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Immunology and Infection

जीर्ण भड़काऊ शर्तों के साथ व्यक्तियों से Monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के ठहराव

Published: October 17, 2017 doi: 10.3791/56293
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 4, 1,3
1Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 2School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 3Department of Infectious Diseases, Monash University, 4University of California, Los Angeles

Summary

हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए मानव endothelial monolayers और उनके फोम कोशिकाओं में बाद में परिपक्वता के पार monocytes द्वारा स्थानांतरगमन उपाय । यह विभिंन रोग की स्थिति के साथ लोगों से अलग monocytes के atherogenic गुणों का आकलन करने के लिए और रक्त में कारकों का मूल्यांकन जो इस प्रवृत्ति को बढ़ा सकते है एक बहुमुखी विधि प्रदान करता है ।

Abstract

कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । Atherosclerosis, सीएडी का एक प्रमुख कारण, monocytes जमा लिपिड के भड़काऊ साइटों के लिए जंमजात प्रतिरक्षा के स्थानांतरगमन द्वारा शुरू की है फैटी धारियां बुलाया, जो मध्यम की धमनी की दीवारों में बड़ी धमनियों के लिए मौजूद हैं । atherosclerosis के इस प्रारंभिक चरण में घावों की प्रमुख रोगजनक सुविधा monocytes की परिपक्वता जो फोम कोशिकाओं या लिपिड लादेन मैक्रोफेज फार्म के लिए धमनियों में विस्थापित है । काफी सबूत परिकल्पना का समर्थन करता है कि atherosclerosis के जोखिम क्रोनिक भड़काऊ रोगों जैसे रुमेटी गठिया और एचआईवी के साथ साथ, साथ ही सामांय उंर बढ़ने के साथ वृद्धि हुई है, और है कि इस जोखिम monocyte द्वारा की भविष्यवाणी की है सक्रियण. जबकि माउस मॉडल एक अच्छा मंच के लिए vivo मेंatherogenesis में monocytes की भूमिका की जांच प्रदान करते हैं, वे प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल चयापचय और सामांय माउस आहार के कठोर परिवर्तन के आनुवंशिक परिवर्तन की आवश्यकता है, और के लिए सीमित उपयुक्तता है मानव comorbid रोगों के atherogenic प्रभावों का अध्ययन । यह हमें प्रेरित इन विट्रो मॉडल में एक मानव विकसित करने के लिए monocytes की atherogenic क्षमता को मापने के लिए परिभाषित रोग राज्यों के साथ व्यक्तियों से अलग । वर्तमान में, मानव इन विट्रो मॉडल में सीमित है कि वे अलगाव में monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन का मूल्यांकन कर रहे हैं । यहां हम एक प्रोटोकॉल में जो monocytes मानव endothelial कोशिकाओं में रोगी रक्त transmigrate से अलग एक प्रकार में 1 कोलेजन मैट्रिक्स, और उनके प्रवृत्ति उपस्थिति या exogenous लिपिड की अनुपस्थिति में फोम कोशिकाओं में परिपक्व करने के लिए मापा जाता है का वर्णन । प्रोटोकॉल मानव एचआईवी संक्रमण और बुजुर्ग एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों के साथ व्यक्तियों से शुद्ध monocytes के उपयोग के लिए मांय किया गया है । इस मॉडल बहुमुखी है और monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन या तो माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से atherogenic सीरम या प्लाज्मा में मौजूद कारकों के आकलन की अनुमति का मूल्यांकन किया जा अनुमति देता है ।

Introduction

Monocyte स्थानांतरगमन atherosclerotic पट्टिका के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है कि घनास्त्रता, स्ट्रोक और रोधगलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । Atherosclerotic सजीले टुकड़े फैटी धारियां से विकसित, आम तौर पर बड़ी धमनियों के लिए मध्यम में कम थरथरानवाला रक्त प्रवाह की साइटों पर मौजूद है, जहां जमा लिपिड endothelial सक्रियण और स्थानीयकृत सूजन के लिए योगदान देता है1. Monocytes monocyte chemotactic प्रोटीन के माध्यम से फैटी धारियां में endothelial कोशिकाओं को भर्ती कर रहे है (जैसे CCL2 के रूप में) और transmigrate में intima2। स्थानांतरगमन के बाद, monocytes atherogenic, लिपिड लादेन मैक्रोफेज लिपिड के साथ एक परिणाम के रूप में फोम कोशिकाओं कहा जाता है, लिपिड संश्लेषण, नीचे कोलेस्ट्रॉल समाप्ति के विनियमन या उपरोक्त कारकों का एक संयोजन के रूप में हो सकता है । Monocytes भी संचलन में लिपिड जमा कर सकते हैं और एक ' फोम ' phenotype है, संभवतः फोम सेल गठन के लिए3,4के लिए संवेदनशील कोशिकाओं । फोम कोशिकाओं फैटी धारियाँ और प्रारंभिक चरण atherosclerotic सजीले टुकड़े की परिभाषित करने की सुविधा है और उनके गठन दोनों लिपिड और भड़काऊ मध्यस्थों से प्रभावित है5. वैकल्पिक रूप से, monocytes खून में धमनी से transmigrate रिवर्स करने की क्षमता है6, जिससे intima से लिपिड को हटाने और धमनी के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए अभिनय.

monocytes की प्रवृत्ति का निर्धारण करने के लिए transmigrate में धमनी endothelium और फार्म फोम कोशिकाओं में intima, या रिवर्स transmigrate और ले लिपिड पट्टिका से बाहर, बढ़ाने में monocyte सक्रियण की भूमिका को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है atherosclerotic जोखिम । काडों जैसे atherosclerosis के माउस मॉडल्स में elucidating रीयल-टाइम में महत्वपूर्ण है vivo जानकारी में फैटी लकीर/atherosclerotic पट्टिका विकास । हालांकि, इन मॉडलों आमतौर पर आहार में कठोर परिवर्तन (जैसे ApoE-/पश्चिमी प्रकार के आहार मॉडल के रूप में) के साथ युग्मित इन जानवरों के प्राकृतिक कोलेस्ट्रॉल प्रसंस्करण क्षमताओं का एक आनुवंशिक परिवर्तन की आवश्यकता7,8, जिससे, उत्प्रेरण गैर-शारीरिक परिसंचारी लिपिड स्तर जो पट्टिका विकास ड्राइव का संचय । इन मॉडलों को एचआईवी संक्रमण जो वृद्धि परिसंचारी कोलेस्ट्रॉल या कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) के स्तर के साथ जुड़े नहीं है के रूप में पुरानी भड़काऊ मानव स्थितियों के लिए सीमित प्रासंगिकता हो सकता है । इसके अलावा, मनुष्यों और चूहों के बीच monocyte जीव विज्ञान में अंतर monocytes (जैसे मध्यवर्ती monocytes (CD14+ +CD16+))9 की उपजनसंख्या की प्रासंगिकता के बारे में प्रतिरक्षा प्रश्नों के परीक्षण करना मुश्किल. यह महत्वपूर्ण है जब मध्यवर्ती monocyte गिनती के रूप में हृदय रोग ड्राइविंग तंत्र का अध्ययन स्वतंत्र रूप से हृदय की घटनाओं10,11की भविष्यवाणी । जबकि परख के लिए क्रमिक रूप से मापने के लिए या तो monocyte स्थानांतरगमन या अलगाव में फोम सेल गठन, कोई इन विट्रो परख है नैदानिक साथियों से एक ही कोशिकाओं का उपयोग जल्दी atherogenesis के दोनों पहलुओं को बढ़ाता है के लिए मांय किया गया है । Transwell मॉडल एक संशोधित Boyden दो चैंबर प्रणाली जिससे कोशिकाओं शीर्ष चैंबर में भरी हुई है और एक छिद्रित प्लास्टिक बाधा या सेल monolayer भर में एक निचले कक्ष है कि आम तौर पर chemoattractant12 के साथ मीडिया में शामिल है का उपयोग , 13. Whilst व्यापक रूप से ल्युकोसैट स्थानांतरगमन का विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, इन मॉडलों को आम तौर पर एक intima का प्रतिनिधित्व परत, जन्मांतर समाधान में पलायन कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप शामिल नहीं है, और फोम सेल के माप के लिए अनुमति नहीं है एक ही कोशिकाओं के गठन या रिवर्स स्थानांतरगमन । इसके विपरीत, फोम सेल गठन के मॉडल किसी भी transmigratory प्रेरित परिवर्तन monocytes या endothelial सक्रियण जो फोम सेल गठन14में योगदान करने के लिए जाना जाता है के प्रभाव के लिए नहीं खाते । इसके अलावा, इन प्रणालियों exogenous ऑक्सीकरण कम घनत्व लिपोप्रोटीन (oxLDL)15,16, एक प्रमुख उत्प्रेरण के संतृप्त सांद्रता के अतिरिक्त द्वारा सेल संस्कृति प्लेट का पालन मैक्रोफेज से फोम सेल गठन के लिए प्रेरित फोम सेल गठन की । इन मॉडलों में प्रयोग किया जाता एलडीएल अक्सर गैर द्वारा ऑक्सीकरण-शारीरिक-प्रासंगिक प्रक्रियाओं जैसे CuSO4 उपचार17, इसलिए, इन मॉडलों का उपयोग कर अध्ययन के शारीरिक महत्व पर सवाल ।

यहां हम एक परख का वर्णन है कि quantifies monocyte स्थानांतरगमन और फोम कोशिका जो exogenous oxLDL के अलावा की आवश्यकता नहीं है एक ही कोशिकाओं के गठन, इस प्रकार फोम सेल गठन में monocytes की भूमिका बेहतर मॉडलिंग । इस मॉडल को मूल रूप से प्रोफेसर विलियम मुलर (पश्चिमोत्तर विश्वविद्यालय, शिकागो) द्वारा विकसित किया गया था18, और आगे के लिए हमारी प्रयोगशाला में परिष्कृत किया गया है का आकलन करने के लिए पूर्व vivo monocytes के atherogenicity गैर-सक्रिय के तहत पृथक अंतर्निहित भड़काऊ शर्तों के साथ व्यक्तियों से शर्तों एचआईवी संक्रमण के रूप में19 के रूप में अच्छी तरह से उंर बढ़ने के रूप में20, कि atherosclerosis का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं । यह मॉडल भी बुनियादी जैविक विभिंन monocyte उपसमुच्चय की प्रवृत्ति के बारे में जवाब के लिए एक मंच प्रदान करता है फोम कोशिकाओं के फार्म20, साइटोकिंस द्वारा endothelial सक्रियण के प्रभाव जैसे फोम सेल गठन पर TNF के रूप में14 , और monocytes के प्रवासी गुण जैसे कि जैल19में स्थानांतरगमन की गहराई और गति । इसके अलावा, monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन मानक माइक्रोस्कोपी, लाइव सेल इमेजिंग, प्रवाह cytometry और इमेजिंग प्रवाह cytometry, इसलिए, monocytes में atherogenesis की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक बहुमुखी विधि प्रदान करने का उपयोग कर मात्रा जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: मानव जैविक नमूनों का उपयोग करते हुए सभी प्रयोगों अल्फ्रेड अस्पताल मानव नैतिकता समिति, मेलबोर्न से नैतिकता अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया । सभी प्रयोगों वर्ग द्वितीय सुरक्षा अलमारियां में प्रदर्शन किया गया जब तक निर्दिष्ट । & #34;P rewarmd & #34; रिएजेंट्स का उल्लेख ३७ को गरम करना & #176; C a waterbath.

< p class = "jove_title" > 1. प्रकार की तैयारी मैं रेशेदार कोलेजन जैल: दिवस 1

  1. क्रमिक रूप से जोड़ने और मिश्रण द्वारा पॉलिमर कोलेजन जैल तैयार ३५.७ mm NaOH, ०.७१ x M199, ४.५८ mm एसिटिक एसिड और १.७१ मिलीग्राम/एमएल प्रकार मैं एक 5 मिलीलीटर polystyrene में रेशेदार कोलेजन तालिका 1 .
    के अनुसार ट्यूब नोट: सुनिश्चित करें कि कोलेजन अच्छी तरह से मिलाया जाता है धीरे से ऊपर और नीचे 5 बार pipetting के गठन को रोकने के लिए कोलेजन & #39;p ockets & #39; जेल मिश्रण में । cytometry.
    2. के लिए परीक्षण की स्थिति प्रति माइक्रोस्कोपी या 15 जैल के लिए परीक्षण हालत प्रति 4-6 जैल तैयार
  2. एक बार अच्छी तरह से मिलाया, aliquot ५० & #181; एक बाँझ फ्लैट-९६ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुआं में कोलेजन जेल मिश्रण के एल. बाहर की पंक्तियों और स्तंभों का उपयोग न करें, लेकिन इन के साथ भरें २०० & #181; L of 1x Dubecco & #39; s फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पंजाब) जैल सुखाना से बचाने के लिए । ३७ पर मशीन प्लेटें & #176; C/5% सह 2 2 ज के लिए कोलेजन polymerize करने के लिए अनुमति देने के लिए ।
    नोट: मशीन में साफ धातु रैक पर सीधे प्लेट प्लेस भी गर्मी वितरण सुनिश्चित करने के लिए ।
  3. पालन, १५० & #181 के साथ जैल ओवरले; 1x पूरक M199 के एल ( सामग्री की तालिका देखें) और 5 दिनों के लिए उपयोग तक मशीन ।
< p class = "jove_title" > 2. संग्रहित HUVEC का विस्तार: दिन 1

  1. लेबल और कोट एक 10 सेमी व्यास पेट्री डिश के साथ 1 मिलीलीटर ५० & #181; g/मिलि fibronectin 1x पंजाब में पतला और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  2. गल aliquots के cryopreserved प्राथमिक मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC, १.० x 10 6 कोशिकाओं) में 10 मिलीलीटर M20.
    नोट: HUVEC पहले वर्णित के रूप में तैयार किया जाना चाहिए < सुप class = "xref" > 21 और कम गद्यांश में प्रयुक्त होने वाली संख्या (& #60; गद्यांश 4). HUVEC मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं के साथ यहाँ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
  3. 10 मिलीलीटर M20 में HUVEC reसस्पैंड और fibronectin लेपित पकवान, aspirating अतिरिक्त fibronectin कोशिकाओं के अलावा करने से पहले जोड़ने के लिए, और संस्कृति संगम के लिए (लगभग 5 दिन), 3 दिन पर मीडिया की जगह ।
< p class = "jove_title" > 3. संवर्धन HUVEC Monolayer पर कोलेजन जैल: दिन 5

  1. दिन 5 पर, HUVEC पकवान से aspirating संस्कृति supernatant द्वारा अलग पेट्री और सीरम से युक्त मीडिया दूर सीरम-मुक्त M199 के 10 मिलीलीटर के साथ धोने ।
  2. जोड़ें 5 मिलीलीटर ०.०५% trypsin/0.53 EDTA M199 में HUVEC और कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए मशीन, धीरे मिलाते जब तक कोशिकाओं को अलग ।
  3. एक बार अलग, जल्दी कुल्ला 5 मिलीलीटर M20 के साथ पेट्री डिश और एक 10 मिलीलीटर ट्यूब के लिए कोशिकाओं से युक्त मीडिया हस्तांतरण ।
  4. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कमरे के तापमान पर नमूने केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant, २०० में कोशिकाओं reसस्पेंड & #181; M20 के एल, और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती.
  5. कोशिकाओं को reसस्पेंड २.० x 10 5 कोशिकाओं/एमएल में M20, महाप्राण से जैल पर M199 को ९६-वेल प्लेट (step १.३) और add १०० & #181; L के reसस्पैंड HUVEC (२.० x 10 4 cells) के ऊपर तैयार की गई प्रत्येक कोलेजन जेल (step १.२) । कल्चर प्लेट्स एक और 3 दिनों के लिए ३७ पर & #176; C/5% कं 2 .
    नोट: HUVEC monolayer की अखंडता की पुष्टि हो सकती है 3 दिनों के बाद सिल्वर नाइट्रेट से सना < सुप क्लास = "xref" > 22 या immunohistochemistry फॉर टाइट जंक्शन प्रोटीन्स < सुप क्लास = "xref" > 23 इस मुकाम पर. इस प्रयोजन के लिए अतिरिक्त जैल तैयार करना होगा ।
< p class = "jove_title" > 4. HUVEC के सक्रियकरण Monolayer और अलगाव/स्थानांतरगमन के लिए Monocytes का सक्रियकरण: दिन 8

  1. दिन 8 पर, प्रत्येक HUVEC Monolayer से पहले सक्रिय Monocytes के अलावा aspirating ने जैल ओवरले मीडिया M20 और जोड़ने १०० & #181; एल के 10 एनजी/ मानव TNF & #945; M20 प्रति जेल । ३७ पर मशीन & #176; ग/5% कं 2 4 ज.
    नोट: नियंत्रण के रूप में आवश्यक होने पर गैर-सक्रिय HUVEC स्थितियाँ भी शामिल हो सकती हैं.
  2. 4 ज HUVEC सक्रियण चरण के दौरान, निर्माता & #39; s निर्देश के अनुसार कक्षों के लिए नकारात्मक चयन करने के लिए चुंबकीय मनका तकनीकों का उपयोग करके PBMCs से monocytes को अलग करें । ६.५ x 10 6 PBMCs की एक ंयूनतम इस कदम पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए मज़बूती से ३.० x 10 5 monocytes एक शर्त के लिए आवश्यक है, के रूप में monocytes आम तौर पर लगभग 10-15% के लिए खाते PBMCs ।
    नोट: monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन करने से पहले monocyte सक्रियण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, monocytes इस स्तर पर सक्रिय किया जा सकता है । Monocytes यदि आवश्यक हो तो गल PBMCs से पृथक किया जा सकता है ( यानी , संग्रहित रोगी नमूने). FACS छँटाई द्वारा पृथक Monocyte उपसमुच्चय जैल ( चित्रा 1 ) के अलावा के लिए तैयार किया जा सकता है.
< p class = "jove_title" > 5. प्राइमरी ह्यूमन Monocytes के स्थानांतरगमन: दिन 8

  1. monocyte स्थानांतरगमन को मापने के लिए, TNF & #945;-युक्त मीडिया और वाश जैल दो बार १०० & #181; L M199 को जोड़कर और मीडिया से निकाल कर. धोने के बाद, जोड़ें २.० x 10 5 हौसले से पृथक या गल और धोया cryopreserved PBMCs या ५.० x 10 4 हौसले से पृथक monocytes या शुद्ध monocyte सबसेट के लिए HUVEC monolayers में १०० & #181; L M20. ३७ & #176 पर 1 ज के लिए मशीन; सी और 5% कं 2 जेल में monocytes के फॉरवर्ड स्थानांतरगमन की अनुमति देने के लिए । यह हर प्रयोगात्मक हालत की जांच के लिए 6 कुओं की अनुमति देने के लिए सबसे अच्छा है ।
    नोट: स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन पर ऑटोलॉगस सीरम के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, गर्मी निष्क्रिय दाता सीरम की वांछित एकाग्रता युक्त M20 के साथ कोशिकाओं की मशीन और एक परित मानव सीरम नियंत्रण के साथ शर्तों की तुलना करें । monocytes के अलावा ल्यूकोसाइट्स इस स्तर पर जोड़ा जा सकता है । यदि विशिष्ट लिपिड/लिपिड प्रजातियों ( जैसे , एचडीएल, oxHDL) के प्रभाव की जांच, सीरम मुक्त मीडिया के साथ सभी निम्न चरणों का पालन 20-50 & युक्त #181; g/mL रक्तदाब.
  2. के फाद 1 ज के आगे स्थानांतरगमन, १०० & #181 के साथ दो बार वाशिंग जैल द्वारा गैर जन्मांतर कोशिकाओं को इकट्ठा; 1x पंजाब में गर्म 1 मिमी EGTA के एल, और १०० के साथ एक बार & #181; l M199 (समान केंद्रापसारक शर्तें), एक ही के प्रत्येक कुआं से supernatants पूलिंग प्रयोगात्मक हालत (आमतौर पर 6 कुओं) बर्फ पर एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में । 4 & #176 पर गैर-जन्मांतर कोशिकाओं के केंद्रापसारक; C, ३०० x g 5 मिनट के लिए और 30 & #181 में reसस्पैंड; L 1x पंजाबियों.
  3. आगे जन्मांतर कक्षों की संख्या निर्धारित करने के लिए supernatant में संग्रहीत कक्षों की गणना करता है.
  4. आगे जन्मांतर कक्षों का प्रतिशत निम्नानुसार निर्धारित किया गया है:
    < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg"/> < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg"/> < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg"/>
  5. कवर को धोया १०० & #181 के साथ जन्मांतर कोशिकाओं से युक्त जैल; एल M20 और एक आगे ४८ ज.
    6. के लिए मशीन
  6. ४८ ज के बाद, supernatant को इकट्ठा करें और १०० & #181 के साथ दो बार नॉन-जन्मांतर कोशिकाओं को धो लें; L 1 mM EGTA/पंजाबियों, इकट्ठा करने और हर हालत से supernatant के रूप में चरण ५.२ में पूलिंग ।
    नोट: रिवर्स जन्मांतर कोशिकाओं के phenotype पर इन कोशिकाओं का परीक्षण किया जा सकता है following मानक प्रवाह cytometry दाग प्रोटोकॉल.
  7. केंद्रापसारक कोशिकाओं पर 4 & #176; C, ३०० x g के लिए 5 min और reसस्पैंड कक्षों में 30 & #181; L 1x पंजाबस. कोशिकाओं गिनती और व्यवहार्यता निर्धारित trypan नीले दाग के माध्यम से ।
  8. निम्न समीकरण का उपयोग करके रिवर्स जन्मांतर कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करें:
    < img alt = "समीकरण 4" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg"/>
    नोट: आगे जन्मांतर कोशिकाओं की कुल संख्या के लिए लेखांकन रिवर्स स्थानांतरगमन के एक अधिक सटीक संकेत देता है के रूप में यह संभावना नहीं है आगे स्थानांतरगमन जाएगा १००%.
  9. माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए, जैल को जोड़कर ठीक करें १०० & #181; L 2% formaldehyde (अंतिम एकाग्रता) प्रत्येक अच्छी तरह से, एल्यूमीनियम पंनी और स्टोर में प्लेटें कवर 4 & #176; C तक विश्लेषण । प्रवाह cytometry के लिए, इस अवस्था में कक्षों को ठीक न करें । माइक्रोस्कोप (धारा 6) या प्रवाह cytometry (धारा 7) विश्लेषण के लिए नीचे दिए गए प्रोटोकॉल देखें.
    चेतावनी: Formaldehyde विषाक्त और संक्षारक है; व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग करें । देखभाल जब formaldehyde जोड़ने लिया जाना चाहिए, तथापि, इस कदम के लिए एक धुएं कम इस्तेमाल किया एकाग्रता के कारण डाकू में प्रदर्शन की जरूरत नहीं है ।
< p class = "jove_title" > 6. फोम कोशिकाओं और मैक्रोफेज के Quantitation माइक्रोस्कोप द्वारा (तेल-लाल हे दाग)

  1. निकालें formaldehyde और जैल धो के साथ १०० & #181; l का ५०% (v/v) मेथनॉल के लिए 5 min और उसके बाद १०० & #181; l ७८% (v/v) मेथनॉल 15 min.
    के लिए नोट: धुंधला कदम प्रयोगशाला पीठ पर प्रदर्शन किया जा सकता है और नहीं एक वर्ग द्वितीय जोखिम कैबिनेट में ।
  2. लिपिड बूंदों के लिए दाग जोड़कर १०० & #181; नए सिरे से तैयार की ०.२% (डब्ल्यू/वी) के एल तेल लाल हे (विवरण के लिए सामग्री के तालिका देखें) 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।
  3. जैल धोने से अतिरिक्त दाग हटाने के लिए 4 बार १०० & #181 के साथ, ७८% (v/v) का L मेथनॉल, aspirating और supernatant के बाद प्रत्येक वाश को छोड दें.
    4. १०० & #181 के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए
  4. Counterstain, Giemsa के एल, आसुत जल में 1:10 पतला ।
  5. महाप्राण पानी के साथ एक बार Giemsa दाग और वॉश जैल लें ।
  6. प्लेट से जैल अलग करने के लिए, एक 21 जी सुई का उपयोग कर कुओं रिम, बाहर की ओर का सामना करना पड़ बेवल के साथ, जेल के किनारे के आसपास.
  7. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जैल माउंट करने के लिए, डबल पक्षीय टेप के एक २.५४ सेमी x १.५ सेमी पट्टी में दो छेद (६.३५ मिमी व्यास) पंच । एक मानक खुर्दबीन साइड करने के लिए टेप ठीक करें और ऊपर से सुरक्षात्मक कोटिंग निकालें ।
    1. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर टेप में छेद करने के लिए पानी की एक बूंद जोड़ें । चिमटी का प्रयोग, धीरे टेप में छेद करने के लिए जैल हस्तांतरण और एक आकार १.५ ग्लास coverslip के साथ कवर । टेप करने के लिए यह पालन करने के लिए coverslip पर धीरे दबाएँ.
  8. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग 40X उद्देश्य के साथ की जांच करें ।
    1. HUVEC monolayer को ध्यान में लाते 40X आवर्धन और स्क्रोल & #39; in & #39; जेल, गिनती मैक्रोफेज/फोम कोशिकाओं जेल की पूरी गहराई भर में । संभव बढ़त प्रभाव को कम करने के क्रम में जेल के किनारे से समान दूरी पर स्थित देखने के तीन अलग क्षेत्रों के लिए दोहराएँ. यह सुनिश्चित करेगा जेल गहराई गिनती क्षेत्रों के बीच संगत है ।
      नोट: या तो फोम कोशिकाओं के रूप में जेल में स्कोर कोशिकाओं (& #62 युक्त कोशिकाओं के रूप में परिभाषित; 1/3 उनके कोशिका के रूप में तेल-लाल हे सना हुआ लिपिड बूंदों) या मैक्रोफेज स्लाइड पर बढ़ते के 2 ज के भीतर (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा २       ). फोम सेल गठन फोम कोशिकाओं के प्रतिशत की कुल संख्या के सापेक्ष के रूप में व्यक्त की गई है और औसत गिनती देखने के 3 क्षेत्रों में स्थिति प्रति 6 जैल के लिए जांच की है, इसलिए हालत प्रति 18 माप का एक औसत के रूप में व्यक्त की है । एक विशिष्ट प्रयोग से raw कक्ष गणना का एक उदाहरण तालिका 2 में दिखाया गया है .
      नोट: माइक्रोस्कोपी द्वारा macrophage बनाम फोम सेल के रूप में एक कोशिका को वर्गीकृत व्यक्तिपरक होता है और इसके फलस्वरूप खोजी-निर्भर हो सकता है । नैदानिक अध्ययन में, जहां प्रयोगों समय की एक विस्तारित अवधि में प्रदर्शन कर रहे हैं, यह सभी गिनती के लिए महत्वपूर्ण है एक ही अंवेषक द्वारा अंधा प्रदर्शन किया जाएगा । जैल में फोम कोशिकाओं और मैक्रोफेज के उदाहरण < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 में प्रदान किए जाते हैं.
< p class = "jove_title" > 7. प्रवाह Cytometry द्वारा जन्मांतर कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. करने के लिए phenotypically की विशेषताएं फोम कोशिकाओं और मैक्रोफेज निंनलिखित transendothelial प्रवासन, जैल को जोड़कर डाइजेस्ट १०० & #181; L के ३७ & #176; ग गरम 1 mg/मिलि collagenase D पतला करने के लिए M199 में एक अच्छी तरह से और ३७ पर 20 मिनट के लिए मशीन & #176; C/5% कं 2 .
    नोट: प्लेस ९६-अच्छी तरह से मशीन में साफ धातु रैक पर सीधे प्लेटें भी गर्मी वितरण सुनिश्चित करने के लिए ।
  2. के बाद, macerate एक २०० & #181 का उपयोग कर जैल; L पिपेट टिप और एक आगे 20 मिनट के लिए मशीन पर ३७ & #176; C/5% कं 2 .
  3. एक बार पूरी तरह से पचा, फिल्टर और ३५ & #181 के माध्यम से पच दोहराने जैल पूल; मीटर नायलॉन जाल छाया हुआ FACS बर्फ पर रखा ट्यूबों, और धोने के साथ एक बार FACS धो (देखें सामग्री की तालिका ) पर 4 & #176; C, ३०० x g. १०० में कक्षों को पुनर्निलंबित & #181; L of FACS धो.
  4. fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी CD45, एक जीवित/मृत सेल मार्कर और सतह/intracellular phenotypic या ब्याज की कार्यात्मक मार्करों मानक प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल का उपयोग कर के लिए विशिष्ट के साथ परिणामी कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: उचित fluorophores और ़ मुआवजा मोतियों का उपयोग क्षतिपूर्ति के लिए नियंत्रण ट्यूबों तैयार करते हैं । निकाली कोशिकाओं को भी cytospinning द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए कांच स्लाइड पर एकत्र किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, हम सफलतापूर्वक इमेजिंग प्रवाह cytometry.
    5. के माध्यम से आकलन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कोशिकाओं को एकत्र किया है
  5. एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर कोशिकाओं के अधिग्रहण, और मुआवजे के रूप में आवश्यक प्रदर्शन ।
    नोट: के रूप में फोम कोशिकाओं/मैक्रोफेज व्यक्तिगत आबादी प्रकाश तितर बितर गुणों का उपयोग कर फार्म नहीं कर सकते है और काफी आकार और आकार में अलग हो सकता है, सेट उदारवादी आगे तितर बितर (FSC) और साइड कैटर (एसएससी) गेट्स के रूप में दिखाया के रूप में सभी माइग्रेट कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए .
  6. निंन प्राप्ति, प्रवाह cytometry सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण निष्पादित करें । माइग्रेट किए गए कक्षों की पहचान करने के लिए, पहले live/मृत मार्कर के लिए ऋणात्मक के रूप में कक्षों का चयन करें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र बी . अगले, एक एसएससी-क्षेत्र बनाम एसएससी-ऊंचाई भूखंड पर दिखाया कोशिकाओं के आसपास एक तंग गेट बनाकर एक एकल सेल भेदभाव करते हैं ।
  7. Select CD45 + कोशिकाओं और गेट एक FSC/एसएससी भूखंड में मौजूद माइग्रेट कोशिकाओं की प्रमुख आबादी के रूप में इन मैक्रोफेज/फोम कोशिकाओं रहे हैं ।

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Representative Results

यों तो monocyte स्थानांतरगमन

Monocytes को आरेख 1में बताए गए मॉडल में जोड़ा जाता है, और प्रत्येक शर्त के लिए छह जैल तैयार किए जाते हैं । प्रति दाता 6 जैल के लिए Monocytes (यानी, ५.० x 104 Monocytes प्रति जेल 6 जैल = ३.० x 105 Monocytes प्रति दाता) M199 मीडिया के ६०० µ l की एक अंतिम मात्रा के लिए reसस्पैंड कर रहे हैं जिसमें आवश्यक सीरम/ कोशिकाओं (अर्थात्, १०० µ एल प्रति जेल = ५.० x 104 monocytes) तो जैल पर aliquoted और 1 के रूप में ऊपर के रूप में मशीन है monocyte स्थानांतरगमन की सुविधा के लिए एच । निंनलिखित स्थानांतरगमन, गैर जन्मांतर कोशिकाओं के रूप में ऊपर गिना जाता है । इस उदाहरण में, १.५ x 104 गैर-जन्मांतर कक्ष पुनर्प्राप्त किए गए थे । चरण ५.४ में वर्णित सूत्र का उपयोग कर अग्रेषित स्थानांतरगमन का प्रतिशत निर्धारित किया गया था:

Equation 5

Equation 6

निंनलिखित ४८ मशीन के एच, ३.६ x 104 रिवर्स जन्मांतर कोशिकाओं के रूप में ऊपर बरामद किए गए । चरण ५.८ में सूत्र का उपयोग कर रिवर्स स्थानांतरगमन का प्रतिशत निर्धारित किया गया था:

Equation 7

आगे और रिवर्स स्थानांतरगमन उचित सांख्यिकीय परीक्षणों का उपयोग कर शर्तों के बीच तुलना की जा सकती है और कई स्वतंत्र दाताओं से तैयार monocytes निर्धारित करने के लिए कि क्या monocyte स्थानांतरगमन क्षमता प्रयोगात्मक के बीच बदल रहा है स्थितियों.

फोम सेल के गठन का मूल्यांकन

Brightfield माइक्रोस्कोपी

ऑक्सीकरण लिपो monocyte-ऑक्सीकरण लिपिड15की तुलना में इन विट्रो में व्युत्पंन फोम सेल गठन को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है । यहां हम पुष्टि करते है कि oxLDL के साथ monocytes के उपचार, सामांयतः पारंपरिक फोम सेल प्रेरण मॉडल में फोम सेल गठन के लिए प्रेरित किया, monocyte को बढ़ाता है-transendothelial प्रवासन और फोम सेल गठन के इस मॉडल में फोम सेल गठन व्युत्पंन मूल एलडीएल की तुलना में । निंन monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन जैल में ५० µ जी/एमएल देशी या CuSO4-ऑक्सीकरण युक्त एलडीएल M199 के साथ मशीन (देखें चरण ५.१, चित्रा 1), कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । प्रतिनिधि प्रयोगों में मनाया फोम कोशिकाओं और मैक्रोफेज के उदाहरण चित्रा 2में दिखाया गया है. कोशिकाओं को तीन जेल प्रति अलग क्षेत्रों में गिना, HUVEC monolayer पर ध्यान केंद्रित करके और उत्तरोत्तर जेल में गहरा ध्यान केंद्रित कर रहे थे । सेल गिनती प्रत्येक दाता के लिए दर्ज कर रहे है के रूप में एक एकल दाता के लिए 2 तालिका में दिखाया गया है, फोम ऑक्सीकरण और देशी एलडीएल के जवाब में गठित कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना । n से कुल डेटा = 12 स्वतंत्र गिनती चित्रा 4 में दिखाया गया है कि इस मॉडल में oxLDL के साथ monocytes की मशीन की पुष्टि करने की स्थिति से अधिक फोम सेल गठन लाती है जहां monocytes देशी एलडीएल या M199 अकेले मीडिया के साथ मशीन हैं ।

प्रवाह cytometry

माइग्रेट किए गए कक्षों की phenotype का निर्धारण करने के लिए, कक्षों को पचता जैल से निकाला जाता है और एक मानक प्रवाह cytometry पैनल का उपयोग करके लेबल होता है. कोशिकाओं को एक जीवित/मृत सेल मार्कर और CD45 और अंय मानक प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल का उपयोग कर अंय सतह phenotype मार्करों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल थे । मुआवजा नियंत्रण भी मानक प्रवाह cytometry तकनीक के अनुसार पूरा मुआवजा के लिए तैयार किया जाना चाहिए । माइग्रेट किए गए कक्ष 10 स्वतंत्र प्रयोगों के प्लॉट प्रतिनिधि में आरेख 3 में दर्शाए अनुसार gated होते हैं । लाइव कोशिकाएं लाइव/मृत कोशिका व्यवहार्यता परख (चित्र 3 बी) का उपयोग कर gated है और दोहरी एकल सेल विश्लेषण (चित्रासी सी) द्वारा छोड़े गए हैं । कोशिकाओं को तो CD45 के रूप में gated है+ HUVEC को बाहर करने के लिए (के रूप में इन कोशिकाओं को CD45 है-, चित्र 3 डी) । प्रमुख जनसंख्या तो gated है फॉरवर्ड स्कैटर/साइड स्कैटर भेदभाव (चित्रा 3E) और ब्याज की रिसेप्टर्स की प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) या तो प्रतिदीप्ति ऋण एक (एफएमओ) या isotype नियंत्रण की तुलना में निर्धारित कर रहे हैं ( चित्रा 3F) अभिव्यक्ति (ΔMFI) या धनात्मक कक्षों का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए ।

Figure 1
चित्र 1 : एक इन विट्रो monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के मॉडल । ( क) PBMC, (ख) कुल monocytes या (ग) FACS-क्रमबद्ध monocyte उपसमुच्चय टाइप करने के लिए जोड़ रहे हैं मैं रेशेदार कोलेजन जैल ९६ में गठित-अच्छी तरह से प्लेटें और सक्रिय प्राथमिक मानव गर्भनाल के एक monolayer के साथ मढ़ा नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC), जिनकी अखंडता का मूल्यांकन किया जा सकता है द्वारा चांदी धुंधलान (D) और (ई) transmigrate के लिए अनुमति दी 1 एच के लिए सीरम या लिपिड युक्त मीडिया की उपस्थिति में. गैर जन्मांतर कोशिकाओं को गिना जाता है ( F) और जैल एक और ४८ एच के लिए एक ही सीरम/ निंनलिखित मशीन, ( छ) रिवर्स माइग्रेट कोशिकाओं को गिना जाता है और जेल में फोम कोशिकाओं बनाम मैक्रोफेज का प्रतिशत (एच) के चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ दाग निंनलिखित तेल लाल हे या द्वारा निर्धारित होता है माइग्रेट किए गए कक्षों की phenotype ( I) प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित होती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक में फोम कोशिकाओं और मैक्रोफेज के उदाहरण इन विट्रो monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के मॉडल । Representatकोशिकाओं के ive उदाहरण फोम कोशिकाओं के रूप में बनाए गए (सफेद तीर) और मैक्रोफेज (काले तीर) Giemsa के बाद कोशिकाओं और तेल-लाल हे के लिए लिपिड बूंदों कल्पना के रूप में एक औंधा का उपयोग कर निकाली जैल के चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी से निर्धारित धुंधला 40X आवर्धन पर माइक्रोस्कोप । स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4

चित्र 3 : जन्मांतर कोशिकाओं के प्रवाह cytometry द्वारा गेटिंग रणनीति । जन्मांतर कोशिकाओं जैल से कोशिकाओं के निष्कर्षण के बाद cytometry प्रवाह द्वारा विशेषता phenotypically हैं । कोशिकाओं (A) FSC/SSC द्वारा gated हैं, (ख) जीवित कोशिकाओं, (ग) एकल कोशिकाओं, (घ) CD45+, (ई) FSC/एसएससी और (एफ) रिसेप्टर की अभिव्यक्ति isotype या प्रतिदीप्ति ऋण एक (एफएमओ) नियंत्रण की तुलना में । ब्याज की रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) के रूप में परिभाषित कर रहे हैं और isotype के स्तर के संबंध में व्यक्त की. ΔMFI = दाग (mfi) शूंय से isotype/एफएमओ नियंत्रण (mfi) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3

चित्र 4 : exogenously के प्रभाव जोड़ा oxLDL और monocyte पर एलडीएल-फोम सेल गठन व्युत्पंन । फोम सेल गठन की शर्तों के तहत निर्धारित किया जाता है, जहां एक दाता से monocytes मीडिया (M199) या ५० µ जी/एमएल ऑक्सीकरण कम घनत्व लिपोप्रोटीन (एलडीएल) या तांबे (द्वितीय) सल्फेट ऑक्सीकरण एलडीएल (oxLDL) के साथ मशीन के बाद जैल-स्थानांतरगमन जोड़ा । 12 अलग साइटों के लिए गिनती दिखाए जाते हैं । फोम कोशिकाओं को कुल माइग्रेट कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । माध्य और interquartile पर्वतमाला बार रेखांकन में दिखाया गया है और तुलना गैर पैरामीट्रिक मान-Whitney यू परीक्षण का उपयोग कर बनाया गया । प & #60; ०.००१, * * * * प & #60; ०.०००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक शेयर] अंतिम] ६० जैल (µ एल) के लिए वॉल्यूम
naoh १०० एमएम ३५.७ एमएम १०७१
m199 10x 0.71 x २१३
AcCOOH 20 एमएम ४.५८ एमएम ६८७
कोलेजन 5 मिलीग्राम/ १.७१ मिलीग्राम/एमएल १०२९
कुल मात्रा - - ३०००

तालिका 1: प्रकार मैं रेशेदार कोलेजन जेल तैयारी

एलडीएल oxLDL
gel गिनती फोम कोशिकाओं1 माइग्रेट किए गए कक्ष1 फोम कोशिकाओं (%)2 फोम कोशिकाओं1 माइग्रेट किए गए कक्ष1 फोम कोशिकाओं (%)2
1 1 5 ४४ ११.४ 26 ५५ ४७.३
2 5 27 १८.५ 10 23 ४३.५
3 11 ५२ २१.२ 19 ३९ ४८.७
2 1 5 ३४ १४.७ 9 31 29
2 14 ५० 28 ३२ ५५ ५८.२
3 5 ३७ १३.५ 19 ३७ ५१.४
3 1 10 ३७ 27 28 ५२ ५३.८
2 7 ३३ २१.२ 11 31 ३५.५
3 7 ३८ १८.४ 28 ५३ ५२.८
4 1 9 ४४ २०.५ 14 ३३ ४२.४
2 7 ३३ २१.२ 22 ४७ ४६.८
3 11 ५० 22 11 30 ३६.७
माध्य फोम कोशिकाओं (%) २०.८ ४७
औसत फोम कोशिकाओं (%) १९.८ ४५.५

तालिका 2: monocyte की तुलना से कच्चे सेल मायने रखता फोम कोशिकाओं एलडीएल बनाम oxLDL उपचार के बाद । 1 जेल में देखने के प्रति क्षेत्र सेल गिना जाता है । 2 फोम कोशिकाओं का प्रतिशत = फोम सेल गणना/कुल माइग्रेटेड सेल काउंट्स x १०० । * डेटा एक ही दाता से monocytes का उपयोग कर एक प्रयोग के प्रतिनिधि है

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित मानव नैदानिक साथियों से monocytes के atherogenicity का आकलन करने के लिए एक बहुमुखी और शारीरिक रूप से प्रासंगिक विधि प्रदान करता है, दोनों monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के संयोजन से । यह मॉडल फोम सेल गठन के वैकल्पिक तरीकों पर लाभ प्रदान करता है के रूप में यह खाते में फोम सेल गठन पर monocyte स्थानांतरगमन के प्रभाव में ले जाता है और रिवर्स स्थानांतरगमन के माप की अनुमति देता है6 के अलावा अंतर्निहित monocytes की प्रवृत्ति उपस्थिति या exogenous कारकों की अनुपस्थिति में फोम कोशिकाओं में परिपक्व करने के लिए । इसके अलावा, endothelial सक्रियण की भूमिका को भी ध्यान में रखा गया है क्योंकि हमने दिखाया है कि endothelial सक्रियण लिपिड प्रजातियों के ऑक्सीकरण को नियंत्रित करता है जो फोम सेल के गठन14के साथ संबद्ध है । अंत में, monocytes कि निकास से गुजरना phenotype (पट्टिका प्रतिगमन के साथ जुड़े एक संपत्ति) मात्रा और सूक्ष्म और प्रवाह cytometry द्वारा विशेषता हो सकती है ।

जैल में स्थानांतरगमन के तीन आयामी प्रकृति के कारण, की पहचान करने और फोम कोशिकाओं या मैक्रोफेज के रूप में जन्मांतर कोशिकाओं स्कोरिंग मुश्किल हो सकता है के रूप में कोशिकाओं को जेल में विभिन्न स्तरों के लिए transmigrate19. फोम कोशिकाओं की पहचान सहायता करने के लिए, ताजा तेल लाल हे दाग हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह भी ध्यान दें कि विभिंन पूर्व vivo रोग राज्यों या इन विट्रो शर्तों जेल में monocyte स्थानांतरगमन बदल सकता है । हम रहते सेल इमेजिंग का इस्तेमाल किया है की पहचान है कि एचआईवी से monocytes संक्रमित व्यक्तियों को जैल में और संक्रमित व्यक्तियों से उन से उन से अलग गति पर transmigrate के लिए करते है19। इसके अलावा, फोम सेल गठन जेल में कम monocyte गतिशीलता के साथ जुड़ा हुआ है तो कोशिकाओं को एक विशेष z-एचआईवी से कोशिकाओं की तुलना में खंड में हलकों में कदम करते है संक्रमित व्यक्तियों, जो की दिशा में एक अपेक्षाकृत सीधी रेखा में माइग्रेट करते है जेल के नीचे । ये निष्कर्ष एक ऐसी ही घटना की संभावना बढ़ा monocyte atherogenicity के साथ जुड़े अन्य रोग राज्यों से मानव रोगी नमूनों का उपयोग प्रयोगों में होने वाली.

जब प्रवाह cytometry आधारित विश्लेषण यह आम है बरामद सेल जनसंख्या में मृत कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात का पालन करते समय जब व्यवहार्यता का आकलन live/मृत सेल मार्करों (चित्रा 4B) । इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से CD45- HUVEC कि कोलेजन पाचन के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे है/थकावट कदम monocyte-कोलेजन मैट्रिक्स से व्युत्पंन कोशिकाओं को निकालने की आवश्यकता है । इस प्रक्रिया HUVEC monolayer पर विशेष रूप से कठोर है, लेकिन जन्मांतर कोशिकाओं phenotyping के लिए हानिकारक नहीं है ।

इस मॉडल में दूसरों से अलग है कि कोई कृत्रिम रूप से ऑक्सीकरण exogenous लिपिड संस्कृति मीडिया में आवश्यक monocyte ड्राइव फोम सेल गठन व्युत्पंन है । इसके बजाय, इस परख में फोम सेल गठन संस्कृति मीडिया में मौजूद सीरम से प्रभावित है, नैदानिक नमूनों से घुलनशील कारकों के असतत प्रभाव के लिए अनुमति का मूल्यांकन किया जाएगा । जैसे, हम या तो युवा एचआईवी संक्रमित19 या बुजुर्ग एचआईवी से सीरम के साथ नियंत्रण monocytes की कि मशीन से पता चला है संक्रमित20 व्यक्तियों फोम सेल गठन को बढ़ावा देता है, यह दर्शाता है कि घुलनशील कारकों स्वतंत्र रूप से फोम को बढ़ावा कर सकते है सेल गठन । के रूप में परख घुलनशील घटकों से प्रभावित है, परित मानव सीरम का एक बैच विभिंन व्यक्तियों से व्युत्पंन monocytes के atherogenic गुणों के अंतर्निहित अंतर का निर्धारण करने के उद्देश्य से प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए मानकीकरण नियंत्रण शर्तें । यह परख भी नैदानिक नमूनों से विशिष्ट लिपिड प्रजातियों की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 3). उदाहरण के लिए, हम इस तरह के ज्ञात लिपिड रोग24 के साथ व्यक्तियों से उच्च घनत्व लिपो के रूप में अलग लिपिड प्रजातियों युक्त मीडिया के साथ monocytes की कि मशीन पाया है फोम सेल गठन को बढ़ावा देता है । इस मामले में, एक ही स्वस्थ व्यक्ति या व्यक्तियों के समूह से monocytes सीरम या सीरम परीक्षण विषयों से व्युत्पंन कारकों की उपस्थिति में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, यह मॉडल विशिष्ट प्रश्नों के लिए अनुमति देता है फोम सेल गठन पर दोनों घुलनशील और सेलुलर घटकों के असतत प्रभाव के बारे में पूछा जाएगा ।

यह परख कोरोनरी धमनी endothelium के एक मॉडल के रूप में HUVEC का उपयोग करता है कम गद्यांश संख्या प्राथमिक कोरोनरी धमनी कोशिकाओं की बड़ी संख्या प्राप्त करने में व्यावहारिक कठिनाई के कारण । हालांकि, हम दोनों मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं या HUVEC का उपयोग कर परख से परिणामों की तुलना की है और monocyte स्थानांतरगमन या फोम सेल गठन में थोड़ा अंतर देखा (डेटा दिखाया नहीं), यह दर्शाता है कि इस प्रणाली में HUVECs का उपयोग एक स्वीकार्य विकल्प । फोम कोशिकाओं के मैनुअल गिनती इस मॉडल में एक सीमित कारक के रूप में यह ऑपरेटर पूर्वाग्रह परिचय हो सकता है । इसलिए, सभी नमूनों स्लाइड पर घुड़सवार परिचालक के लिए अंधा कर दिया जाना चाहिए ताकि पूर्वाग्रह की क्षमता को दूर करने के लिए । हम है, तथापि, फोम सेल गठन की तुलना के रूप में मैनुअल गिनती और इमेजिंग प्रवाह cytometry द्वारा मापा और पाया कि इन तरीकों के समान परिणाम19दे । इस मॉडल की एक प्रमुख सीमा है कि monocyte आसंजन और स्थानांतरगमन vivo मेंशारीरिक रक्त प्रवाह के साथ जुड़े कतरनी बलों के अभाव में होते हैं । हम परिकल्पना कि कतरनी प्रवाह मुख्य रूप से monocyte स्थानांतरगमन और नहीं बाद में मैट्रिक्स के भीतर फोम सेल गठन को प्रभावित करेगा; हालांकि, इस पर विचार किया जाना चाहिए जब इस परख से परिणाम की व्याख्या । यह परख भी monocyte में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के प्रभाव-फोम कोशिका गठन जो प्रणाली की एक शारीरिक सीमा है व्युत्पंन नहीं करता है; हालांकि, यह सभी monocytes की असतत atherogenic क्षमता विभिंन रोग राज्यों के बीच की तुलना में होने की अनुमति शर्तों में संगत है ।

सारांश में, यह मॉडल अलग रोग राज्यों में मानव नमूनों से monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन को बढ़ाता है के लिए एक बहुमुखी और शारीरिक रूप से प्रासंगिक विधि प्रदान करता है पूर्व vivo. इस मॉडल के लिए monocytes की प्रवृत्ति के मूल्यांकन के लिए आगे आवेदन किया है शर्तों में फोम कोशिकाओं जहां monocyte atherogenicity जैसे मोटापा25, मधुमेह26 और क्रोनिक गुर्दे के रूप में सीएडी के बढ़ जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है रोग27. इसलिए, इस मॉडल भी atherosclerosis जहां सेलुलर स्थानांतरगमन रोग रोगजनन को प्रभावित कर सकते है के अलावा अंय रोग राज्यों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक आभार प्रो विलियम मुलर और डॉ क्लेयर Westhorpe इस मॉडल के पहले पुनरावृत्तियों के विकास में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए के काम को स्वीकार करते हैं । लेखक भी कुछ अध्ययनों के लिए एचआईवी + व्यक्तियों की भर्ती के लिए monocyte उपसमुच्चय और अल्फ्रेड अस्पताल संक्रामक रोग इकाई नैदानिक अनुसंधान नर्सों की छंटाई के लिए AMREP फ्लो Cytometry कोर का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । लेखक कृतज्ञता Burnet संस्थान द्वारा प्राप्त विक्टोरिया संचालन अवसंरचना सहायता कार्यक्रम के इस कार्य में योगदान को स्वीकार करते हैं । ताा एक RMIT विश्वविद्यालय के कुलपति Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है । यह काम NHMRC परियोजना अनुदान ११०८७९२ अज और आह करने के लिए संमानित द्वारा समर्थित किया गया था । TK NIH अनुदान NIH K08AI08272, NIH/NCATS ग्रांट # UL1TR000124 द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gel preparation reagents
NaOH Sigma-Aldrich 221465-500G 0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199 Sigma-Aldrich M0650
AcCOOH Sigma-Aldrich 695092-100ML 20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I R&D Systems 3442-050-01 Type I Fibrous Collagen
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
M199 Life Technologies 11150-059 M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.
Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin 
M20 Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.
Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA BDH Merck 10093.5V Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA Sigma-Aldrich E3889-500G Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA Gibco 25300-054 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine Gibco 25030-081 L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin  Gibco 15140-122 Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum Gibco 16010-142 New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin Sigma-Aldrich F1056-1MG Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x) Gibco 14200-075 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF Gibco PHC3015 Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein Merck Millipore LP2-2MG Low-density lipoprotein (LDL)
Name Company Catalog Number Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde Polysciences 4018 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol Ajax Finechem 318-2.5L GL 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain Sigma-Aldrich O0625-25G Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides Mikro-Glass S41104AMK Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips Menzel-Gläser MENCS224015GP 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape 3M Scotch 4011 Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain Merck Millipore 1.09204.0500 Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry
Collagenase D Roche Diagnostics 11088858001 Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL 
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes BD Biosciences 352235 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain Life Technologies L34959 Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96 well plate Nunclon 167008 Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish TPP 93100 Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150 Eppendorf tubes
Transfer pipette Samco Scientific 222-20S Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक १२८ Atherosclerosis शोथ monocytes endothelium स्थानांतरगमन फोम कोशिकाओं
जीर्ण भड़काऊ शर्तों के साथ व्यक्तियों से Monocyte स्थानांतरगमन और फोम सेल गठन के ठहराव
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Angelovich, T. A., Hearps, A. C.,… More

Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Maisa, A., Kelesidis, T., Jaworowski, A. Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions. J. Vis. Exp. (128), e56293, doi:10.3791/56293 (2017).

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