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Immunology and Infection

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Published: October 17, 2017 doi: 10.3791/56293

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung der Seelenwanderung von Monozyten in menschlichen Endothelzellen Monolagen und ihre anschließende Reifung in Schaumzellen. Dies stellt eine vielseitige Methode, die atherogenen Eigenschaften von Monozyten aus Menschen mit unterschiedlichen Erkrankungen isoliert zu beurteilen und Faktoren im Blut zu bewerten, die diese Neigung erhöhen können.

Abstract

Koronare Herzkrankheit (KHK) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Arteriosklerose, eine führende Ursache für CAD, ist initiiert von der Seelenwanderung des angeborenen Immunsystems Monozyten zu entzündlichen Websites hinterlegten Lipid namens fetthaltige Streifen, die in Arterienwände des Mediums zu großen Arterien vorhanden sind. Die pathogenen Läsionen in diesem frühen Stadium der Arteriosklerose zeichnet sich die Reifung von Monozyten, die in Arterien zu Schaumzellen oder Lipid-beladene Makrophagen zu migrieren. Beträchtlichen Beweis stützt die Hypothese, das Risiko von Arteriosklerose wird durch chronische Entzündungszustände Begleiterkrankungen wie rheumatoide Arthritis und HIV sowie allgemeine Alterung erhöht, und das dieses Risiko wird durch Monocyte vorhergesagt Aktivierung. Während Maus-Modelle eine gute Plattform bieten, um die Rolle von Monozyten in Atherogenese in Vivozu untersuchen, sie erfordern genetische Veränderung der natürlichen Cholesterin-Stoffwechsel und drastische Veränderung der normalen Maus Diäten, und haben nur begrenzte Eignung für die Studie der atherogenen Einflüsse der menschlichen Comorbid Krankheiten. Dies hat uns motiviert, ein menschlichen in-vitro- Modell zur Messung der atherogenen Potenzials von Monozyten von Individuen mit bestimmten Krankheitszuständen isoliert zu entwickeln. Derzeit sind menschlichen in-vitro- Modelle begrenzt, insofern sie Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung isoliert zu bewerten. Hier beschreiben wir ein Protokoll in der Monozyten aus Patientenblut isolierte transmigrate in menschlichen Endothelzellen in einem Typ-1-Kollagen-Matrix und ihre Neigung zu Schaumzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von exogenen Lipid heranreifen wird gemessen. Das Protokoll wurde für die Verwendung von menschlichen Monozyten von Personen mit HIV-Infektion und älteren Menschen, die HIV-nicht infizierten gereinigt validiert. Dieses Modell ist vielseitig und ermöglicht Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewertenden Verwendung entweder Mikroskopie oder Durchflusszytometrie sowie ermöglicht die Beurteilung der atherogenen Faktoren im Serum oder Plasma zu präsentieren.

Introduction

Monocyte Seelenwanderung ist ein entscheidender Schritt in der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, die zu Thrombosen, Schlaganfall und Herzinfarkt führen kann. Arteriosklerotische Plaques entwickeln sich aus fetthaltige Streifen, in der Regel an den Standorten des geringen oszillierenden Blutflusses in Medium zu großen Arterien, wo hinterlegten Lipid trägt zur endotheliale Aktivierung und lokalisierte Entzündung1vorhanden. Monozyten rekrutiert, Endothelzellen in fetthaltige Streifen über Monocyte chemotaktische Proteine (z. B. CCL2) und transmigrate in der Intima-2. Im Anschluss an Seelenwanderung können Monozyten bilden atherogenen, Lipid-beladene Makrophagen Schaumzellen infolge Lipid-Aufnahme, Lipid-Synthese, Down-Regulierung des Cholesterins Ausfluss oder eine Kombination aus den oben genannten Faktoren genannt. Monozyten können auch Lipide in der Zirkulation zu sammeln und haben einen "schaumigen" Phänotyp, eventuell prädisponierende Zellen für Schaum Zelle Bildung3,4. Schaumzellen sind das bestimmende Merkmal der fetthaltige Streifen und frühe arteriosklerotische Plaques und ihrer Entstehung wird von Lipid und Entzündungsmediatoren5beeinflusst. Monozyten haben alternativ die Möglichkeit, umzukehren transmigrate von der Arterie in die Blutbahn6, wodurch Lipid aus der Intima und Handeln zur Erhaltung der Gesundheit der Arterie entfernt.

Bestimmung der Neigung von Monozyten, transmigrate über arteriellen Endothel und Form Schaumzellen in der Intima oder umgekehrt transmigrate und Lipid aus die Plakette zu tragen, ist eine wesentliche Voraussetzung für das Verständnis der Rolle der Monocyte-Aktivierung bei der Erhöhung arteriosklerotische Risiko. Maus-Modellen der CADs wie Atherosklerose sind in Aufklärung Informationen in Echtzeit in Vivo auf fetthaltige Streifen/atherosklerotischen Plaque Entwicklung wichtig. Diese Modelle erfordern jedoch eine genetische Veränderung der natürlichen Verarbeitung Fähigkeiten dieser Tiere in der Regel verbunden mit drastischen Veränderungen in der Ernährung (z. B. das ApoE/Western-Typ-Diät Modell)7,8, wodurch Cholesterin, Induktion unphysiologischen Anhäufung von zirkulierenden Lipid Ebenen der Antriebsentwicklung Plaque. Diese Modelle können Relevanz für chronische entzündliche menschlichen Erkrankungen wie HIV-Infektion begrenzt haben, die nicht zugeordnet sind erhöhte zirkulierende Cholesterin oder Low density Lipoprotein (LDL) Ebenen. Darüber hinaus Monocyte Biologie Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen, die Prüfung der immunologische Fragen bezüglich der Relevanz der Subpopulationen von Monozyten (z. B. Mittelstufe Monozyten (CD14++CD16+))9 schwierig. Dies ist wichtig, bei der Untersuchung der Mechanismen, die Herz-Kreislauf-Krankheit zu fahren, wie fortgeschrittene Monocyte zählt unabhängig kardiovaskuläre Ereignisse10,11Vorhersagen. Während Tests existieren, um entweder Monocyte Seelenwanderung oder Schaum Zellbildung isoliert nacheinander zu messen, ist kein in-vitro- Test zur Quantifizierung der beide Aspekte der frühen Atherogenese verwenden die gleichen Zellen aus klinischer Kohorten validiert worden. Transwell Modelle verwenden ein modifizierte Boyden Zweikammer-System, wobei Zellen werden in die obere Kammer geladen und über eine poröse Kunststoff Barriere oder Cell Monolayer in eine untere Kammer, die in der Regel Medien mit Lockstoffgradient12 enthält transmigrate , 13. während am meisten benutzt für die Analyse von Leukozyten Seelenwanderung, diese Modelle nicht in der Regel einen Layer für die Intima, was zu transmigrated Zellen migrieren in Lösung integrieren und lassen sich nicht für die Messung von Schaum Zelle Bildung oder umgekehrte Seelenwanderung die gleichen Zellen. Modelle von Schaumbildung Zelle machen sich dagegen nicht transmigratory-induzierte Änderungen Monozyten oder Auswirkungen der endotheliale Aktivierung, die dazu beitragen, Schaum-Zelle Bildung14bekannt ist. Darüber hinaus verursachen diese Systeme Schaum Zellbildung von Makrophagen eingehalten Zellplatten Kultur durch die Zugabe von Sättigung Konzentrationen von exogenen oxidierten Low density Lipoprotein (OxLDL)15,16, eine wesentliche Induktor von Zelle Schaumbildung. LDL in diesen Modellen verwendeten ist daher oft durch nicht physiologisch relevanten Prozesse wie CuSO4 Behandlung17, oxidiert die physiologische Bedeutung der Studien mit diesen Modellen in Frage zu stellen.

Hier beschreiben wir eine Probe, die quantifiziert Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung der gleichen Zellen erfordern nicht die Zugabe von exogenen OxLDL, somit besser modellieren die Rolle von Monozyten in Zelle Schaumbildung. Dieses Modell wurde ursprünglich von Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18entwickelt und weiterentwickelt in unserem Labor ex Vivo Atherogenicity von Monozyten isoliert unter nicht-Aktivierung bewerten Bedingungen von Einzelpersonen mit zugrunde liegenden entzündlichen Erkrankungen Begleiterkrankungen wie z. B. HIV-Infektion19 sowie Alterung20, sind, die mit einem erhöhten Risiko für Arteriosklerose in Verbindung gebracht. Dieses Modell bietet auch eine Plattform für die Beantwortung der grundlegenden biologischen Fragen die Neigung der verschiedenen Monocyte Teilmengen Form Schaum Zellen20, den Einfluss der endotheliale Aktivierung von Zytokinen wie TNF auf Zelle Schaumbildung14 , und die wandernden Eigenschaften von Monozyten wie die Tiefe und Geschwindigkeit der Seelenwanderung in Gele19. Darüber hinaus Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung mit standard-Mikroskopie quantifiziert werden kann, live Cell Imaging, flow Cytometry und Bildgebung Durchflusszytometrie, daher bietet eine vielseitige Methode zur Bewertung der Rolle von Monozyten in Atherogenese.

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Protocol

Hinweis: alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik von Alfred Hospital Komitee der menschlichen Ethik, Melbourne durchgeführt. Alle Versuche wurden in Klasse II Biosicherheit Schränken durchgeführt, sofern nicht angegeben. " Prewarmed " bezieht sich auf Reagenzien auf 37 ° C in einem Wasserbad erwärmt.

1. Vorbereitung der Typ I faserigem Kollagen Gele: Tag1

  1. Prepare polymerisiert Kollagen Gele nacheinander hinzufügen und Mischen von 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4,58 mM Essigsäure und 1,71 mg/mL Typ I Kollagen faserige in 5 mL Polystyrol Rohr gemäß Tabelle 1.
    Hinweis: Sicherstellen, dass das Kollagen gut durchmischten indem sanft nach oben und unten 5 Mal um die Bildung von Kollagen stoppen Pipettieren ' Taschen ' in der Gel-Mischung. Bereiten Sie 4-6 Gele pro Testbedingung für die Mikroskopie oder 15 Gele pro Testbedingung für Durchflusszytometrie.
  2. Nun einmal gemischt, aliquoten 50 µL Kollagen Gel Mischung in jede Vertiefung einer sterilen Plattboden 96-Well-Zellkultur-Platte. Verwenden Sie nicht die äußeren Zeilen und Spalten, sondern füllen Sie diese mit 200 µL 1 X Dubecco ' s Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die Gele vor Austrocknung zu schützen. Inkubieren Platten bei 37 °C/5% CO 2 für 2 h, um das Kollagen zu polymerisieren lassen.
    Hinweis: Legen Sie die Platten direkt auf saubere Metall Regale in den Inkubator, gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten.
  3. Nach Inkubation, überlagern die Gele mit 150 µL 1 x ergänzt M199 (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie für 5 Tage bis zum ersten Gebrauch.

2. Erweiterung des gespeicherten HUVECS: Tag1

  1. Label und Mantel einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit 1 mL von 50 µg/mL Fibronektin in 1 X PBS verdünnt und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
  2. Tauwetter Aliquote von kryokonservierten primären menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS, 1.0 x 10 6-Zellen) in 10 mL M20.
    Hinweis: HUVECS sollten bereit sein, wie zuvor 21 beschrieben und bei einem niedrigen Passagenanzahl verwendet (< Abschnitt 4). HUVECS mit menschlichen koronaren Endothelzellen hier ersetzt werden kann.
  3. HUVECS in 10 mL M20 Aufschwemmen und Fibronektin beschichtete Teller, Absaugen von überschüssigem Fibronektin vor der Zugabe von Zellen und Kultur zum Zusammenfluss (ca. 5 Tage), Austauschen der Medien am 3. Tag hinzu.

3. Kultivierung von HUVECS Monolayer auf Kollagen Gele: Tag 5

  1. am 5. Tag, HUVECS lösen, indem Kultur aus der Petrischale überstand Absaugen und Waschen entfernt Serum-haltigen Medien mit 10 mL serumfreien M199.
  2. HUVECS 5 mL 0,05 % Trypsin/0,53 EDTA in M199 hinzu und inkubieren Sie für 1-2 min bei Raumtemperatur, sanft schütteln, bis die Zellen trennen.
  3. Einmal gelöst, schnell spülen Petrischale mit 5 mL M20 und übertragen das Medium mit Zellen, die eine 10 mL-Tube.
  4. Zentrifuge Proben bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur, Aspirieren überstand, Aufschwemmen Zellen in 200 µL der M20 und zählen von Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
  5. Aufschwemmen der Zellen bis 2.0 x 10 5 Zellen/mL in M20, Aspirieren M199 auf die Gele aus der 96-Well-Platte (Schritt 1.3) und jedes Kollagen Gel oben (Schritt 1.2) vorbereitet 100 µL resuspendierte HUVECS (2.0 x 10 4 Zellen) hinzuzufügen. Kultur von Platten für weitere 3 Tage bei 37 °C/5% CO 2.
    Hinweis: Die Integrität des HUVECS Monolage kann nach 3 Tagen durch Silbernitrat Färbung 22 oder Immunohistochemistry für enge Kreuzung Proteine 23 zu diesem Zeitpunkt bestätigt werden. Weitere Gele müssen dazu bereit sein.

4. Aktivierung des HUVECS Monolage und Isolation/Aktivierung von Monozyten für Seelenwanderung: Tag 8

  1. am 8. Tag, jeder HUVECS monomolekularen Film vor der Zugabe von Monozyten durch Absaugen der M20 aktivieren Medien überlagern die Gele und das Hinzufügen von 100 µL 10 ng/mL menschlichen TNF in M20 pro Gel. Inkubation bei 37 °C/5% CO 2 für 4 Std.
    Hinweis: Nicht aktivierte HUVECS Bedingungen auch möglicherweise enthalten ggf. als Steuerelemente.
  2. Während die 4 h HUVECS Aktivierungsschritt, isolieren Monozyten von PBMCs mit magnetischer Wulst Techniken negativ für Zellen des Herstellers wählen ' Anweisungen. Mindestens 6,5 x 10 6 PBMCs sollte bei diesem Schritt genutzt werden, um zuverlässig wiederherstellen 3.0 x 10 5 Monozyten erforderlich für eine Bedingung, da in der Regel ca. 10-15 % der PBMCs Monozyten ausmachen.
    Hinweis: Um die Wirkung der Monocyte Aktivierung vor Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewerten, können Monozyten in dieser Phase aktiviert werden. Monozyten können von aufgetauten PBMCs bei Bedarf (d.h. gespeicherte Patientenproben) isoliert werden. Monocyte Teilmengen durch FACS Sortierung isoliert zubereitet werden, für die Addition, Gele (Abbildung 1).

5. Transmigration von primären menschlichen Monozyten: Tag 8

  1. zur Messung Monocyte Seelenwanderung, TNF-haltigen Medien zu entfernen und waschen Gele zweimal mit 100 µL M199 durch hinzufügen und Entfernen von Medien. Nach waschen, hinzufügen 2.0 x 10 5 frisch isoliert oder aufgetaut und gewaschen kryokonserviert PBMCs oder 5,0 x 10 4 frisch isolierte Monozyten oder gereinigt Monocyte Teilmengen zu HUVECS Monolagen in 100 µL M20. Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 vorwärts Transmigration von Monozyten in das Gel zu ermöglichen. Es empfiehlt sich, 6 Brunnen für jeden Versuchsbedingung untersucht lassen.
    Hinweis: Um die Wirkung von autologem Serum auf Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewerten, inkubieren Sie Zellen mit M20, enthalten die gewünschte Konzentration von Hitze-inaktivierten Spender Serum und vergleichen mit Bedingungen mit einer gepoolten Humanserum-Kontrolle. Leukozyten als Monozyten können in diesem Stadium hinzugefügt werden. Wenn bestimmte Lipide/Lipid-Arten (z.B., HDL, OxHDL) zu untersuchen, führen Sie alle folgenden Schritte mit serumfreien Medium mit 20-50 µg/mL Lipide.
  2. Nach 1 h nach vorne Seelenwanderung, sammeln die nicht transmigrated Zellen durch Waschen Gele zweimal mit 100 µL vorgewärmte 1 mM EGTA mit 1 X PBS-Puffer, und einmal mit 100 µL M199 (gleiche Zentrifugieren Bedingungen), Bündelung der Überstände aus jedem Brunnen desselben Versuchsbedingung (in der Regel 6 Brunnen) zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis. Die nicht transmigrated Zellen bei 4 ° C, 300 X g für 5 min Zentrifugieren und in 30 µL 1 X PBS Aufschwemmen.
  3. Zählen der Zellen in der Überstand zu bestimmen, die Anzahl der nach vorne transmigrated Zellen gesammelt.
  4. Der Anteil der vorderen transmigrated Zellen wird wie folgt ermittelt:
    Equation 1 Equation 2 Equation 3
  5. decken die gewaschenen Gele mit transmigrated Zellen mit 100 µL M20 und inkubieren Sie für eine weitere 48 h
  6. Nach 48 h, sammeln des Überstands und waschen nicht transmigrated Zellen zweimal mit 100 µL 1 mM EGTA/PBS, Sammlung und Bündelung des Überstands von jedem Zustand wie im Schritt 5.2 vorgewärmt.
    Hinweis: Der Phänotyp der umgekehrte transmigrated Zellen kann auf diese Zellen f getestet werdenAch standard Durchflusszytometrie Fleckenbildung Protokolle.
  7. Zellen bei 4 ° C, 300 X g für 5 min Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen mit 30 µL 1 X PBS-Puffer. Zählen Sie Zellen und bestimmen die Lebensfähigkeit über Trypan blau Färbung.
  8. Den Anteil der umgekehrte transmigrated Zellen mithilfe von der folgenden Gleichung ermitteln:
    Equation 4
    Hinweis: Rechnungswesen für die Gesamtzahl der vorderen transmigrated Zellen eine genauere Angabe der umgekehrte Seelenwanderung gibt, wie es ist unwahrscheinlich, dass vorwärts Seelenwanderung werden 100 %.
  9. Für die Analyse von Mikroskopie, beheben die Gele durch Zugabe von 100 µL 2 % Formaldehyd (Endkonzentration) in jede Vertiefung decken die Platten in Aluminium Folie und bis zur Analyse bei 4 ° C lagern. Beheben Sie für Durchflusszytometrie die Zellen nicht in diesem Stadium. Die Protokolle unter für die Mikroskopie (siehe Abschnitt 6) oder Flow-Zytometrie (Abschnitt 7)-Analyse zu sehen.
    Achtung: Formaldehyd ist giftig und ätzend; persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu verwenden. Vorsicht beim Hinzufügen von Formaldehyd, aber dieser Schritt muss nicht durchgeführt werden, unter einem Abzug aufgrund der geringen Konzentration verwendet.

6. Quantifizierung des Schaum-Zellen und Makrophagen durch Mikroskopie (Öl-rot färben O)

  1. das Formaldehyd zu entfernen und waschen Sie die Gele mit 100 µL von 50 % (V/V) Methanol für 5 min und dann 100 µL 78 % (V/V) Methanol für 15 min.
    Hinweis: Die Färbung Schritte können durchgeführt werden, auf dem Labortisch und nicht in einem Klasse-II-Biohazard-Schrank.
  2. Fleck für Lipid Tröpfchen durch Hinzufügen von 100 µL der frisch zubereiteten 0,2 % (w/V) Öl-rot O (siehe Tabelle der Materialien für Details) für 1 h bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie überschüssige Flecken durch Waschen die Gele 4 Mal mit 100 µL 78 % (V/V) Methanol, Absaugen und Abwerfen des Überstands nach jeder Wash.
  4. Für 15 min bei Raumtemperatur mit 100 µL Giemsa, 01:10 in destilliertem Wasser verdünnt Gegenfärbung.
  5. Aspirieren Giemsa Fleck und Gele einmal mit Wasser zu waschen.
  6. Um die Gele aus der Platte zu entfernen, die Brunnen mit einer Nadel 21 G mit der Schräge nach außen, um den Rand des Gels Felge.
  7. , Die Gele auf einen Objektträger zu montieren Schlag zwei Löcher (Durchmesser von 6,35 mm) in einem 2,54 cm x 1,5 cm Streifen doppelseitiges Klebeband. Das Band zu einem standard Mikroskop-Seite befestigen und Entfernen der Schutzschicht von oben.
    1. Add einen Tropfen Wasser auf die Löcher in das Band mit einer Transferpipette. Übertragen Sie Gele mit einer Pinzette, sanft auf die Löcher in der Band und mit einem Deckgläschen Größe 1,5 Glas werden. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas auf dem Band einzuhalten.
  8. Untersuchen mit differential Interferenz Kontrast Hellfeld Mikroskopie mit 40 X Objektiv auf einem inversen Mikroskop.
    1. Bringen die HUVECS Monolayer in den Fokus bei 40 X Vergrößerung und scrollen Sie nach ' in ' Gel, Makrophagen/Schaumzellen in die gesamte Tiefe des Gels zu zählen. Wiederholen Sie für drei unterschiedliche Sichtfelder befindet sich in einer ähnlichen Entfernung vom Rand des Gels um mögliche Randeffekte zu minimieren. Dadurch wird sichergestellt, dass Gel Tiefe ist konsistent zwischen Regionen zählen.
      Hinweis: Gäste Zellen in das Gel entweder als Schaumzellen (definiert als Zellen mit > 1/3 von ihrem Zytoplasma als Öl-rot O gebeizt Lipid-Tropfen) oder Makrophagen innerhalb 2 h nach Montage auf Folien ( Abbildung 2). Zelle Schaumbildung wird ausgedrückt als Prozentsatz der Schaumzellen bezogen auf die Gesamtzahl der migrierten Zellen und wird ausgedrückt als die mediane Grafen in 3 Gesichtsfelder für 6 Gele pro Zustand, daher einen Median von 18 Messungen pro Zustand untersucht. Ein Beispiel für rohe Zellenzahlen von ein typisches Experiment ist in Tabelle 2 gezeigt.
      Hinweis: Eine Zelle als ein Schaum Zelle Vs Makrophagen durch Mikroskopie zu klassifizieren ist subjektiv und kann folglich sein Ermittler-abhängige. In klinischen Studien, wo Experimente über einen längeren Zeitraum hinweg durchgeführt werden, ist es wichtig für alle zählen, geblendet durch eine einzelne Prüfer durchgeführt werden. Schaumzellen und Makrophagen in Gele sind Beispiele in Abbildung 2.

7. Analyse der Transmigrated Zellen durch Flow Cytometry

  1. phänotypisch Schaumzellen und Makrophagen, die nach der Transendothelial Migration zu charakterisieren, die Gele durch Zugabe von 100 µL 37 ° C vorgewärmt 1 mg/mL Kollagenase D verdünnt in M199 zu verdauen jedes gut und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C/5% CO 2.
    Hinweis: Legen Sie die 96-Well-Platten direkt auf saubere Metall Regale in den Inkubator, gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten.
  2. Nach Inkubation, die Gele mit einer Pipettenspitze 200 µL mazeriert und inkubieren Sie für weitere 20 min bei 37 °C/5% CO 2.
  3. Einmal vollständig verdaut, Filter und Pool die verdaute replizieren Gele durch 35 µm Nylon mesh angeschnittene Ärmel FACS-Röhren auf Eis gelegt und waschen mit FACS einmal waschen (siehe Tabelle der Materialien), bei 4 ° C, 300 X g. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL FACS Washington
  4. Die resultierenden Zellen mit spezifischen Fluorophor-konjugierten Antikörpern inkubieren CD45, einen lebenden/Toten Zelle Marker und Oberfläche/intrazellulären phänotypische oder funktionelle Marker mit standard Flow Cytometry Protokolle.
    Hinweis: Bereiten Sie Kontrolle Rohre für Entschädigung unter Verwendung der entsprechenden Fluorophore und Ig Entschädigung Perlen. Entnommene Zellen können auch auf Glas-Objektträger für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Cytospinning gesammelt werden. Alternativ haben wir erfolgreich gesammelt Zellen unter Verwendung dieses Protokolls zur Beurteilung über bildgebende Durchflusszytometrie.
  5. Zellen mit einem Durchflusszytometer zu erwerben, und führen Sie Entschädigung Bedarf.
    Hinweis: Da Schaum Zellen/Makrophagen nicht einzelne Populationen mit Lichtstreuung Eigenschaften bilden und sehr unterschiedlich in Größe und Form können kann, setzen liberale forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Tore um alle migrierten Zellen zu erfassen, wie in gezeigt < starke Klasse = "Xfig" > Abbildung 3A.
  6. Nach Übernahme, die Datenanalyse mit Flow Cytometry Software durchführen. Um migrierten Zellen zu identifizieren, markieren Sie zuerst Zellen als negativ für die lebenden/Toten-Marker, wie in Abbildung 3 b gezeigt. Führen Sie dann eine einzelne Zelle Diskriminierung durch die Schaffung einer engen Tor um die Zellen auf einem SSC-Bereich Vs SSC-Höhe Grundstück gezeigt.
  7. Wählen Sie CD45 + Zellen und Tor die großen Bevölkerung von migrierten Zellen in einem FSC/SSC-Grundstück sind die Makrophagen/Schaumzellen.

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Representative Results

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung

Monozyten werden hinzugefügt, um das Modell wie in Abbildung 1beschrieben, und sechs Gele sind bereit für jede Bedingung. Monozyten für 6 Gele pro Spender (d.h., 5.0 x 104 Monozyten pro Gel 6 Gele = 3,0 x 105 Monozyten pro Spender) sind zu einem Endvolumen von 600 µL M199 Medien enthält die erforderlichen Serum/isoliert Lipid Nukleinsäuretablette. Zellen (dh, 100 µL pro Gel = 5,0 x 104 Monozyten) sind dann regelmÄÑig auf Gele und inkubierten wie oben für 1 h Monocyte Seelenwanderung zu erleichtern. Im Anschluss an Seelenwanderung zählen nicht transmigrated Zellen wie oben beschrieben. In diesem Beispiel wurden 1,5 x 104 nicht transmigrated Zellen geborgen. Der Prozentsatz der vorwärts Seelenwanderung war bestimmt anhand der Formeln im Schritt 5.4 beschrieben:

Equation 5

Equation 6

Nach 48 h Inkubation wurden 3,6 x 104 reverse transmigrated Zellen wie oben geborgen. Der Prozentsatz der umgekehrte Seelenwanderung war bestimmt mit der Formel in Schritt 5.8:

Equation 7

Vorwärts und rückwärts Seelenwanderung kann verglichen werden, zwischen den Bedingungen, die mit dem entsprechenden statistischen Tests und Monozyten aus mehreren unabhängigen Gebern vorbereitet um festzustellen, ob die Monocyte Seelenwanderung Fähigkeit zwischen experimentellen geändert wird Bedingungen.

Bewertung der Zelle Schaumbildung

Hellfeld-Mikroskopie

Oxidierte Lipoproteine sind dafür bekannt, Monocyte abgeleitet Schaum Zelle Bildung in Vitro im Vergleich zu Lipide15zu fördern. Hier bestätigen wir, dass die Behandlung von Monozyten mit OxLDL, häufig verwendet, um die Zelle Schaumbildung in Zellmodellen Induktion herkömmlichen Schaum induzieren Monocyte-abgeleitete Zellen Schaumbildung in diesem Modell der Transendothelial Migration und Schaum Zellbildung erhöht im Vergleich zu nativen LDL. Nach Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung in den Gelen inkubiert mit M199 mit 50 µg/mL Native oder CuSO4-oxidierten LDL (siehe Schritt 5.1, Abbildung 1), Zellen analysiert wurden durch Mikroskopie. Beispiele für Schaumzellen und Makrophagen in repräsentative Experimente beobachtet sind in Abbildung 2dargestellt. Zellen wurden in drei verschiedenen Bereichen pro Gel, durch die Konzentration auf HUVECS Monolage und schrittweise mit Schwerpunkt tiefer in das Gel gezählt. Die Zellzahlen sind für jeden Spender aufgezeichnet, wie in Tabelle 2 für einzelne Spender, um den Prozentsatz der Schaumzellen gebildet in Reaktion auf oxidiert und nativen LDL zu vergleichen. Aggregieren von Daten aus n = 12 unabhängigen Grafen sind in Abbildung 4 dargestellt, zu bestätigen, dass die Inkubation von Monozyten mit OxLDL bei diesem Modell mehr Schaum Zellbildung als Bedingungen induziert wo sind Monozyten mit nativen LDL oder M199 Medien allein bebrütet.

Durchflusszytometrie

Um den Phänotyp der migrierten Zellen zu bestimmen, werden die Zellen extrahiert aus verdauten Gele und beschriftet mit einem standard Flow Cytometry Panel. Zellen wurden mit einer lebenden/Toten Zelle Marker und Antikörper spezifische für CD45 und anderen Oberflächen Phänotyp-Marker mit standard Flow Cytometry Protokolle bezeichnet. Ausgleich-Steuerelemente müssen auch für volle Entschädigung gemäß standard Flow Cytometry Techniken bereit. Migrierte Zellen werden angespritzt, wie in Abbildung 3 in Parzellen Vertreter der 10 unabhängige Experimente gezeigt. Lebenden Zellen sind eingezäunt mit lebenden/Toten Zelle Lebensfähigkeit Assays (Abb. 3 b) und Dubletten sind durch einzelne Zelle Analyse (Abbildung 3) ausgeschlossen. Zellen werden dann als CD45 angespritzt+ , um HUVECS auszuschließen (wie diese Zellen CD45 sind-, Abbildung 3D). Die Ballungszentren ist dann durch forward Scatter/Side Scatter Diskriminierung (Abbildung 3E) eingezäunt und der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) Rezeptoren von Interesse sind im Verhältnis zu beiden Fluoreszenz minus eins (FMO) ermittelt oder Isotype Steuern) Abbildung 3F) Ausdruck (ΔMFI) oder einen Prozentsatz der positiven Zellen bestimmen.

Figure 1
Abbildung 1 : Ein in-vitro- Modell der Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung. (A) PBMC, (B) insgesamt Monozyten oder (C) FACS sortiert Monocyte Teilmengen werden hinzugefügt, um Typ-I-Kollagen faserige Gele in 96-Well Platten gebildet und überlagert mit einer Monoschicht der aktivierten primären menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS), deren Integrität kann beurteilt werden, durch silberne Färbung ()D) und (E) transmigrate für 1 h in Anwesenheit von Serum oder Lipid mit Medien. Non-transmigrated Zellen werden gezählt, (F) und Gele sind mit der gleichen Serum/Lipid mit Medien für weitere 48 h inkubiert. Anschluss an Inkubation, (G) reverse migrierte Zellen werden gezählt und der Prozentsatz der Schaumzellen vs. Makrophagen im Gel richtet sich nach (H) Phasenkontrastmikroskopie nach Färbung mit Öl-rot O oder die Phänotyp der migrierten Zellen richtet sich nach (ich) Durchflusszytometrie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Beispiele für Schaumzellen und Makrophagen in eine in-vitro- Modell der Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung. EstnischeIve-Beispiele für Zellen erzielte als Schaum (weisse Pfeile) Zellen und Makrophagen (schwarze Pfeile) nach Giemsa Färbung um Zellen und Öl-rot O Färbung zu visualisieren, Lipid-Tröpfchen Phasenkontrastmikroskopie extrahierten Gele mit einer invertierten bestimmt zu visualisieren Mikroskop bei 40 X Vergrößerung. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4

Abbildung 3 : Strategie der transmigrated Zellen durch Durchflusszytometrie gating. Transmigrated Zellen zeichnen sich phänotypisch durch Durchflusszytometrie nach Gewinnung von Zellen aus Gele. Zellen werden durch (A) FSC/SSC, lebenden Zellen (B), (C) Einzelzellen, (D) CD45 angespritzt+, FSC/SSC (E) und (F) Expression des Rezeptors gegenüber Isotype oder Fluoreszenz minus 1 (FMO) Kontrolle. Ausdruck der Rezeptoren von Interesse sind definiert als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) und in Bezug auf die Ebenen der Isotype ausgedrückt. ΔMFI = Flecken (MFI) minus Isotype/FMO Kontrolle (MFI). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3

Abbildung 4 : Wirkung von EXOGEN hinzugefügt OxLDL und LDL auf Monocyte-abgeleitete Zellen Schaumbildung. Zelle Schaumbildung wird unter Bedingungen bestimmt, wo Monozyten von einem einzelnen Spender sind mit Medien (M199) inkubiert oder 50 µg/mL Low density Lipoprotein (LDL) oder Kupfer (II) Sulfat oxidiert LDL (OxLDL) hinzugefügt, um Post-Seelenwanderung Gele. Zähler für 12 verschiedene Standorte werden angezeigt. Schaumzellen werden als Prozentsatz der gesamten migrierten Zellen ausgedrückt. Mediane und interquartile Bereiche sind in Balkendiagramme dargestellt und Vergleiche wurden mit nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Tests. p < 0,001 *** p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Reagenz [Stock] [Final] Volumen für 60 Gele (µL)
NaOH 100 mM 35,7 mM 1071
M199 10 x 0,71 x 213
AcCOOH 20 mM 4,58 mM 687
Kollagen 5 mg/mL 1,71 mg/mL 1029
Gesamtvolumen - - 3000

Tabelle 1: Typ I Kollagen faserige Gel Vorbereitung

LDL oxLDL
Gel Graf Schaum-Zellen1 Migrierten Zellen1 Schaum-Zellen (%)2 Schaum-Zellen1 Migrierten Zellen1 Schaum-Zellen (%)2
1 1 5 44 11.4 26 55 47,3
2 5 27 18,5 10 23 43,5
3 11 52 21.2 19 39 48,7
2 1 5 34 14.7 9 31 29
2 14 50 28 32 55 58,2
3 5 37 13.5 19 37 51,4
3 1 10 37 27 28 52 53,8
2 7 33 21.2 11 31 35,5
3 7 38 18,4 28 53 52,8
4 1 9 44 20.5 14 33 42,4
2 7 33 21.2 22 47 46,8
3 11 50 22 11 30 36,7
Mediane Schaumzellen (%) 20,8 47
Durchschnittliche Schaumzellen (%) 19,8 45,5

Tabelle 2: Raw Zelle zählt aus Vergleich der Monocyte abgeleitet Schaumzellen nach LDL Vs OxLDL Behandlungen. 1 Zelle zählt pro Gesichtsfeld in Gel. 2 Prozentsatz der Schaumzellen = Schaum Zelle zählt/Gesamt migrierten Zelle zählt X 100. * Daten sind repräsentativ für ein Experiment mit Monozyten von einem einzelnen Spender

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Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine vielseitige und physiologisch relevante Methode für die Bewertung der Atherogenicity von Monozyten aus menschlichen klinischen Kohorten durch die Kombination von Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung. Dieses Modell bietet Vorteile gegenüber alternativen Methoden der Zelle Schaumbildung wie es die Wirkung der Monocyte Seelenwanderung auf Zelle Schaumbildung berücksichtigt und die Messung von reverse Seelenwanderung6 neben der inhärenten ermöglicht Neigung der Monozyten Reifen in Schaumzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von exogenen Faktoren. Darüber hinaus wird die Rolle der endotheliale Aktivierung auch berücksichtigt, wie wir, dass endotheliale Aktivierung reguliert Oxidation von Lipid-Arten gezeigt haben, die mit Schaum Zelle Bildung14ist. Schließlich kann der Phänotyp der Monozyten, die Ausgang (eine Eigenschaft zugeordnet Plaque Regression) unterzogen werden quantifiziert und zeichnet sich durch Mikroskopie und Flow Cytometry.

Aufgrund der dreidimensionalen Art der Seelenwanderung in Gele können identifizieren und erzielte die transmigrated Zellen wie Schaumzellen oder Makrophagen schwierig, wie Zellen auf verschiedenen Ebenen in der Gel-19transmigrate. Um die Identifizierung von Schaumzellen zu unterstützen, muss immer frisches Öl-rot O Fleck verwendet werden. Es ist auch bemerkenswert, dass verschiedene ex Vivo Krankheitszuständen oder in-vitro- Bedingungen Monocyte Seelenwanderung im Gel verändern können. Wir haben zum live Cell imaging, identifizieren, dass Monozyten von HIV-infizierten Personen tendenziell flacher Punkte in den Gelen und mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten als die von nicht infizierten Personen19transmigrate. Darüber hinaus Schaumbildung Zelle weniger Monocyte Motilität im Gel zugeordnet ist, so dass Zellen neigen dazu, im Kreis auf einem bestimmten Z-Abschnitt im Vergleich zu Zellen von HIV-infizierten Personen zu bewegen, die in der Regel in relativ gerader Linie nach migrieren der Unterseite des Gels. Diese Ergebnisse werfen die Möglichkeit, ein ähnliches Phänomen auftritt in Experimenten mit menschlichen Patientenproben aus anderen Krankheitszustände mit erhöhter Monocyte Atherogenicity verbunden.

Beim Flow Cytometry-basierte Analysen durchführen, ist es üblich, einen erheblichen Anteil der abgestorbenen Zellen in der wiederhergestellten Zellpopulation zu beobachten, bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit mit lebenden/Toten Zelle-Markern (Abbildung 4 b). Diese Zellen sind überwiegend CD45 HUVECS, die während der Verdauung/Mazeration Schritt Kollagen beschädigt sind erforderlich, um Monocyte-abgeleitete Zellen aus der Kollagen-Matrix zu extrahieren. Dieser Prozess ist besonders hart auf der HUVECS-Monolayer, sondern wirkt sich nicht nachteilig auf Phänotypisierung transmigrated Zellen.

Dieses Modell unterscheidet sich von anderen keine künstlich oxidierte exogene Lipid in Kulturmedien, Laufwerk Monocyte-abgeleitete Zellen Schaumbildung erforderlich ist. Stattdessen prägt Zelle Schaumbildung in diesem Test das Serum anwesend in Kulturmedien, zulassend die diskrete Auswirkungen der lösliche Faktoren von klinischen Proben ausgewertet werden. Als solche haben wir gezeigt, dass Inkubation der Kontrolle Monozyten mit Serum von jungen HIV-infizierten19 oder ältere Menschen HIV-infizierten20 Individuen fördert Zelle Schaumbildung, darauf hinweist, dass lösliche Faktoren unabhängig Schaum fördern können Zellbildung. Wie der Test von löslichen Komponenten beeinflusst wird, muss einem Batch von gepoolten Humanserum für Experimente zur Bestimmung des inhärenten Unterschied der atherogenen Eigenschaften von Monozyten aus verschiedenen Individuen abgeleitet verwendet werden, um zu standardisieren Bedingungen zu steuern. Dieser Test kann auch verwendet werden, um die Rolle der spezifischen Lipid Arten von klinischen Proben (Abbildung 3) zu bewerten. Zum Beispiel haben wir die Inkubation von Monozyten mit Medien mit isolierten Lipid-Arten, wie z. B. High-Density-Lipoproteine von Einzelpersonen mit bekannten Lipid Dysfunktion24 fördert auch die Schaumbildung Zelle gefunden. Monozyten aus einer gesunden Einzelperson oder Gruppe von Personen ist in diesem Fall in der Gegenwart von Serum oder Serum Faktoren abgeleitet von Testpersonen einsetzbar. Daher ermöglicht dieses Modell für spezifische Fragen über die diskrete Wirkung des löslichen und zellulären Komponenten auf Zelle Schaumbildung gestellt werden.

Dieser Assay nutzt HUVECS als ein Modell der koronaren Endothel aufgrund der praktischen Schwierigkeiten bei der Beschaffung der großen Anzahl von niedrigen Durchgang Nummer primäre koronare Zellen. Allerdings haben wir im Vergleich der Ergebnisse aus Tests mit menschlichen koronaren Endothelzellen oder HUVECS und beobachtet kaum einen Unterschied in der Monocyte Seelenwanderung oder Schaum Zellbildung (Daten nicht gezeigt), mitteilt, daß die Verwendung von Mediumwechsel in dieses System ein akzeptablen Ersatz. Manuelle Zählung der Schaumzellen ist ein limitierender Faktor in diesem Modell, da es Betreiber Bias einführen kann. Daher müssen alle Proben auf Folien montiert an den Betreiber geblendet werden, um das Potenzial der Voreingenommenheit zu entfernen. Wir haben jedoch im Vergleich Zelle Schaumbildung durch manuelle Zählung und bildgebenden Durchflusszytometrie gemessen und festgestellt, dass diese Methoden ähnliche Ergebnisse19geben. Eine wichtige Einschränkung dieses Modells ist, dass Monocyte Adhäsion und Seelenwanderung bei fehlender Zusammenhang mit physiologischen Blut fließen in VivoScherkräfte auftreten. Wir stellen die Hypothese auf, dass Schubfluss überwiegend Monocyte Seelenwanderung und nicht spätere Schaumbildung Zelle innerhalb der Matrix auswirkt; jedoch muss dies berücksichtigt bei der Interpretation der Ergebnisse aus dieser Assay. Dieser Assay Modell auch nicht den Einfluss der glatten Muskelzellen in Monocyte-abgeleitete Zellen Schaumbildung ist eine physiologische Einschränkung des Systems; Dies ist jedoch konsequent in alle Voraussetzungen für eine diskrete atherogenen Potenzial von Monozyten, zwischen verschiedenen Krankheitszuständen verglichen werden soll.

Dieses Modell bietet eine vielseitige und physiologisch relevante Methode zur Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung aus humanen Proben in verschiedenen Krankheit Staaten ex Vivo. Dieses Modell hat weitere Anwendungen für die Bewertung der Neigung der Monozyten, Schaumzellen in Bedingungen zu bilden, wo Monocyte Atherogenicity verbunden mit einem erhöhten Risiko von CAD wie Adipositas25, Diabetes26 und chronischen Nierenerkrankungen ist Krankheit-27. Daher kann dieses Modell auch für den Einsatz bei Krankheitszuständen als Arteriosklerose optimiert werden, wo die zelluläre Seelenwanderung Pathogenese der Krankheit beeinflussen können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen dankbar die Arbeit von Prof. William Müller und Dr. Clare Westhorpe für ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung der früheren Iterationen dieses Modells. Die Autoren auch möchte die AMREP Flow Cytometry Kern für die Sortierung der Monocyte Teilmengen und Alfred Hospital ansteckende Krankheit Referat klinische Forschung Krankenschwestern für die Rekrutierung von HIV + Einzelpersonen für einige Studien. Die Autoren erkennen dankbar den Beitrag zu dieser Arbeit des Victoria betriebliche Infrastruktur Support-Programms erhalten vom Burnet Institut. TAA ist durch eine RMIT University Vice-Chancellor Postdoctoral Fellowship unterstützt. Diese Arbeit wurde durch NHMRC Projekt Grant 1108792, AJ und AH ausgezeichnet unterstützt. TK stützt sich auf NIH gewährt NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gel preparation reagents
NaOH Sigma-Aldrich 221465-500G 0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199 Sigma-Aldrich M0650
AcCOOH Sigma-Aldrich 695092-100ML 20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I R&D Systems 3442-050-01 Type I Fibrous Collagen
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
M199 Life Technologies 11150-059 M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.
Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin 
M20 Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.
Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA BDH Merck 10093.5V Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA Sigma-Aldrich E3889-500G Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA Gibco 25300-054 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine Gibco 25030-081 L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin  Gibco 15140-122 Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum Gibco 16010-142 New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin Sigma-Aldrich F1056-1MG Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x) Gibco 14200-075 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF Gibco PHC3015 Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein Merck Millipore LP2-2MG Low-density lipoprotein (LDL)
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde Polysciences 4018 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol Ajax Finechem 318-2.5L GL 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain Sigma-Aldrich O0625-25G Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides Mikro-Glass S41104AMK Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips Menzel-Gläser MENCS224015GP 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape 3M Scotch 4011 Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain Merck Millipore 1.09204.0500 Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry
Collagenase D Roche Diagnostics 11088858001 Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL 
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes BD Biosciences 352235 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain Life Technologies L34959 Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96 well plate Nunclon 167008 Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish TPP 93100 Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150 Eppendorf tubes
Transfer pipette Samco Scientific 222-20S Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)

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References

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Immunologie Ausgabe 128 Atherosklerose Entzündung Monozyten Endothel Seelenwanderung Schaumzellen
Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen
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Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Maisa, A., Kelesidis, T., Jaworowski, A. Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions. J. Vis. Exp. (128), e56293, doi:10.3791/56293 (2017).

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