Summary
Beschrijven we een protocol voor het meten van transmigratie door monocyten over menselijke endothelial monolayers en hun daaropvolgende rijping in schuim cellen. Dit biedt een veelzijdige methode te beoordelen van de atherogene eigenschappen van monocyten geïsoleerd uit mensen met verschillende ziekten en te evalueren van factoren in het bloed die deze neiging kunnen versterken.
Abstract
Coronaire hartziekten (CAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Atherosclerose, een toonaangevende veroorzaken van CAD-, wordt geïnitieerd door de transmigratie van aangeboren immuun monocyten naar inflammatoire sites van gedeponeerde lipide vettige strepen, die aanwezig in arteriële muren van medium tot grote arteriën zijn genoemd. De pathogene spil van laesies in dit vroege stadium van atherosclerose is de rijping van monocyten die naar slagaders migreren om schuim cellen of lipide-beladen macrofagen. Aanzienlijke bewijs ondersteunt de hypothese dat risico van atherosclerose wordt verhoogd met chronische inflammatoire aandoeningen begeleidende ziekten zoals reumatoïde artritis en HIV, evenals algemene vergrijzing, en dat dit risico wordt voorspeld door monocyt activering. Hoewel Muismodellen een goed platform bieden voor het onderzoek naar de rol van monocyten in atherogenese in vivo, ze genetische wijziging van natuurlijke cholesterol metabolisme en drastische wijziging van normale muis diëten vereisen, en hebben beperkte geschiktheid voor de studie van atherogene invloeden van menselijke comorbide aandoeningen. Dit motiveerde ons om een menselijke in vitro model voor het meten van het atherogene potentieel van monocyten geïsoleerd uit personen met een bepaalde ziekte staten te ontwikkelen. Op dit moment beperken menselijke in vitro modellen in die zin dat zij monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming in isolatie evalueren. Hier beschrijven we een protocol waarin monocyten geïsoleerd uit patiënt bloed transmigrate over menselijke endotheliale cellen in een matrix van de collageen type 1 en hun neiging om te rijpen in schuim cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene lipide wordt gemeten. Het protocol is gevalideerd voor het gebruik van menselijke monocyten gezuiverd van personen met HIV-infectie en ouderen HIV niet geïnfecteerde individuen. Dit model is veelzijdig en kunt monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming te worden geëvalueerd met behulp van beide microscopie of stroom cytometry evenals waardoor de beoordelingvan atherogene factoren in serum of plasma.
Introduction
Monocyt transmigratie is een cruciale stap in de ontwikkeling van atherosclerotische plaque die tot trombose, beroerte en een hartinfarct leiden kan. Atherosclerotische plaques ontwikkelen van vettige strepen, over het algemeen aanwezig op sites van lage oscillerende bloedstroom in middelgrote tot grote arteriën, waar gedeponeerde lipide bijdraagt tot activering van het endotheel en een gelokaliseerde ontsteking1. Monocyten worden gerekruteerd voor endotheliale cellen in vettige strepen via monocyt Chemotactische eiwitten (zoals CCL2) en transmigrate in de intima-2. Naar aanleiding van zielsverhuizing, kunnen monocyten uitmaken atherogene, lipide-beladen macrofagen oftewel schuim cellen ten gevolge van lipide opname, lipide synthese, down-regulatie van cholesterol efflux of een combinatie van bovengenoemde factoren. Monocyten kunnen ook accumuleren lipiden in het verkeer en hebben een 'schuimend' fenotype, eventueel predisponerende cellen voor schuim-cel formatie3,4. Schuim cellen zijn de definiërende eigenschap van vettige strepen en beginnende atherosclerotische plaques en hun vorming wordt beïnvloed door zowel lipide en inflammatoire mediatoren5. Als alternatief, monocyten hebben de mogelijkheid om reverse transmigrate van de slagader in de bloedbaan6, daardoor verwijderend lipide van de intima en handelen om de gezondheid van de slagader.
Bepaling van de neiging van monocyten naar transmigrate over arteriële endotheel en formulier schuim cellen in de intima, of om te keren transmigrate en voeren lipide uit de plaque, is een basisvereiste voor het begrijpen van de rol van monocyt activering in toenemende atherosclerotische risico. Muismodellen voor CADs zoals atherosclerose zijn belangrijk in het ophelderen van real-time in vivo informatie over vette streep/atherosclerotische plaque ontwikkeling. Echter, deze modellen vereisen een genetische verandering van de natuurlijke cholesterol verwerking capaciteiten van deze dieren meestal in combinatie met drastische veranderingen in het dieet (zoals het ApoE-/-Western-type dieet model)7,8, daardoor, inducerende niet-fysiologische accumulatie van circulerende lipide niveaus welke schijf plaque ontwikkeling. Deze modellen bieden slechts beperkte relevantie voor chronische inflammatoire menselijke aandoeningen zoals HIV-infectie die niet geassocieerd met verhoogd circuleert cholesterol of low-density lipoprotein (LDL) niveaus. Bovendien verschillen in monocyt biologie tussen mensen en muizen maken het testen van immunologische vragen met betrekking tot de relevantie van de subpopulaties van monocyten (zoals tussenliggende monocyten (CD14++CD16+))9 moeilijk. Dit is belangrijk bij de studie van de mechanismen die rijden van hart-en vaatziekten, zoals de graven van de tussenliggende monocyt onafhankelijk cardiovasculaire gebeurtenissen10,11 voorspellen. Hoewel testen bestaan voor het sequentieel meten van beide monocyt transmigratie of schuim celvorming in isolatie, is geen in vitro -assay gevalideerd voor het kwantificeren van beide aspecten van vroege atherogenese met behulp van dezelfde cellen van klinische cohorten. Transwell modellen gebruiken een gemodificeerde Boyden twee-kamer systeem waarbij cellen worden geladen in de bovenste kamer en transmigrate over een cel enkelgelaagde of poreuze plastic barrière in een tweede kamer die meestal media met chemoattractant12 bevat , 13. terwijl op grote schaal gebruikt voor het analyseren van leukocyten zielsverhuizing, deze modellen een laag vertegenwoordigen de intima, resulterend in transmigrated cellen migreren naar oplossing, in het algemeen niet te nemen en niet toegestaan voor de meting van schuim cel vorming of omgekeerde transmigratie van dezelfde cellen. Daarentegen modellen van de celvorming schuim geen rekening met eventuele transmigratory-geïnduceerde veranderingen monocyten of effecten van endothelial activering waarvan bekend is dat de bijdragen aan het schuim cel formatie14. Bovendien, deze systemen veroorzaken schuim celvorming van macrofagen aangehangen door de toevoeging van het verzadigen van de concentraties van exogene geoxideerde low-density lipoprotein (oxLDL)15,16, een belangrijke inductor cel cultuur platen van schuim celvorming. LDL gebruikt in deze modellen is vaak geoxideerd door niet-fysiologisch-relevante processen zoals CuSO4 behandeling17, daarom vraagtekens bij het fysiologisch belang van studies met behulp van deze modellen.
Hier beschrijven we een bepaling die kwantificeert monocyt zielsverhuizing en celvorming schuim van dezelfde cellen die vereist niet de toevoeging van exogene oxLDL, dus beter de modellering van de rol van monocyten in schuim celvorming. Dit model werd oorspronkelijk ontwikkeld door Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, en heeft zijn verder verfijnd in ons laboratorium te beoordelen ex vivo de atherogenicity van monocyten geïsoleerd onder niet-activeren voorwaarden van individuen met onderliggende inflammatoire voorwaarden begeleidende ziekten zoals HIV infectie19 evenals vergrijzing20, die zijn geassocieerd met een verhoogd risico van atherosclerose. Dit model biedt ook een platform voor het beantwoorden van elementaire biologische vragen over de neiging van verschillende monocyt deelverzamelingen formulier schuim cellen20, de invloed van endothelial activering door cytokines zoals TNF op schuim celvorming14 , de trekkende eigenschappen van monocyten zoals de diepte en snelheid van de zielsverhuizing in gels19. Bovendien, monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming kan worden gekwantificeerd aan de hand van standaard microscopie, live cel imaging, stroom cytometry en imaging stroom cytometry, daarom bieden een veelzijdige methode om te evalueren van de rol van monocyten in atherogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: alle experimenten met behulp van de menselijke biologische monsters werden uitgevoerd met goedkeuring van de ethiek van de Alfred ziekenhuis menselijke ethische Commissie, Melbourne. Alle experimenten werden uitgevoerd in klasse II bioveiligheid kasten, tenzij aangegeven. " Prewarmed " verwijst naar reagentia opgewarmd tot 37 ° C in waterbaden.
1. voorbereiding van Type I vezelig collageen Gels: dag 1
- voorbereiden polymeervorm collageen gels door sequentieel toevoegen en mengen van 35.7 mM NaOH, 0.71 x M199, 4.58 mM azijnzuur en 1,71 mg/mL typ ik vezelig collageen in een polystyreen 5 mL buis volgens tabel 1.
Opmerking: Zorg ervoor dat het collageen goed gemengd is door pipetteren zachtjes op en neer 5 keer om te stoppen met de vorming van collageen ' zakken ' in het mengsel van de gel. Bereiden van 4-6 gels per testvoorwaarde voor microscopie of 15 gels per testvoorwaarde voor stroom cytometry. - Nou eenmaal gemengd, aliquoot 50 µL van collageen gel mengsel in ieder putje van een steriele platbodem weefselkweek van de 96-wells-plaat. Gebruik niet de buiten rijen en kolommen, maar vul deze met 200 µL van 1 x Dubecco ' s fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) de gels beschermen tegen uitdroging. Incubeer de platen bij 37 °C/5% CO 2 gedurende 2 uur om het collageen te polymeriseren.
Opmerking: Plaats de platen direct op schone metalen rekken in de incubator om gelijkmatige warmteverdeling. - Na incubatie, bedekken de gels met 150 µL 1 x aangevuld M199 (Zie Tabel van materialen) en incubeer gedurende 5 dagen tot gebruik.
2. Uitbreiding van de opgeslagen HUVEC: dag 1
- Label en vacht een 10 cm diameter petrischaal met 50 µg Mo/mL fibronectine 1 mL verdund in 1 x PBS en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
- Dooi aliquots van cryopreserved primaire menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC, 1.0 x 10 6 cellen) 10 ml M20.
Opmerking: HUVEC moet worden voorbereid als eerder 21 beschreven en op een lage passage-nummer gebruikt (< passage 4). HUVEC vervangen kan worden door menselijke coronaire endotheliale cellen hier. - HUVEC 10 ml M20 resuspendeer en voeg toe aan fibronectine gecoate schotel, zuigen overtollige fibronectine vóór toevoeging van cellen, en cultuur tot samenkomst (ongeveer 5 dagen), ter vervanging van de media op dag 3.
3. Kweken van HUVEC enkelgelaagde op collageen Gels: dag 5
- op dag 5, loskoppelen HUVEC door zuigen cultuur supernatant van de petrischaal en wegwassen van serum-bevattende media met 10 mL serumvrij M199.
- Voeg toe 5 mL 0,05% trypsine/0,53 EDTA in M199 aan HUVEC en incubeer gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur, zachtjes schudden tot de cellen loskoppelen.
- Zodra vrijstaand, snel afspoelen petrischaal met 5 mL M20 en overdracht van de media met cellen die een tube 10 mL.
- Centrifuge monsters bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gecombineerd supernatant resuspendeer de cellen in 200 µL van de M20 en tellen van cellen met behulp van een hemocytometer.
- Resuspendeer de cellen aan 2.0 x 10 5 cellen/mL in M20, gecombineerd de M199 op de gels van de 96-wells-plaat (stap 1.3) en voeg 100 µL van de geresuspendeerde HUVEC (2.0 x 10 4 cellen) aan elke collageen gel bereid boven (stap 1.2). Cultuur platen voor een verdere 3 dagen bij 37 °C/5% CO 2.
Opmerking: De integriteit van de HUVEC enkelgelaagde misschien na 3 dagen door zilvernitraat kleuring van 22 of immunohistochemistry voor strakke junction eiwitten 23 in dit stadium worden bevestigd. Extra gels moeten worden voorbereid voor dit doel.
4. Activering van HUVEC enkelgelaagde en isolatie/activering van monocyten voor transmigratie: dag 8
- op dag 8, elke HUVEC enkelgelaagde voordat het prestatiemeteritembestand van monocyten activeren door het aspirating van de M20 media bedekken de gels en het toevoegen van de 100 µL van 10 ng/mL menselijke TNFα in M20 per gel. Incubeer bij 37 °C/5% CO 2 voor 4 h.
Opmerking: Niet-geactiveerde HUVEC voorwaarden kunnen ook worden opgenomen als vereist als besturingselementen. - Tijdens de 4 h HUVEC activeringsstap, isoleren monocyten van PBMCs met behulp van magnetische bead technieken negatief selecteren voor cellen volgens de fabrikant ' s instructies. Een minimum van 6,5 x 10 6 PBMCs tijdens deze stap moet worden gebruikt om op betrouwbare wijze herstellen 3.0 x 10 5 monocyten vereist voor één voorwaarde, als monocyten doorgaans goed voor ongeveer 10-15% van PBMCs.
Opmerking: Om te evalueren van het effect van monocyt activering vóór monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming, monocyten kunnen geactiveerd worden in dit stadium. Monocyten kunnen worden geïsoleerd uit ontdooide PBMCs indien nodig (dwz, opgeslagen patiënt monsters). Monocyt deelverzamelingen geïsoleerd door FACS sorteren kunnen worden voorbereid voor toevoeging aan gels (Figuur 1).
5. Transmigratie van primaire menselijke monocyten: dag 8
- te meten van monocyt zielsverhuizing, verwijder TNFα-bevattende media en wassen gels tweemaal met 100 µL M199 door toe te voegen en te verwijderen van de media. Na wassen, toevoegen 2.0 x 10 5 vers geïsoleerd of ontdooid en gewassen cryopreserved PBMCs of 5.0 x 10 4 vers geïsoleerd monocyten of gezuiverd monocyt deelverzamelingen te HUVEC monolayers in 100 µL M20. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 om de voorwaartse transmigratie van monocyten in de gel. Het is het beste om 6 putten voor elke experimentele conditie onderzocht.
Opmerking: Om te evalueren van het effect van autologe serum op zielsverhuizing en schuim celvorming, Incubeer de cellen met M20 met de gewenste concentratie van warmte-geïnactiveerd donor serum en vergelijk met voorwaarden met een besturingselement gepoolde menselijk serum. Leukocyten dan monocyten kunnen worden toegevoegd in dit stadium. Als het onderzoeken van het effect van specifieke lipiden/lipide soorten (bijvoorbeeld HDL, oxHDL), alle volgende stappen uitvoeren met serumvrij medium met 20-50 µg Mo/mL lipiden. - Na 1 h van de voorwaartse zielsverhuizing, verzamelen de cellen niet-transmigrated door het wassen gels tweemaal met 100 µL voorverwarmde 1 mM EGTA in 1 x PBS, en eenmaal met 100 µL M199 (hetzelfde Centrifugeer voorwaarden), bundeling van het supernatant van elk putje van de zelfde experimentele conditie (meestal 6 wells) in een 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs. Centrifugeer de cellen niet-transmigrated bij 4 ° C, 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer in 30 µL 1 x PBS.
- Cellen verzameld in de bovendrijvende vloeistof om te bepalen van het aantal voorwaartse transmigrated cellen tellen.
- Het percentage voorwaartse transmigrated cellen wordt als volgt bepaald:
- dekking van de gewassen gels met transmigrated cellen met 100 µL M20 en incubeer gedurende een verdere 48 h.
- Na 48 h, verzamelen het supernatant en wassen niet-transmigrated cellen tweemaal met 100 µL voorverwarmde 1 mM EGTA/PBS, verzamelen en bundelen het supernatant van elke voorwaarde zoals in stap 5.2.
Opmerking: Het fenotype van omgekeerde transmigrated cellen kan worden getest op deze cellen fdrijfscombinati standaard stroom cytometry kleuring protocollen. - Centrifugeren cellen bij 4 ° C, 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer de cellen in 30 µL 1 x PBS. Cellen tellen en bepalen de levensvatbaarheid via trypan blauw kleuring.
- Bepalen het percentage van de omgekeerde transmigrated cellen met behulp van de volgende vergelijking:
Opmerking: Accounting voor het totaal aantal voorwaartse transmigrated cellen een meer nauwkeurige indicatie van de omgekeerde zielsverhuizing geeft aangezien er onwaarschijnlijk voorwaartse transmigratie zal worden 100%. - Voor analyse door microscopie, bevestigen de gels door 100 µL 2% formaldehyde (eindconcentratie) toe te voegen aan elk putje, dekken de platen in aluminium folie en bewaren bij 4 ° C tot analyse. Voor stroom cytometry, niet positiebepaling naar de cellen in dit stadium. De protocollen hieronder microscopie (punt 6) of stroom cytometry (sectie 7) analyse zien.
Let op: Formaldehyde is giftig en corrosief; gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Zorg moet worden genomen bij het toevoegen van formaldehyde, echter deze stap hoeft niet te worden uitgevoerd in een zuurkast te wijten aan de lage concentratie gebruikt.
6. Kwantificatie van schuim-cellen en macrofagen door microscopie (olie-Red O vlek)
- verwijderen van de formaldehyde en wassen van de gels met 100 µL van 50% (v/v) methanol gedurende 5 minuten en dan 100 µL 78% (v/v)-methanol voor 15 min.
Opmerking: De kleuring stappen kunnen worden uitgevoerd op de laboratorium-Bank en niet in een kast van klasse II Biohazard. - Vlek voor lipide druppeltjes door toe te voegen 100 µL van vers bereide 0,2% (m/v) olie-Red O (Zie Tabel van materialen voor details) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- De overtollige vlek verwijderen door te wassen de gels 4 keer met 100 µL van 78% (v/v) methanol, zuigen en teruggooi van het supernatans dat na elke wash.
- Counterstain voor 15 minuten bij kamertemperatuur met 100 µL van de Giemsa, verdund 1:10 in gedestilleerd water.
- Gecombineerd de Giemsa-kleuring en gels keer met water wassen.
- Als u wilt loskoppelen van de gels van de plaat, rim de putjes met behulp van een naald 21 G, met de schuine kant naar buiten gericht, op de rand van de gel.
- Voor montage van de gels op een microscoopglaasje, punch twee gaten (6.35 mm doorsnede) in een strook 2,54 cm x 1,5 cm voor dubbelzijdige tape. De tape aan de zijkant van een standaard Microscoop vast en verwijder de beschermende coating van de boven.
- Toevoegen een druppel water om de gaten in de tape met behulp van een precisiepipet overdracht. Met pincet, zachtjes overbrengen gels de gaten in de tape en bedek met een grootte van 1,5 glas dekglaasje aan. Druk zachtjes op het dekglaasje aan te houden het op tape.
- Onderzocht met differentiële interferentie contrast helder-veld microscopie met behulp van 40 X doelstelling op een omgekeerde microscope.
- Brengen de HUVEC enkelgelaagde in focus op 40 X vergroting en blader ' in ' de gel, tellen macrofagen/schuim cellen gedurende de gehele diepte van de gel. Herhaal voor drie verschillende gezichtsveld gelegen op vergelijkbare afstanden vanaf de rand van de gel om te minimaliseren mogelijk randeffecten. Hierdoor zullen de diepte van de gel is consistente tussen regio's tellen.
Opmerking: Score cellen in de gel als beide cellen schuim (gedefinieerd als cellen met > 1/3 van hun cytoplasma als olie-Red O gekleurd lipide druppels) of macrofagen binnen 2 uur voor montage op dia's ( Figuur 2). Schuim celvorming wordt uitgedrukt als het percentage van schuim cellen ten opzichte van het totale aantal gemigreerde cellen en de mediane graven in 3 gezichtsveld onderzocht voor 6 gels per aandoening, dus een gemiddelde van 18 metingen per voorwaarde wordt uitgedrukt. Een voorbeeld van ruwe cellen van een typisch experiment is weergegeven in tabel 2.
Opmerking: Een cel te classificeren als een schuim cel vs macrofaag door microscopie is subjectief en bijgevolg kunnen afhankelijk van de onderzoeker. In klinische studies, waar experimenten worden uitgevoerd over een langere periode van tijd, is het belangrijk voor het tellen van alle verblind door een enkele onderzoeker worden uitgevoerd. Voorbeelden van schuim-cellen en macrofagen in gels vindt u in Figuur 2.
- Brengen de HUVEC enkelgelaagde in focus op 40 X vergroting en blader ' in ' de gel, tellen macrofagen/schuim cellen gedurende de gehele diepte van de gel. Herhaal voor drie verschillende gezichtsveld gelegen op vergelijkbare afstanden vanaf de rand van de gel om te minimaliseren mogelijk randeffecten. Hierdoor zullen de diepte van de gel is consistente tussen regio's tellen.
7. Analyse van Transmigrated cellen door Stroom Cytometry
- fenotypische karakteriseren schuim-cellen en macrofagen na migratie van de signaalcomplexen, de gels door toevoeging van 100 µL van 37 ° C voorverwarmde 1 mg/mL collagenase D verdund in M199 te verteren elk goed en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C/5% CO 2.
Opmerking: Plaats de 96-wells-platen rechtstreeks op schone metalen rekken in de incubator om gelijkmatige warmteverdeling. - Na incubatie, de gels met behulp van een pipet tip van 200 µL maceraat en incubeer gedurende een verdere 20 min op 37 °C/5% CO 2.
- Eenmaal volledig verteerd, filter en zwembad de verteerd repliceren gels via 35 µm nylon mesh afgetopte FACS buizen geplaatst op ijs, en wassen eenmaal met FACS wassen (Zie tabel van materialen) bij 4 ° C, 300 x g. resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS Wash.
- Broeden de resulterende cellen met fluorophore-geconjugeerde antilichamen specifiek voor CD45, een leven/dood cel marker en oppervlak/intracellulaire fenotypische of functionele merkers van belang met behulp van standaard stroom cytometry protocollen.
Opmerking: Bereiden controle buizen schadevergoeding met behulp van de juiste fluorophores en Ig compensatie kralen. Uitgepakte cellen kunnen ook worden verzameld in glas dia's voor immunofluorescentie microscopie door cytospinning. Anderzijds hebben we met succes verzameld cellen met behulp van dit protocol voor beoordeling via imaging stroom cytometry. - Cellen met behulp van een stroom cytometer verwerven en uitvoeren van compensatie overeenkomstig.
Opmerking: Aangezien schuim cellen/macrofagen niet afzonderlijke populaties met lichte scatter eigenschappen vormen en aanzienlijk verschillen in grootte en vorm kan kunnen, ingesteld liberale voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) poorten om te vangen alle gemigreerde cellen zoals in < sterke class = "xfig" > figuur 3A. - Na overname, het uitvoeren van de gegevensanalyse met behulp van stroom cytometry software. Om te identificeren gemigreerde cellen, selecteert u eerst cellen als negatief voor de live/dead-markering zoals weergegeven in figuur 3B. Volgende, het uitvoeren van een eencellige discriminatie door het creëren van een strakke hek rond de cellen weergegeven op een perceel van SSC-gebied vs SSC-hoogte.
- Selecteer CD45 + cellen en de grote bevolking van gemigreerde cellen in een proefvlak FSC/SSC poort als deze zijn de macrofagen/schuim cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kwantificeren van monocyt zielsverhuizing
Monocyten worden toegevoegd aan het model zoals beschreven in Figuur 1en zes gels zijn bereid voor elke voorwaarde. Monocyten voor 6 gels per donor (dat wil zeggen, 5.0 x 104 monocyten per gel 6 gels = 3.0 x 105 monocyten per donor) geresuspendeerde zijn tot een eindvolume van 600 µL van M199 media met de lipide vereist serum/geïsoleerd. Cellen (dwz, 100 µL per gel = 5.0 x 104 monocyten) zijn vervolgens aliquoted op gels en bebroede zoals hierboven voor 1 h om monocyt transmigratie. Naar aanleiding van zielsverhuizing, niet-transmigrated cellen worden meegeteld als hierboven. In dit voorbeeld is 1.5 x 104 niet-transmigrated cellen werden teruggevonden. Het percentage van de voorwaartse zielsverhuizing werd bepaald met behulp van de formules in stap 5.4 beschreven:
Na 48u van incubatie, 3.6 x 104 omgekeerde transmigrated cellen werden teruggevonden zoals hierboven. Het percentage van de omgekeerde zielsverhuizing werd bepaald met behulp van de formule in stap 5.8:
Voorwaartse en omgekeerde transmigratie kan worden vergeleken tussen voorwaarden met behulp van de passende statistische proeven en monocyten van meerdere onafhankelijke donoren bereid om te bepalen of de mogelijkheid van de zielsverhuizing monocyt is gewijzigd tussen experimentele voorwaarden.
Beoordelende schuim celvorming
Helderveld microscopie
Lipoproteins van de geoxideerde staan bekend om monocyt-afgeleide schuim cel formatie in vitro in vergelijking met niet-geoxideerde lipiden15. Hier bevestigen wij dat de behandeling van monocyten met oxLDL, gebruikte voor het opwekken van schuim celvorming in conventionele schuim cel inductie modellen, celvorming monocyt-afgeleide schuim in dit model van signaalcomplexen migratie en schuim celvorming bevordert in vergelijking met inheemse LDL. Na monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming in gels geïncubeerd met M199 met 50 µg Mo/mL native of CuSO4-LDL geoxideerd (zie stap 5.1, Figuur 1), cellen werden geanalyseerd door microscopie. Voorbeelden van schuim-cellen en macrofagen waargenomen in representatieve experimenten zijn afgebeeld in Figuur 2. Cellen werden geteld in drie verschillende velden per gel, door zich te concentreren op de HUVEC enkelgelaagde en geleidelijk dieper gericht in de gel. De graven van de cel zijn opgenomen voor elke donor zoals weergegeven in tabel 2 voor een enkele donor, vergelijk het percentage schuim cellen gevormd in reactie op geoxideerd en inheemse LDL. Statistische gegevens van n = 12 onafhankelijke tellingen worden weergegeven in Figuur 4 om te bevestigen dat incubatie van monocyten met oxLDL in dit model induceert meer schuim celvorming dan voorwaarden waar monocyten worden geïncubeerd met inheemse LDL of M199 media alleen.
Stroom cytometry
Om te bepalen van het fenotype van gemigreerde cellen, zijn de cellen geëxtraheerd uit verteerd gels en gelabeld met behulp van een standaard stroom cytometry paneel. Cellen waren gelabeld met een live/dode cel marker en antilichamen specifiek voor CD45 en andere oppervlakte fenotype markeringen met behulp van standaard stroom cytometry protocollen. Compensatie besturingselementen moeten ook voorbereid zijn op volledige vergoeding volgens standaard stroom cytometry technieken. Gemigreerde cellen zijn omheinde zoals afgebeeld in Figuur 3 op de percelen die representatief zijn voor 10 onafhankelijke experimenten. Levende cellen zijn gated met behulp van live/dode cel levensvatbaarheid assays (figuur 3B) en paren zijn uitgesloten door eencellige analyse (Figuur 3 c). Cellen worden vervolgens gated als CD45+ om uit te sluiten van HUVEC (zoals deze cellen CD45 zijn-, figuur 3D). De grote bevolking is vervolgens gated door voorwaartse scatter/kant scatter discriminatie (figuur 3E) en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI's) van de receptoren van belang worden bepaald ten opzichte van beide fluorescentie min één (FMO) of isotype controleren) Figuur 3F) om te bepalen van de expressie (ΔMFI) of percentage positieve cellen.
Figuur 1 : Een in vitro model van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming. (A) de PBMC, (B) totale monocyten of (C) FACS-gesorteerd monocyt deelverzamelingen worden toegevoegd typt ik vezelig collageen gels gevormd in 96-wells-platen en bedekt met een enkelgelaagde van geactiveerde primaire menselijke navelstreng Vein endotheliale cellen (HUVEC), waarvan de integriteit kan worden beoordeeld door silver kleuring van (D) en toegestaan tot en met (E) transmigrate gedurende 1 uur in aanwezigheid van serum of lipide met media. Non-transmigrated cellen zijn geteld (F) en gels worden geïncubeerd voor een verdere 48 uur met de dezelfde serum/lipide met media. Na de incubatie, (G) reverse gemigreerde cellen worden geteld en het percentage schuim cellen vs. macrofagen in de gel wordt bepaald door (H) fase contrast microscopie na kleuring met olie-Red O of de fenotype van gemigreerde cellen wordt bepaald door (ik) stroom cytometry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbeelden van schuim-cellen en macrofagen in een in vitro model van monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming. RepresentatIve voorbeelden van scoorde zoals schuim (witte pijlen) cellen-cellen en macrofagen (zwarte pijlen) na Giemsa-kleuring om te visualiseren cellen en olie-Red O vlekken te visualiseren lipide druppels zoals bepaald door de fase contrast microscopie van uitgepakte gelen met behulp van een omgekeerde Microscoop op 40 X vergroting. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Strategie van transmigrated cellen door stroom cytometry gating. Transmigrated cellen zijn fenotypische gekenmerkt door stroom cytometry na extractie van cellen van gels. Cellen zijn gated door (A) FSC/SSC, levende cellen (B), (C) afzonderlijke cellen, (D) CD45+, FSC/SSC (E) en (F) uitdrukking van receptor in vergelijking met isotype of fluorescentie minus één (FMO) controle. Expressie van receptoren van belang zijn gedefinieerd als de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) en uitgedrukt ten opzichte van de niveaus van isotype. ΔMFI = vlek (MFI) minus isotype/FMO controle (MFI's). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Effect van exogenously toegevoegde oxLDL en LDL op monocyt-afgeleide schuim celvorming. Schuim celvorming is bepaald onder omstandigheden waar monocyten van een enkele donor worden geïncubeerd met media (M199) niet 50 µg Mo/mL-geoxideerde low-density lipoprotein (LDL) of koper (II) sulfaat geoxideerd LDL (oxLDL) toegevoegd aan gels na transmigratie. Graven voor 12 verschillende sites worden weergegeven. Schuim cellen worden uitgedrukt als het percentage van totaal aantal gemigreerde cellen. Mediaan en interquartile bereiken worden weergegeven in bar grafieken en vergelijkingen werden gemaakt met behulp van niet-parametrische Mann-Whitney U toetsen. p < 0.001, *** p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | [Voorraad] | [Laatste] | Volume voor 60 gels (µL) |
| NaOH | 100 mM | 35.7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4.58 mM | 687 |
| Collageen | 5 mg/mL | 1,71 mg/mL | 1029 |
| Totaal volume | - | - | 3000 |
Tabel 1: Type I de voorbereiding van het gel van de vezelige collageen
| LDL | oxLDL | |||||||
| Gel | Graaf | Schuim cellen1 | Gemigreerde cellen1 | Schuim cellen (%)2 | Schuim cellen1 | Gemigreerde cellen1 | Schuim cellen (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18,5 | 10 | 23 | 43,5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21.2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14,7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58.2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13,5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53.8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 11 | 31 | 35,5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18.4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20,5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21.2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36,7 | ||
| Mediane schuim cellen (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Gemiddelde schuim cellen (%) | 19,8 | 45.5 | ||||||
Tabel 2: Raw cel telt uit vergelijking van schuim monocyt-afgeleide cellen na LDL vs oxLDL behandelingen. 1 Cel telt per gezichtsveld in gel. 2 Percentage cellen schuim schuim = cel graven/totaal gemigreerde telt x 100. * Gegevens zijn representatief voor een experiment met monocyten van een enkele donor
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven biedt een veelzijdig en fysiologisch relevante methode voor de beoordeling van de atherogenicity van monocyten van menselijke klinische cohorten, door zowel monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming te combineren. Dit model biedt voordelen ten opzichte van alternatieve methoden van schuim celvorming zoals het rekening houden met het effect van de monocyt zielsverhuizing op schuim celvorming en de meting van omgekeerde transmigratie6 naast de inherente laat neiging van monocyten om te rijpen in schuim cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene factoren. Bovendien wordt de rol van endothelial activering ook rekening gehouden met zoals we hebben aangetoond dat endothelial activering upregulates oxidatie van lipide-soorten die wordt geassocieerd met schuim cel formatie14. Tot slot kan het fenotype van monocyten die ondergaan egress (een eigenschap die is gekoppeld aan de plaat regressie) worden gekwantificeerd en gekenmerkt door microscopie en stroom cytometry.
Het driedimensionale karakter van transmigratie in gels, identificeren en scoren de transmigrated cellen als schuim cellen of macrofagen moeilijk kunnen zijn als cellen op verschillende niveaus in de gel-19 transmigrate. Steun de identificatie van schuim cellen, moet altijd verse olie-Red O vlek worden gebruikt. Het is ook van de nota dat verschillende ex vivo ziekte staten of in vitro voorwaarden monocyt transmigratie in de gel kunnen wijzigen. We hebben levende cel imaging gebruikt om te identificeren dat monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen de neiging om transmigrate naar ondieper punten in gels en op verschillende snelheden dan die van niet-geïnfecteerde individuen19. Bovendien schuim celvorming wordt geassocieerd met minder monocyt beweeglijkheid in de gel, zodat de cellen de neiging te bewegen in cirkels op een bepaalde z-sectie in vergelijking met cellen van HIV-geïnfecteerde individuen die hebben de neiging om te migreren in een vrij rechte lijn richting de onderkant van de gel. Deze bevindingen verhogen de mogelijkheid van een soortgelijk fenomeen optreedt in experimenten met menselijke patiënten monsters uit andere ziekte staten verhoogde monocyte atherogenicity is gekoppeld.
Bij het uitvoeren van stroom cytometry gebaseerde analyses is het gebruikelijk om een aanzienlijk deel van de dode cellen in de herstelde celpopulatie observeren bij het beoordelen van de levensvatbaarheid met behulp van live/dode cel markeringen (figuur 4B). Deze cellen zijn voornamelijk CD45- HUVEC die zijn beschadigd tijdens de stap van de spijsvertering/maceratie collageen moet uitpakken monocyt-afgeleide cellen uit de matrix van collageen. Dit proces is bijzonder hard op de HUVEC enkelgelaagde, maar is niet schadelijk voor fenotypering de transmigrated cellen.
Dit model verschilt van andere in die zin dat geen kunstmatig geoxideerde exogene lipide is vereist in de cultuur media station monocyt-afgeleide schuim celvorming. In plaats daarvan wordt de celvorming schuim in deze test beïnvloed door het serum aanwezig in de cultuur-media, zodat voor de aparte effecten van oplosbare factoren van klinische monsters moeten worden geëvalueerd. Als zodanig hebben wij aangetoond dat incubatie van controle monocyten met serum van jonge HIV-geïnfecteerde19 of ouderen HIV-geïnfecteerde20 personen bevordert celvorming schuim, die aangeeft dat de oplosbare factoren onafhankelijk schuim kunnen bevorderen celvorming. Als de bepaling wordt beïnvloed door oplosbare onderdelen, moet één enkele batch van gebundelde menselijk serum worden gebruikt voor experimenten gericht op het vaststellen van de inherente verschil van atherogene eigenschappen van monocyten afkomstig van verschillende individuen om te standaardiseren controlevoorwaarden. Deze test kan ook worden gebruikt om te evalueren van de rol van specifieke lipide soorten van klinische monsters (Figuur 3). Bijvoorbeeld, hebben we gevonden dat incubatie van monocyten met media met geïsoleerde lipide soorten zoals high-density lipoproteins van personen met bekende lipide dysfunctie24 bevordert ook schuim celvorming. In dit geval kunnen monocyten van een gezond individu of groep van individuen worden gebruikt in de aanwezigheid van serum of serum factoren afgeleid van testonderwerpen. Dankzij dit model kan dus, voor specifieke vragen te stellen over de discrete gevolgen van zowel oplosbare en cellulaire componenten voor schuim celvorming.
Deze test maakt gebruik van HUVEC als een model van coronaire endotheel als gevolg van de praktische moeilijkheid in het verkrijgen van grote aantallen lage passage aantal primaire coronaire cellen. We hebben echter ten opzichte van de resultaten van testen met behulp van zowel de menselijke coronaire endotheliale cellen of de HUVEC en waargenomen weinig verschil in de monocyt transmigratie of schuim celvorming (gegevens niet worden weergegeven), waaruit blijkt dat het gebruik van HUVECs in dit systeem is een aanvaardbaar substituut. Handmatig tellen van schuim cellen is een beperkende factor in dit model zoals het vooroordeel van de exploitant kan invoeren. Daarom moeten alle monsters gemonteerd op dia's aan de exploitant worden verblind ter opheffing van het potentieel van vooringenomenheid. We hebben echter ten opzichte van schuim celvorming zoals gemeten door het handmatig tellen en imaging stroom cytometry en vond dat deze methoden vergelijkbare resultaten19 geven. Een belangrijke beperking van dit model is dat monocyt hechting en transmigratie in de afwezigheid van shear krachten fysiologische bloed stroom in vivois gekoppeld plaatsvinden. We veronderstellen dat schuintrekken stroom overwegend monocyt zielsverhuizing en niet latere schuim celvorming binnen de matrix beïnvloeden zal; Dit dient evenwel te worden overwogen bij de interpretatie van de resultaten van deze test. Deze test model ook niet de invloed van de zachte spiercellen in monocyt-afgeleide schuim celvorming die een fysiologische beperking van het systeem is; Dit strookt echter in alle omstandigheden het discrete atherogene potentieel van monocyten worden vergeleken tussen andere ziekte staten.
Kortom biedt dit model een veelzijdige en fysiologisch relevante methode voor kwantificeren monocyt zielsverhuizing en schuim celvorming van menselijke specimens in andere ziekte staten ex vivo. Dit model heeft verdere toepassingen voor de evaluatie van de neiging van monocyten te vormen van de cellen van de schuim in omstandigheden waar monocyte atherogenicity geassocieerd met verhoogd risico van CAD-zoals obesitas25, diabetes26 en chronische nier is ziekte27. Dit model kan dus ook worden geoptimaliseerd voor gebruik in andere staten van de ziekte dan atherosclerose waar cellulaire transmigratie pathogenese van de ziekte kan beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor het werk van Prof. William Muller en Dr. Clare Westhorpe voor hun sleutelrol in de ontwikkeling van eerdere iteraties van dit model. De auteurs ook bedank de AMREP Stroom Cytometry kern voor het sorteren van monocyt deelverzamelingen en de Alfred besmettelijke ziekte ziekenhuisafdeling klinische onderzoek verpleegkundigen voor de aanwerving van HIV + personen voor sommige studies. De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor de bijdrage aan dit werk voor de Victoria operationele infrastructuur Support Program ontvangen door het Instituut Burnet. TAA wordt ondersteund door een RMIT University Vice-kanselier van postdoctorale Fellowship. Dit werk werd gesteund door NHMRC projectsubsidie 1108792 toegekend aan AJ en AH. TK wordt ondersteund door NIH grants NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
