che racchiudono completamente l'intera cella in tutti i casi.
- Per eliminare le interferenze da modifiche sperimentali di ceppo-specifici o condizione in budello auto-fluorescenza di ogni animale, calcolare l'intensità di sfondo per le coppie di cella più vicina l'intestino (ADF e ASI) tramite valutazione del modo della distribuzione di intensità in un volume intorno al neurone. Sottrarre questo valore di intensità di sfondo dalla fluorescenza integrata per ottenere l'output finale.
10. Assembly di dati
Nota: l'intensità di fluorescenza di tutti i neuroni analizzati dal software di elaborazione delle immagini vengono combinati nel file di dati di espressione filtrata (FED) che viene utilizzato per stimare i profili di distribuzione del gene espressione (modello R e gli script di C++ sono disponibili presso https://github.com/giovannidiana/templates).
- Immagine dell'assegno ogni elaborato manualmente per confermare la corretta identificazione per tutte le celle. Immagini con identificazione erronea cella devono essere registrati in un file di esclusione. In Diana et al (2017) 13 il file di esclusione è costituito da un tavolo binario con ' 0 ' per correggere e ' 1 ' per l'identificazione di cella non valido. Il numero di righe della tabella è uguale al numero di vermi imaged con una colonna per ogni cella imaged (cioè ASI, ADF e NSM).
- Generare il file FED:
- Run la bash script " gen_data + tempo " per generare file di cellula-specifico che combina i valori di espressione ottenuti da ogni verme imaged filtrata utilizzando il file di esclusione. Per ogni cartella generato dal software di elaborazione delle immagini, lo script bash legge il file di annotazione < folderprefix > _EXP.txt per estrarre le condizioni sperimentali e il file di esclusione < folderprefix > _X.csv per selezionare solo correttamente identificati i neuroni. I valori dell'espressione vengono letti dai file < folderprefix > _data_ < neurone > CSV.
- Concatenare tutti i file in " FED_split.dat " e ordinarli per il codice del lotto di esperimento, verme identità etichetta e cell.
- Eseguire " sorta " (programma C++, l'utilizzo:. Sort FED_split.dat FED_merged.dat) per selezionare le voci con fluorescenza diverso da zero per ogni cella e combinarli in singole righe in FED_merged.dat.
11. Stima delle informazioni codificate
Nota: la procedura seguente descrive come quantificare le informazioni su specifiche condizioni ambientali codificato dall'insieme delle espressioni geniche. In Diana et al. (2017) 13, le informazioni codificate sull'abbondanza di cibo nell'ambiente è stata esaminata, tuttavia, il metodo è applicabile a qualsiasi numero discreto di stati ambientali. L'ingrediente essenziale per quantificare le informazioni variabili teoriche come entropie informazioni o ridondanza è la distribuzione di probabilità congiunta delle risposte neurali sotto gli stimoli ambientali insieme considerati. Per eseguire tale stima, è fondamentale avere un campionamento sufficiente della risposta attraverso popolazioni di vermi. Distribuzioni gaussiane possono essere stimati dai campioni relativamente piccoli; Tuttavia, è importante avere un'idea della forma prevista la distribuzione di espressione per quantificare la dimensione del campione adeguata per una stima affidabile di densità. A causa dell'inevitabile variabilità in diversi studi clinici, è essenziale per verificare che i valori centrali delle distribuzioni ottenute da diverse ripetizioni dell'esperimento stesso non sono sistematicamente spostati o che qualsiasi delle caratteristiche statistiche della distribuzione di espressione non risultano significativamente modificati in studi clinici. Nel caso in cui la variabilità di trial--trial è compatibile con la variabilità all'interno di ogni prova, è fondamentale bilanciare il numero di prove contro il numero di vermi all'interno di prove per la media di quei fattori ambientali/biologici che influenzano la prova-di-prova variabilità. Sottocampionamento di quei fattori potrebbe pesantemente influenzare l'analisi teorico-informazioni.
- Script come la R " code3D.R " fornisce un modello per generare densità tridimensionale basato sul file " FED_merged.dat ", modificare questo modello in base al formato di intestazione specifico FED. L'elenco " HeaderNames " rappresenta i nomi di ogni campo nel file FED mentre " RONames " l'elenco le letture. Lo script utilizza il pacchetto di R ' ks ' 28 , 29 per stimare distribuzioni multivariate all'interno di una griglia di ipercubico con GS bidoni in ciascuna dimensione suddividendo l'intervallo tra minimo e massimo valori del set di dati per ogni lettura. Quando la variabile interna " gruppo " è impostato su 0, tutti i dati sono utilizzati per la stima della densità. Quando il " gruppo " etichetta è tra 1 a 5, il dataset è diviso in 5 insiemi disgiunti, e le densità di espressione sono stimate dall'80% dei dati derivanti dall'esclusione di uno dei cinque set. Questa funzionalità viene utilizzata successivamente per stimare le incertezze.
Nota: L'utilizzo di code3D.R: code3D.R Rscript < GT > < cibo > < GS > < outfolder > < etichetta > < gruppo > < frac > dove GT rappresenta il genotipo, il cibo è la condizione ambientale, outfolder è il pre-esistente cartella dove verranno archiviate le distribuzioni, l'etichetta è un prefisso del nome file e frac è la frazione del dataset utilizzato. - Per ogni condizione ambientale generare le distribuzioni multivariate con griglia diverse taglie GS (ad es. 20,30,40 bidoni). Per ridurre il carico computazionale, i valori più piccoli di GS sono preferibili quando risoluzioni più preciso non modifica significativamente la stima di informazioni. Distribuzione di espressione genica vengono scritti nella cartella < outfolder > specificato durante l'esecuzione code3D.R come singoli file di testo di colonna con struttura di nome file < etichetta > _ < GT > _ < cibo > _GS < GS > _group < gruppo >. dat.
Nota: I passaggi precedenti forniscono la stima delle distribuzioni di probabilità condizionale
dove g indica il vettore di tutte le letture e f è la condizione ambientale. Tuttavia, per calcolare l'informazione reciproca tra espressione genica e l'ambiente 30 , 31.
abbiamo bisogno la distribuzione dell'input
che determina anche il (ingresso-) una media di espressione genica < img alt = "Equazione 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Quando la distribuzione di ingresso non è direttamente disponibile, una quantità significativa di caratterizzare le funzionalità di codifica è la capacità di canale, che può essere ottenuta massimizzando l'informazione reciproca tra tutti i possibili inpue distribuzioni. - Utilizzando la distribuzione di espressione genica, applicare l'algoritmo di 32 Arimoto-Blahut per stimare la capacità di canale del sistema e la distribuzione dell'input ambientali che massimizza le informazioni. Un esempio di implementazione dell'algoritmo può essere trovato nel programma C++ " Ccap3D.cpp " per l'espressione genica tridimensionale codice analizzato in Diana et al (2017) 13. Esempio: se distribuzioni dal genotipo GT123 sono ottenuti dall'80% dei dati (gruppo 3) con dimensione griglia uguale 30 e memorizzati nella cartella ". /pdf/ " tramite un'etichetta di prefisso = " PDF ". È il comando per calcolare le informazioni codificate in background GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
Nota: la stima le informazioni codificate dal sistema è interessata da molteplici fonti di incertezza, compresa la scelta della stima di densità esempio di algoritmo e di bias di dimensione. Passaggi da 11.1 a 11.2 dovrebbero essere ripetuti utilizzando metodi di stima di densità diverse per valutare le dimensioni della polarizzazione sistematica introdotto da ogni algoritmo. - Per stimare l'incertezza a causa della dimensione del campione, ricalcolare informazioni da passaggi da 11.1 a 11.2 con gruppi da 1 a 5. La variabilità tra questi cinque campionamenti indipendente dell'80% dei dati rifletterà l'impatto della dimensione del campione sulla stima informazioni.
- Calcolare informazioni utilizzando passaggi da 11.1 a 11.2 sopra aumentando la frazione dei dati (come nel passaggio 5) per correggere per esempio-dimensione bias (coltello a serramanico metodo) 33.
dove g indica il vettore di tutte le letture e f è la condizione ambientale. Tuttavia, per calcolare l'informazione reciproca tra espressione genica e l'ambiente 30 , 31. 
che determina anche il (ingresso-) una media di espressione genica < img alt = "Equazione 4" src="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg" / >. Quando la distribuzione di ingresso non è direttamente disponibile, una quantità significativa di caratterizzare le funzionalità di codifica è la capacità di canale, che può essere ottenuta massimizzando l'informazione reciproca tra tutti i possibili inpue distribuzioni.12. Calcolo della correlazione di segnale, rumore e ridondanza
- uso ottimale ingresso distribuzioni ottenute dalla stima delle massime informazioni per calcolare l'informazione reciproca
tra ingresso e gene risposta di espressione di ogni neurone N. Il file di origine C++ " GetMI1D.c " è un programma di esempio per ottenere informazione reciproca marginale dalle distribuzioni di probabilità congiunta. - Calcolare ridondanza prendendo la somma di informazioni reciproche per ogni neurone ottenuta in precedenza e quindi sottrarre la capacità di canale.
- Calcola il " shuffle " termine delle informazioni
13 , 34. Un file di origine del modello di C++ può essere trovato " GetShuffle.c ". - Uso il " shuffle " termine per calcolare la correlazione di segnale e rumore. Per il signacorrelazione di l abbiamo
e per la correlazione rumore abbiamo 
. - Incertezze sulla ridondanza, ottenere rumore e correlazione per quanto riguarda le informazioni totale (passaggio 11.3 della sezione precedente) da campionature più dell'80% dei dati e prendendo la deviazione standard del segnale.
tra ingresso e gene risposta di espressione di ogni neurone N. Il file di origine C++ " GetMI1D.c " è un programma di esempio per ottenere informazione reciproca marginale dalle distribuzioni di probabilità congiunta.
13 , 34. Un file di origine del modello di C++ può essere trovato " GetShuffle.c ".
e per la correlazione rumore abbiamo 
.Representative Results
Conducendo esperimenti di durata sui mutanti dei geni di interesse a fianco il tipo selvaggio N2 ceppo, uno può stabilire se questi geni hanno un ruolo nella risposta cibo a vasto-gamma DR. La risposta di tipo selvaggio dovrebbe essere paragonabile a quello raffigurato in Figura 1A. Qualsiasi modulazione di questa risposta da mutanti, riflettuto da un effetto non uniforme attraverso condizioni di cibo, indica che questi geni influenzano la capacità del worm di correttamente rispondere ai cambiamenti in abbondanza di cibo, a quale punto di indagine successiva della le risposte di espressione di questi geni ad ampio spettro DR è garantito. Se, tuttavia, la risposta di longevità dei mutanti non è significativamente differente dal wild type, quindi i geni non hanno alcun ruolo nel trasdurre gli effetti della vasto-gamma DR, almeno a livello di durata della vita media. Se le mutazioni causano uno spostamento uniforme della risposta intera durata della vita i geni hanno un effetto di cibo-indipendente sulla longevità. Questo non esclude la possibilità che l'espressione dei geni di interesse è cibo-sensible a reagire, nel qual caso le informazioni trasportate da questi geni non viene trasmesso alla durata della vita.
La fase successiva del protocollo è quello di determinare come i livelli di espressione cambiare sotto DR ampio spettro per i geni di interesse. In Figura 1B, illustriamo questo attraverso i livelli di espressione di un reporter trascrizionale di daf-7, che mostra una risposta ai cambiamenti nel livello di cibo nei neuroni sensoriali ASI. In un mutante di daf-7(-) , la risposta di espressione del reporter trascrizionale è alterata. Se i geni di interesse sono veramente cibo-sensible a reagire a livello di durata della vita, si può aspettare che la loro espressione cambierà anche con il cibo. Corrispondentemente, un reporter trascrizionale in background mutante dovrebbe avere un profilo di espressione alterata in risposta a vasto-gamma DR. Tuttavia, è anche possibile che il reporter trascrizionale del gene di interesse in uno sfondo di tipo selvaggio non viene visualizzato alcun cibo-sensible a reagire modifiche nell'espressione. In questo caso, potrebbe trattarsi di un effetto regolatore trascrizionale che rientra nell'ambito del presente protocollo.
In Diana et al (2017)13, abbiamo estratto i valori dell'espressione per daf-7 in ASI e tph-1 in ADF e NSM. In Figura 2A, illustriamo la stima della distribuzione per un livello di alimento dato espressione in ASI e ADF. Avere più letture da immagini di vite senza fine ci permette di analizzare non solo la quantità di informazioni codificate in modo indipendente da ogni neurone ma anche l'informazione combinatoria del circuito neurale complesso (Figura 2B-2 C). Combinando queste due misure di informazione permette di caratterizzare il sistema in termini di strategia di codifica impiegato dai neuroni per trasmettere informazioni sul cibo. La quantità di ridondanza nel circuito può essere ottenuta prendendo la somma di informazioni reciproche per ogni neurone e sottraendo l'informazione reciproca congiunte (capacità di canale) ottenuti considerando le letture combinatoriale del circuito. Un valore positivo di tale differenza denota un carattere ridondante della strategia di codifica perché le informazioni complessive tra le parti sono più grande le effettive informazioni codificate da tutto il circuito. Al contrario un valore negativo riflette una strategia sinergica, perché la vera informazione codificata è maggiore della somma delle sue componenti (Figura 2B). Informazioni e la ridondanza può essere paragonati in tutto diversi genotipi di esplorare possibili ruoli di ordine superiori di regolazione genica, per esempio in Diana et al. (2017) 13 l'effetto della mutazione di daf-7 passa la strategia di codifica da ridondante a sinergica (Figura 2C-2D).
Figura 1 : Risposta di durata della vita ed espressione genica sotto Dr. vasto-gamma Durata della vita (A) la media di tipo selvatico N2 ceppo (linea nera) consente di visualizzare una complessa risposta a vasto-gamma DR. La grandezza di questa risposta è attenuata in un null mutante del gene daf-7 (linea rossa). Barre di errore rappresentano errore standard della media, dati raccolti da Entchev et al. (2015) 12. i livelli di espressione di (B) la media di un reporter trascrizionale per il gene daf-7 tipo selvaggio sfondo (linea nera) visualizzare anche una complessa risposta non monotone a vasto-gamma DR. In background genetico daf-7(-) l'espressione di questo reporter trascrizionale è altamente attenuato e dimostra poca risposta ai cambiamenti nel livello di cibo. Barre di errore rappresentano errore standard della media, dati da una singola prova in Entchev et al. (2015) 12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Metodologia computazionale. (A) illustrazione di stima di densità bidimensionale di tph-1 espressione nell'espressione ADF e daf-7 in ASI come ottenuti dal pacchetto 'ks' R utilizzando una dimensione di griglia 30x30. Visualizzazione (B) le informazioni codificate dall'espressione congiunta di tph-1 e daf-7 (intero) e individualmente (somma delle parti) per i neuroni ADF, ASI e NSM. Caratteri ridondanti e sinergiche della codifica sono rappresentati dalla differenza tra l'altezza delle barre impilate sulla destra e l'informazione codificata dal circuito completo. (C) confronto tra informazioni alimentari codificati da animali wild-type e mutanti di daf-7(-) . (D), la riduzione di informazioni reciproche osservati nei mutanti è accompagnato da un interruttore verso codifica sinergici. Pannelli B-D sono adattati da Diana et al. (2017) 13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Concentrazione batterica (cellule/ml) | Densità ottica (600 nm) | Fattore di diluizione (da precedente) |
| 1.12E + 10 | 56.000 | 0.00 |
| 2.00 E + 09 | 10.000 | 5.60 |
| 6.32E + 08 | 3.160 | 3.16 |
| 6.32E + 07 | 0.316 | ore 10.00 |
| 2.00 E + 07 | 0.100 | 3.16 |
| 0 (S basale) | 0.000 | NA |
Tabella 1: livelli di cibo e fattori di diluizione utilizzati nel vasto-gamma Dr. Battericoncentrazioni di l (cellule/mL) utilizzate nel protocollo vasto-gamma DR, insieme con le loro rispettive misure600 OD e il fattore di diluizione necessaria per raggiungere ogni concentrazione da quella precedente.
| Temperatura sperimentale della durata della vita | |||||||
| Giorno | 12,5 ° C | 15° C | 17,5 ° C | 20° C | 22,5 ° C | 25° C | 27,5 ° C |
| -12 | Suddividere tutti i ceppi di piatti freschi di NGM e mantenere a 20° C | ||||||
| -11 | |||||||
| -10 | Impostare la pagina di P0 generazione di ceppi daf-7(-) e mantenere a 20° C (1 L4 per piastra, 5 piastre) | ||||||
| -9 | Impostare la pagina di P0 generazione di ceppi di tipo selvaggio e mantenere a 20° C (1 L4 per piastra, 5 piastre) | ||||||
| -8 | |||||||
| -7 | |||||||
| -6 | |||||||
| -5 | Impostare la pagina di generazione F1 di daf-7(-) ceppi e mantenere a 20° C (1 L4 per piastra, 90 piastre) | ||||||
| -4 | Impostare la pagina di generazione F1 di ceppi di tipo selvaggio e mantenere a 20° C (1 L4 per piastra, 30 piastre) | ||||||
| -3 | |||||||
| -2 | |||||||
| -1 | |||||||
| 0 | Scegliere le larve L4 F2 a > RNAi uovo-5 piastre e mantenere a 20° C (15 L4 per piastra, 24 tavole) | ||||||
| 1 | Spostare gli adulti 1 - giorno-vecchi NSC piastre inoculate con 2.0 e + 9 livello di cibo di cellule/ml e mantenere a 20 ° C | ||||||
| 2 | Spostare gli adulti 2 - giorno-vecchi di NSC piastre seminati con le condizioni sperimentali di cibo e di temperatura sperimentale | ||||||
| 3 | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento |
| 4 | |||||||
| 5 | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento |
| 6 | |||||||
| 7 | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento |
| 8 | |||||||
| 9 | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento |
| 10 | |||||||
| 11 | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | |
| 12 | |||||||
| 13 | |||||||
| 14 | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | Trasferimento | |||
| 15 | |||||||
| 16 | |||||||
| 17 | |||||||
| 18 | Trasferimento | Trasferimento | |||||
| 19 | |||||||
| 20 | |||||||
| 21 | |||||||
| 22 | Trasferimento | ||||||
Tabella 2: pianificazione per le durate della vita condotta a temperature diverse. Struttura schematica dei passaggi necessari per impostare vasto-gamma DR durata esperimenti a diverse temperature usando ceppi di daf-7(-) e wild type come esempi. Il numero di trasferimenti per piatti freschi di ogni livello sperimentale cibo diminuisce all'aumentare della temperatura. Questo è in conto il fatto che gli animali alle più alte temperature stanno invecchiando più rapidamente e così un più incline a danni fisici per il trasferimento.
| Giorni | IMA |
Tabella 3: pianificazione per l'imaging pipeline. Struttura schematica dei passaggi necessari per impostare la pagina di vasto-gamma DR esperimenti utilizzando ceppi reporter trascrizionale fluorescente in sfondi daf-7(-) e wild type a temperature diverse come esempi di imaging.
Discussion
Qui, presentiamo un nuovo metodo per restrizione dietetica che incapsula una gamma molto più vasta delle concentrazioni di cibo protocolli precedentemente pubblicati. Questo metodo collega due fenomeni precedentemente separati visti nella letteratura DR c. elegans , privazione batterica e restrizione dietetica classica, permettendo entrambi effetti dietetici essere studiato sotto un unico protocollo. Utilizzando il nuovo paradigma di vasto-gamma DR, presentiamo un quadro generale per esaminare la singola cella espressione genica in risposta a un segnale ambientale specifico e determinare come questa cella codifica le informazioni. Il nostro framework è costituito da due protocolli sperimentali che illustrano come eseguire le durate della vita e imaging quantitativo, rispettivamente, sotto vasto-gamma Dr. Data da questi protocolli sperimentali quindi possono essere esaminato con l'analisi computazionale fornite in Questo quadro di quantificare le informazioni codificate dai cambiamenti in livelli di espressione genica o le durate della vita attraverso condizioni di cibo diverso.
Durata della vita esperimenti utilizzando vasto-gamma DR paradigma riguardano sei livelli distinti di cibo (tabella 1). Ciò richiede un approccio più laborioso rispetto all'esame di longevità sotto meno livelli di cibo, come privazione dietetica10,11 o utilizzando il background genetico di mangiare-2 35. Tuttavia, esaminando a durata della vita sotto una sola condizione può limitare le interpretazioni del ruolo di un gene in DR. Ad esempio, recentemente abbiamo mostrato che mutanti daf-7 hanno un'attenuazione bidirezionale della risposta alla concentrazione di cibo rispetto al wild-type animali12 (Figura 1A). In assenza di cibo, mutanti daf-7 visualizzano un accorciamento della loro vita utile rispetto agli animali wild-type. Se avevamo considerato solo privazione dietetica, verrebbe interpretato che il gene daf-7 come necessarie per l'estensione di durata della vita, solo quando in realtà è più complesso ruolo di daf-7 . Pertanto, il risultato critico di questa parte del protocollo è stabilire se un gene di interesse è coinvolto nel modulare la risposta complessiva della durata della vita ai cambiamenti in abbondanza di cibo.
Uno dei principali vantaggi di questo protocollo rispetto ad altri metodi è che utilizza un nuovo metodo per eliminare la produzione di progenie negli animali in fase di analisi di durata della vita. Maggior parte degli studi usare la droga FuDR per inibire la proliferazione della linea germinale in adulti rendendoli sterili. Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato FuDR trattamento può avere effetti di condizione - e gene-specifico durata17,18,19,20,21, rimettere in domanda relativa applicabilità generale. In questo protocollo, eliminazione della produzione di progenie è raggiunto attraverso una 24h trattamento degli animali con targeting per il gene di uovo-5 , che inibisce la formazione del guscio d'uovo chitina di RNAi fecondati ovociti di c. elegans conseguente loro 22,di morte23. Il vantaggio di questo metodo è che è molto tardi-acting e quindi non interferisce con la linea germinale, che è dei principali regolatori della longevità in c. elegans.
Un avvertimento potenziale del protocollo DR vasto-gamma è sua dipendenza l'uso degli antibiotici per controllare la proliferazione batterica per garantire uno stretto controllo della concentrazione batterica. Proliferazione batterica all'interno dell'intestino del worm è conosciuta per essere delle principali cause di morte nei elegans del c.16. Pertanto, l'uso di antibiotici batteriostatici, quali carbenicillina, in agar NGM previene la proliferazione batterica e aumenta la durata della vita di vermi rispetto ai controlli non-antibiotico16. Alcuni tipi di antibiotici, quali rifampicina36 e membri del tetraciclina famiglia37,38, sono stati indicati per estendere la durata della vita in c. elegans indipendentemente dal loro effetto sul batterica proliferazione. Tuttavia, non c'è alcuna evidenza in letteratura che carbenicillina o streptomicina può aumentare la longevità indipendentemente dal loro effetto sulla proliferazione batterica.
Durata della vita può essere visto come l'output di un calcolo complesso dove informazioni ambientali, indirizzati da espressione genica nelle reti neuronali, vengono trasmessi alla fisiologia. Il nostro protocollo fornisce una metodologia per comprendere come specifici geni influenzano questo flusso di informazioni ambientali. Per rispondere a questa domanda, abbiamo bisogno di elaborazione affidabile per determinare la distribuzione delle risposte di espressione genica a livello di singola cellula. Essere in grado di stimare non solo la risposta media di espressione genica per cambia in abbondanza di cibo ma anche la distribuzione statistica completa da grandi popolazioni rappresenta un requisito importante per l'applicabilità del nostro metodo. Questa accurata descrizione delle risposte di espressione genica di abbondanza alimentare consente all'applicazione della teoria dell'informazione di quantificare le informazioni codificate dai neuroni specifici, nonché la strategia di codifica impiegato da circuito neurale.
Gli aspetti computazionali e imaging dei metodi descritti in questo protocollo sono applicabili a un insieme maggiore di contesti biologici. Nel nostro lavoro, ci siamo concentrati su una piccola rete neurale coinvolta nel cibo di rilevamento, tuttavia, l'analisi delle funzionalità di elaborazione delle informazioni non sono limitati a uno specifico tipo cellulare o specifici stimoli ambientali. In futuro, queste metodologie potenzialmente possono essere esteso a una più ampia varietà di variabili di input, che interessano qualsiasi output fisiologico. Questi approcci contribuirà ad una maggiore comprensione di come codificare reti di regolazione genica, processo e trasmettere informazioni.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i laboratori Bargmann e Horvitz per reagenti. Alcuni ceppi sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall'ufficio di NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440). Ringraziamo anche M. Lipovsek per commenti sul manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal Wellcome Trust (progetto Grant 087146 a Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 e 1/M00757X/BB per Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 a Q.C.), US National Institutes of Health (R01AG035317 e R01GM088333 a H.L.) e Stati Uniti National Science Foundation (0954578 a H.L., 0946809 GRFP a M.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin di-Sodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-5G | Antibiotic |
| Streptomycin Sulphate salt | Sigma-Aldrich | S6501-50G | Antibiotic |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758-10G | Inducer for RNAi plates |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 71380-1KG-M | Used in S basal, and NGM agar |
| di-Potassium Hydrogen Phosphate(K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1.05104.1000 | Used in S basal, and NGM agar |
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791-1KG | Used in S basal, and NGM agar |
| Magnesium Sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M2643-1KG | Used in NGM agar |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | Used in NGM agar |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 71687-500G | Used for bleaching |
| Pluronic-F127 | Sigma-Aldrich | P2443-1KG | Used in imaging |
| Sodium Hypochlorite (NaClO) | Sigma-Aldrich | 1.05614.2500 | Used for bleaching |
| LB Broth | Invitrogen | 12780052 | Used to grow bacteria |
| Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 628960 | Plates for lifespan |
| CellStar 10cm Tissue Culture plates | Greiner Bio-One | 664160 | Plates for imaging |
| Low Retention P200 tips | Brandt | 732832 | Tips for handling worms in liquid |
| Agar | BD | 214510 | Agar for NGM, RNAi and NSC plates |
| Bacto-peptone | BD | 211820 | Peptone for NGM, RNAi and NSC plates |
References
- Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. The sensory system: More than just a window to the external world. Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159 (2015).
- Calhoun, A. J., et al. Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans. Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span--from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
- Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376 (2017).
- Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701 (2011).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS ONE. 4 (2), 4535 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media. Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152 (2009).
- Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. -Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Lee, G. D., et al. Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).
- Entchev, E. V., et al. A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan. elife. 4, 06259 (2015).
- Diana, G., et al. Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit. elife. 6, (2017).
- Shannon, C. E. A Mathematical Theory of Communication. Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans). Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).
- Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition. Cell. 139 (3), 560-572 (2009).
- Parry, J. M., et al. EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans. Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Crane, M. M., et al. Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis. Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhan, M., et al. Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans. PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194 (2015).
- Duong, T. Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R. Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21 (2007).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).
- Cover, T. M., Thomas, J. A. Elements of information theory. , Wiley. (2006).
- Tkacik, G., Walczak, A. M. Information transmission in genetic regulatory networks: a review. J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102 (2011).
- Arimoto, S. An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels. IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).
- Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks. Science. 334 (6054), 354-358 (2011).
- Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. Synergy, redundancy, and independence in population codes. J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).
- Golegaonkar, S., et al. Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
