Summary
Descriviamo un protocollo per misurare trasmigrazione dai monociti attraverso strati monomolecolari endoteliali umani e la loro successiva maturazione in cellule della gomma piuma. Questo fornisce un metodo versatile per valutare le proprietà atherogenic dei monociti isolati da persone con diverse patologie e per valutare i fattori nel sangue che possono migliorare questa propensione.
Abstract
Malattia coronarica (CAD) è delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Aterosclerosi, dei principali causa di CAD, è iniziata dalla trasmigrazione dei monociti immune innati a siti infiammatori del lipido depositato chiamato strisce grasse, che sono presenti nelle pareti arteriose del mezzo alle grandi arterie. La caratteristica fondamentale di patogena delle lesioni in questa fase iniziale di aterosclerosi è la maturazione dei monociti che migrano nelle arterie per formare cellule schiumose o macrofagi lipido-carichi. La considerevole prova sostiene l'ipotesi che il rischio di aterosclerosi è aumentato di condizioni infiammatorie croniche, malattie come l'artrite reumatoide e l'HIV, come pure l'invecchiamento generale di accompagnamento, e che questo rischio è previsto da monocito attivazione. Mentre modelli murini di fornire una buona piattaforma per studiare il ruolo dei monociti nel atherogenesis in vivo, richiedono alterazione genetica del metabolismo del colesterolo naturali e drastica alterazione delle diete normali del topo e hanno limitato l'idoneità per lo studio delle influenze atherogenic di malattie umane del comorbid. Questo ci ha motivato a sviluppare un modello umano in vitro per misurare il potenziale atherogenic di monociti isolati da individui con Stati di malattia definita. Attualmente, modelli umani in vitro sono limitanti in quanto valutano la formazione delle cellule di monocito trasmigrazione e schiuma in isolamento. Qui descriviamo un protocollo in cui monociti isolati da sangue del paziente trasmigrano in cellule endoteliali umane in una matrice di collagene di tipo 1, e viene misurata la loro propensione a maturare in cellule della gomma piuma in presenza o assenza di esogena del lipido. Il protocollo è stato convalidato per l'uso dei monociti umani purificati da individui con infezione da HIV e individui anziani non infetti da HIV. Questo modello è versatile e permette la formazione di monocito trasmigrazione e schiuma delle cellule deve essere valutata usando sia la microscopia o citometria a flusso, nonché a consentire la valutazione dei fattori atherogenic presenti nel siero o plasma.
Introduction
Trasmigrazione del monocito è un passo cruciale nello sviluppo della placca aterosclerotica che può portare a trombosi, ictus e infarto miocardico. Le placche aterosclerotiche si sviluppano da strisce grasse, generalmente presente nei siti di flusso sanguigno oscillatorio basso in mezzo alle grandi arterie, dove depositato lipidica contribuisce all'attivazione endoteliale e localizzata infiammazione1. I monociti sono reclutati alle cellule endoteliali in strisce grasse tramite proteine chemiotattica del monocito (ad esempio CCL2) e trasmigrano nei intima2. A seguito di trasmigrazione, monociti possono formare i macrofagi atherogenic, lipido-carichi, chiamati cellule della schiuma in conseguenza l'assorbimento del lipido, sintesi del lipido, down-regulation di efflusso di colesterolo o una combinazione di fattori di cui sopra. I monociti possono anche accumulare lipidi nella circolazione e hanno un fenotipo 'schiumoso', possibilmente che predispongono le cellule per schiuma cellulare formazione3,4. Cellule della gomma piuma sono la caratteristica distintiva delle strisce grasse e placche aterosclerotiche fase iniziale e la loro formazione è influenzata da mediatori infiammatori5e del lipido. In alternativa, i monociti hanno la capacità di invertire trasmigrano dall'arteria nella circolazione sanguigna6, eliminando dei lipidi dalla biancheria intima e di agire per mantenere la salute dell'arteria.
Determinare la propensione dei monociti ad trasmigrano attraverso endotelio arterioso e formare cellule di schiuma nel intima o invertire trasmigrano e trasportano lipidi fuori la placca, sono un requisito fondamentale per comprendere il ruolo dell'attivazione del monocito in aumento rischio aterosclerotico. Modelli murini di CADs quali aterosclerosi sono importanti nel delucidamento in tempo reale in vivo informazioni sullo sviluppo di fatty streak/aterosclerotica della placca. Tuttavia, questi modelli richiedono un'alterazione genetica del colesterolo naturale abilità di questi animali solitamente accoppiati con drastiche modifiche nella dieta (ad esempio il modello di dieta di ApoE-/-Western-tipo)7,8, quindi, di elaborazione induzione non fisiologico accumulo di lipidi di circolazione livelli quali lo sviluppo della placca di unità. Questi modelli possono avere limitate rilevanza a condizioni umane infiammatorie croniche quali l'infezione da HIV che non sono associate con aumentato di circolazione colesterolo o livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL). Inoltre, le differenze nella biologia del monocito tra esseri umani e topi fanno il test immunologico domande per quanto riguarda la pertinenza delle sottopopolazioni dei monociti (ad esempio intermedi monociti (CD14 ++CD16+))9 difficile. Questo è importante quando si studia i meccanismi che guidano la malattia cardiovascolare come intermedio del monocito conteggi predicono indipendente eventi cardiovascolari10,11. Mentre le analisi esistono per misurare in modo sequenziale o formazione di cellule monocito trasmigrazione o schiuma in isolamento, nessun test in vitro è stato convalidato per quantificare sia gli aspetti di atherogenesis iniziale utilizzando le stesse cellule da coorti cliniche. Transwell modelli utilizzano un sistema a doppia camera Boyden modificato per cui le cellule vengono caricati in camera superiore e trasmigrano attraverso una barriera di plastica porosa o monostrato di cellule in un alloggiamento più basso che in genere contiene supporto con chemoattractant12 , 13. mentre ampiamente usato per l'analisi di trasmigrazione leucocitaria, questi modelli non prevedono in genere un layer che rappresenta l'intima, con conseguente transmigrated cellule migrano in soluzione e non consentono la misurazione della cella di schiuma formazione o inversa trasmigrazione delle stesse cellule. Al contrario, modelli di formazione delle cellule della gomma piuma non conto di eventuali cambiamenti indotti da trasmigrazione di monociti o degli effetti dell'attivazione endoteliale che è conosciuto per contribuire a schiuma cellulare formazione14. Inoltre, questi sistemi inducono schiuma formazione delle cellule dai macrofagi aderito a piastre per colture cellulari con l'aggiunta di saturare le concentrazioni di esogeno lipoproteina a bassa densità ossidata (oxLDL)15,16, un induttore chiave di formazione delle cellule della gomma piuma. LDL utilizzato in questi modelli è spesso ossidato da processi non fisiologicamente rilevanti come CuSO4 trattamento17, quindi, mettere in discussione l'importanza fisiologica degli studi facendo uso di questi modelli.
Qui descriviamo un'analisi che quantifica la trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma delle stesse cellule che non richiede l'aggiunta di oxLDL esogeno, così meglio modellare il ruolo dei monociti nella formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello è stato originariamente sviluppato dal Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18ed è stata ulteriormente perfezionato nel nostro laboratorio per valutare ex vivo il atherogenicity dei monociti isolati sotto non attivazione condizioni da individui con patologie infiammatorie che accompagna malattie come HIV infezione19 così come invecchiamento20, che sono associati con un rischio aumentato di aterosclerosi. Questo modello offre anche una piattaforma per rispondere alle domande biologiche di base per quanto riguarda la propensione dei sottoinsiemi diversi del monocito a forma schiuma cellule20, l'influenza dell'attivazione endoteliale da citochine come TNF su formazione delle cellule della gomma piuma14 e le proprietà migratori dei monociti come la profondità e velocità di trasmigrazione in gel19. Inoltre, la formazione delle cellule di trasmigrazione e schiuma di monociti può essere quantificata utilizzando la microscopia standard, cella immagini dal vivo, flusso cytometry e imaging citometria a flusso, di conseguenza, fornendo un metodo versatile per valutare il ruolo dei monociti nel atherogenesis.
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Protocol
Nota: tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con approvazione etica dal comitato di etica umana Alfred Hospital, Melbourne. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in armadi di sicurezza biologica di classe II se non diversamente specificato. " Prewarmed " si riferisce ai reagenti riscaldati a 37 ° C in bagnomaria.
1. preparazione di tipo I gel del collagene fibroso: giorno 1
- preparare polimerizzato il gel del collagene in sequenza aggiungendo e miscelazione 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, acido acetico 4,58 mM e 1,71 mg/mL di collagene fibroso tipo I in un polistirolo da 5 mL tubo come da tabella 1.
Nota: Assicurarsi che il collagene sia ben mescolato pipettando delicatamente su e giù per 5 volte al fine di evitare la formazione di collagene ' tasche ' nella miscela di gel. Preparare 4-6 gel per condizione di test per microscopia o 15 gel per condizione di test per citometria a flusso. - Bene una volta misto, aliquotare 50 µ l di miscela di gel di collagene in ciascun pozzetto di una piastra di coltura di tessuto 96 pozzetti a fondo piatto sterile. Non utilizzare le righe e le colonne esterne, ma riempire questi con 200 µ l di 1 x Dubecco ' tampone s fosfato (PBS) per proteggere i gel da dissecazione. Incubare le piastre a 37 °C/5% CO 2 per 2 h consentire il collagene polimerizzare.
Nota: Posizionare le piastre direttamente sul metallo pulito rack nell'incubatrice per garantire la distribuzione uniforme del calore. - a seguito di incubazione, sovrapporre i gel con 150 µ l di 1 x M199 completati (Vedi Tabella materiali) e incubare per 5 giorni fino a uso.
2. Espansione di Stored HUVEC: giorno 1
- etichetta cappotto un diametro di 10 cm di Petri con 1 mL di 50 µ g/mL fibronectina diluiti in 1X PBS e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Cellule endoteliali (HUVEC, 1.0 x 10 6 cellule) in 10 mL di M20 della vena
- disgelo aliquote del cordone ombelicale umano primario crioconservati.
Nota: HUVEC dovrebbe essere preparato come descritto in precedenza 21 e utilizzato in un numero di passaggio basso (< passaggio 4). HUVEC può essere sostituito con le cellule endoteliali umane dell'arteria coronaria qui. - Risospendere HUVEC in 10ml M20 e aggiungere al piatto rivestito fibronectina, aspirando fibronectin in eccesso prima dell'aggiunta delle cellule e la cultura di confluenza (circa 5 giorni), sostituendo i media il giorno 3.
3. Coltura di HUVEC monostrato sui gel di collagene: giorno 5
- il giorno 5, staccare HUVEC aspirare il surnatante da di Petri cultura e lavando via contenenti siero media con 10 mL di siero M199.
- Aggiungere 5 mL 0.05% tripsina/0.53 EDTA in M199 HUVEC e incubare per 1-2 min a temperatura ambiente, agitando delicatamente fino a quando le cellule staccano.
- Una volta staccata, rapidamente sciacquare Petri con 5ml M20 e trasferire i file multimediali contenenti cellule in una provetta 10 mL.
- Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 µ l di M20, contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Risospendere le cellule a 2,0 x 10 5 cellule/mL in M20, aspirare il M199 sui gel dalla piastra a 96 pozzetti (punto 1.3) e aggiungere 100 µ l di sedimento HUVEC (2.0 x 10 4 celle) per ogni gel di collagene preparato in precedenza (punto 1.2). Piastre della coltura per 3 giorni a 37 °C/5% CO 2.
Nota: L'integrità dello strato monomolecolare HUVEC può essere confermata dopo 3 giorni di nitrato d'argento che macchia 22 o immunohistochemistry per giunzione stretta proteine 23 in questa fase. Ulteriori gel deve essere preparato per questo scopo.
4. Attivazione di HUVEC monostrato e isolamento/attivazione dei monociti per trasmigrazione: giorno 8
- il giorno 8, attivare ciascun monostrato HUVEC prima dell'aggiunta dei monociti aspirando il M20 media sovrapponendo i gel e aggiungendo 100 µ l di 10 ng/mL TNFα umano in M20 per gel. Incubare a 37 °C/5% CO 2 per 4 h.
Nota: Condizioni Non attivato HUVEC possono anche essere incluse se necessario come controlli. - Durante il 4 h HUVEC attivazione passo, isolata monociti da PBMCs utilizzando magnetica del branello tecniche per selezionare negativamente per celle secondo il produttore ' s istruzioni. Un minimo di 6,5 x 10 6 PBMCs dovrebbe essere usato in questa fase, al fine di ripristinare in modo affidabile 3.0 x 10 5 monociti, necessari per una condizione, come monociti in genere rappresentano circa il 10-15% di PBMCs.
Nota: Per valutare l'effetto dell'attivazione del monocito prima della formazione delle cellule del monocito della trasmigrazione e schiuma, monociti possono essere attivati in questa fase. Monociti possono essere isolati da PBMCs scongelati se necessario (cioè, campioni memorizzati). Sottoinsiemi di monociti isolati mediante FACS ordinamento possono essere preparati per l'aggiunta di gel (Figura 1).
5. Trasmigrazione dei monociti umani primari: giorno 8
- per misurare la trasmigrazione del monocito, rimuovere i supporti contenenti TNFα e lavare gel due volte con 100 µ l M199 aggiungendo e rimuovendo i media. Dopo il lavaggio, aggiungere 2,0 x 10 5 appena isolato o scongelati e lavato crioconservati PBMCs o 5.0 x 10 4 appena isolato monociti o purificata sottoinsiemi del monocito di monostrati HUVEC in 100 µ l M20. Incubare per 1 h a 37 ° C e 5% di CO 2 per consentire la trasmigrazione in avanti dei monociti nel gel. Si consiglia di lasciare 6 pozzetti per ogni condizione sperimentale esaminati.
Nota: Per valutare l'effetto del siero autologo sulla formazione delle cellule della trasmigrazione e schiuma, incubare le cellule con M20 contenente la concentrazione di siero inattivato con calore donatore e confrontare le condizioni con un controllo di pool di siero umano. Leucociti diverso da monociti possono essere aggiunti in questa fase. Se studiando l'impatto di specifici lipidi lipidi specie (ad es., HDL, oxHDL), è possibile eseguire tutti i passaggi seguenti con supporto privo di siero contenente lipidi di 20-50 µ g/mL. - Dopo 1 h di trasmigrazione in avanti, raccogliere le cellule non-trasmigrato lavando gel due volte con 100 µ l di preriscaldati 1 mM EGTA in PBS 1X e una volta con 100 µ l M199 (stesso centrifugare condizioni), pool i surnatanti da ogni pozzetto dello stesso condizione sperimentale (solitamente 6 pozzi) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio. Centrifugare le cellule non-trasmigrate a 4 ° C, 300 x g per 5 min e risospendere in 30 µ l di PBS 1x 1.
- Contare le cellule raccolte nel surnatante per determinare il numero di cellule transmigrated avanti.
- La percentuale di cellule transmigrated avanti è determinato come segue:
- coprire il lavato gel contenenti cellule transmigrated con 100 µ l M20 e incubare per un ulteriore 48 h.
- Dopo 48 h, raccogliere il surnatante e lavare le cellule non-trasmigrato due volte con 100 µ l preriscaldata 1 mM EGTA/PBS, raccolta e messa in comune il surnatante da ogni condizione come descritto al punto 5.2.
Nota: Il fenotipo delle cellule di transmigrated inversione può essere testato su queste cellule fcitometria a flusso standard di OPO che macchia i protocolli. - Centrifugare le cellule a 4 ° C, 300 x g per 5 min e risospendere le cellule in 30 µ l 1X PBS. Contare le celle e determinare la fattibilità tramite colorazione blu di trypan.
- Determinare la percentuale di cellule transmigrated inversione utilizzando la seguente equazione:
Nota: contabilità per il numero totale di cellule transmigrated avanti dà un'indicazione più precisa della trasmigrazione inversa come è improbabile trasmigrazione in avanti sarà 100%. - Per analisi di microscopia, i gel di fix aggiungendo 100 µ l 2% formaldeide (concentrazione finale) in ciascun pozzetto, coprire le piastre in alluminio della stagnola e conservare a 4 ° C fino all'analisi. Per citometria a flusso, non fissare le cellule in questa fase. Vedi i protocolli sotto per microscopia (sezione 6) o l'analisi di flusso cytometry (sezione 7).
Attenzione: La formaldeide è tossica e corrosiva; utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE). Cura dovrebbe essere presa quando l'aggiunta di formaldeide, tuttavia, questo passaggio non deve necessariamente essere eseguita in una cappa a causa della bassa concentrazione usata.
6. Quantificazione delle cellule della gomma piuma e macrofagi di microscopia (macchia di olio-rosso O)
- rimuovere la formaldeide e lavare i gel con 100 µ l di metanolo al 50% (v/v) per 5 min e poi 100 µ l 78% (v/v) metanolo per 15 min.
Nota: La procedura di colorazione può essere eseguita sul banco di laboratorio e non in un armadietto di Biohazard di classe II. - Macchia per le goccioline del lipido aggiungendo 100 µ l di preparati 0,2% (w/v) O olio-rosso (per dettagli, vedere Tabella materiali) per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovi macchie in eccesso lavando i gel 4 volte con 100 µ l del 78% (v/v) metanolo, aspirare e scartare il supernatante dopo ogni wash.
- Colorante di contrasto per 15 min a temperatura ambiente con 100 µ l di Giemsa, diluito 01:10 in acqua distillata.
- Aspirare la colorazione di Giemsa e lavare gel una volta con acqua.
- Per rimuovere il gel dalla piastra, cerchio pozzi usando un ago 21G, con lo smusso rivolto verso l'esterno, intorno al bordo del gel.
- Per montare il gel su un vetrino da microscopio, perforare due fori (diametro 6,35 mm) in una striscia di 2,54 cm x 1,5 cm di nastro biadesivo. Difficoltà il nastro a un lato di microscopio standard e rimuovere il rivestimento protettivo dall'alto.
- Aggiungi una goccia d'acqua nei buchi il nastro utilizzando una pipetta di trasferimento. Delicatamente con una pinzetta, trasferire gel nei buchi il nastro e coprire con un vetrino coprioggetto di dimensioni vetro 1,5. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti per aderire al nastro.
- Esaminare con microscopia di campo chiaro contrasto differenziale di interferenza con obiettivo 40x su un microscopio invertito.
- Portare il monostrato HUVEC a fuoco alle 40 X ingrandimento e scorrimento ' in ' il gel, contando le cellule macrofagi/schiuma per tutta la profondità del gel. Ripetere per tre distinti campi di vista situato a simili distanze dal bordo del gel al fine di ridurre al minimo i possibili effetti di bordo. In tal modo gel profondità è coerente tra regioni di conteggio.
Nota: Punteggio ottenuto cellule nel gel sia come cellule della gomma piuma (definito come cellule contenenti > 1/3 del loro citoplasma come olio-rosso O macchiato le goccioline del lipido) o i macrofagi all'interno di 2 h di montaggio su diapositive ( Figura 2). Formazione di schiuma delle cellule è espresso come la percentuale di cellule della schiuma rispetto al numero totale di cellule migrate e viene espresso come conteggi mediani in 3 campi di vista esaminato per 6 gel per condizione, pertanto una mediana di 18 misurazioni per ogni condizione. Nella tabella 2 è riportato un esempio dell'emocromo crudo da un tipico esperimento.
Nota: Classificare una cella come un macrofago di vs cella di schiuma da microscopia è soggettivo e di conseguenza può essere investigatore-dipendente. Negli studi clinici, dove gli esperimenti vengono eseguiti per un periodo prolungato di tempo, è importante per il conteggio di tutti deve essere eseguita accecato da un singolo ricercatore. Vengono forniti esempi di cellule della gomma piuma e macrofagi in gel nella Figura 2.
- Portare il monostrato HUVEC a fuoco alle 40 X ingrandimento e scorrimento ' in ' il gel, contando le cellule macrofagi/schiuma per tutta la profondità del gel. Ripetere per tre distinti campi di vista situato a simili distanze dal bordo del gel al fine di ridurre al minimo i possibili effetti di bordo. In tal modo gel profondità è coerente tra regioni di conteggio.
7. Analisi delle cellule di Transmigrated dal flusso Cytometry
- a fenotipico caratterizzano le cellule della gomma piuma e macrofagi dopo migrazione transendoteliale, digerire i gel aggiungendo 100 µ l di collagenasi di 37 ° C preriscaldato 1 mg/mL diluito in M199 a D ciascun pozzetto ed incubare per 20 min a 37 °C/5% CO 2.
Nota: Posizionare le piastre da 96 pozzetti direttamente su scaffali di metallo pulito nell'incubatrice per garantire la distribuzione uniforme del calore. - a seguito di incubazione, macerare il gel utilizzando una punta di pipetta 200 µ l e incubare per un ulteriore 20 min a 37 °C/5% CO 2.
- Una volta completamente digerito, i gel di replicare digeriti attraverso 35 µm in nylon mesh provette FACS con tappi posti su ghiaccio, filtro e piscina e lavata una volta con FACS lavare (Vedi tabella materiali) a 4 ° C, 300 x g. Risospendere le cellule in 100 µ l di FACS nello stato di Washington
- Incubare le cellule risultanti con anticorpi coniugati fluorophore specifici per CD45, un indicatore delle cellule vive/morte e superficie/intracellulare marcatori fenotipici o funzionali di interesse utilizzando protocolli di cytometry di flusso standard.
Nota: Preparare controllo tubi per compensazione utilizzando l'appropriato fluorofori e Ig compensazione perline. Estratti di cellule possono anche essere raccolte su vetrini per microscopia di immunofluorescenza di cytospinning. In alternativa, abbiamo raccolto con successo cellule usando questo protocollo per la valutazione tramite imaging citometria a flusso. - Acquisire celle utilizzando un citometro a flusso ed eseguire la compensazione come richiesto.
Nota: Come le cellule della gomma piuma/macrofagi non possono formare singole popolazioni utilizzando le proprietà di dispersione della luce e possono differire notevolmente in dimensioni e forma, impostare liberale forward scatter (FSC) e cancelli laterali scatter (SSC) al fine di catturare tutte le cellule migrate come illustrato < forte classe = "xfig" > figura 3A. - a seguito di acquisizione, eseguire l'analisi di dati utilizzando il software di citometria a flusso. Per identificare cellule migrate, prima selezionare le celle come negativo per il marcatore di live/dead come mostrato nella Figura 3B. Successivamente, eseguire una cella singola discriminazione creando un cancello stretto intorno alle cellule mostrato su un terreno di vs SSC-altezza SSC-area.
- Selezionare CD45 + cellule e cancello la popolazione maggiore di cellule migrate presente in un plot FSC/SSC come queste sono le cellule macrofagi/schiuma.
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Representative Results
Quantificare la trasmigrazione del monocito
Monociti vengono aggiunti al modello come descritto in Figura 1, e sei gel sono preparati per ogni condizione. Monociti per 6 gel per donatore (cioè, 5,0 x 104 monociti al gel gel 6 = 3.0 x 105 monociti per donatore) sono risospese ad un volume finale di 600 µ l di M199 supporti contenenti il lipido richiesto siero/isolato. Cellule (cioè, 100 µ l per gel = 5,0 x 104 monociti) sono poi aliquotati sul gel e incubate come sopra per 1 h facilitare la trasmigrazione del monocito. A seguito di trasmigrazione, cellule trasmigrato non sono contati come sopra. In questo esempio, sono stati recuperati 1,5 x 104 non trasmigrato celle. La percentuale di trasmigrazione in avanti è stata determinata utilizzando le formule descritte nel passaggio 5.4:
Dopo 48 h di incubazione, 3.6 x 104 celle transmigrated inversa sono stati recuperati come sopra. La percentuale di trasmigrazione inversa è stata determinata utilizzando la formula nel passaggio 5.8:
Trasmigrazione di andata e d'inversione può essere confrontati tra condizioni utilizzando il test statistici appropriati e monociti preparati da donatori multipli indipendenti per determinare se ha la capacità di trasmigrazione del monocito è alterata tra sperimentale condizioni.
Valutazione di formazione delle cellule della gomma piuma
Microscopia in campo chiaro
Lipoproteine ossidate sono conosciute per promuovere monocito-derivate schiuma cellulare formazione in vitro rispetto ai lipidi non ossidati15. Qui confermiamo che il trattamento dei monociti con oxLDL, comunemente usato per indurre la formazione di schiuma cellulare nei modelli di induzione convenzionale schiuma cellulare, migliora la formazione delle cellule monocito-derivati della gomma piuma in questo modello di formazione delle cellule della schiuma e migrazione transendoteliale rispetto alle LDL indigeno. Seguendo la formazione delle cellule di monocito trasmigrazione e schiuma in gel incubati con M199 contenente 50 µ g/mL nativo o CuSO4-LDL ossidato (Vedi punto 5.1, Figura 1), le cellule sono state analizzate da microscopia. Nella Figura 2vengono illustrati esempi di cellule della gomma piuma e macrofagi osservati negli esperimenti rappresentativi. Le cellule sono stati contati in tre diversi campi al gel, di messa a fuoco al monostrato HUVEC e progressivamente messa a fuoco più profondo nel gel. I conteggi delle cellule sono registrati per ciascun donatore come mostrato nella tabella 2 per un singolo donatore, per confrontare la percentuale di cellule della schiuma formata in risposta alla ossidato e LDL indigeno. Aggregare dati da n = 12 conteggi indipendenti sono illustrati nella Figura 4 per confermare che incubazione dei monociti con oxLDL in questo modello induce più formazione delle cellule della schiuma rispetto condizioni dove i monociti sono incubati con supporto nativo di LDL o M199 da solo.
Citometria a flusso
Per determinare il fenotipo delle cellule migrate, le cellule vengono estratti dal gel digerito ed etichettate utilizzando un pannello di citometria a flusso standard. Le cellule sono state etichettate con un indicatore delle cellule vive/morte e gli anticorpi specifiche per CD45 e altri indicatori di fenotipo di superficie utilizzando protocolli di cytometry di flusso standard. Controlli di compensazione devono essere preparati anche per pieno risarcimento secondo tecniche di citometria di flusso standard. Cellule migrate sono gated come mostrato nella Figura 3 in appezzamenti rappresentativi di 10 esperimenti indipendenti. Cellule vive sono gated utilizzando saggi di vitalità delle cellule vive/morte (Figura 3B) e doppietti sono esclusi dall'analisi di singola cellula (Figura 3). Le cellule sono poi gated come CD45+ al fine di escludere HUVEC (come sono queste cellule CD45-, Figura 3D). La popolazione principale quindi è recintata da discriminazione di forward scatter/side scatter (Figura 3E) e l'intensità media di fluorescenza (MFI) dei recettori di interesse sono determinati rispetto ad entrambi fluorescenza meno uno (FMO) o isotipo di controllo ( Figura 3F) per determinare l'espressione (ΔMFI) o la percentuale di cellule positive.
Figura 1 : Un in vitro modello di formazione delle cellule del monocito della trasmigrazione e schiuma. (A) PBMC, (B) totali monociti o sottoinsiemi del monocito FACS-ordinati (C) vengono aggiunti a fibroso collagene di tipo I gel formata in piastre da 96 pozzetti e sovrapposti con un monostrato di cordone ombelicale umano primario attivato cellule endoteliali (HUVEC), cui integrità può essere valutata da (Ddi macchiatura d'argento della vena) e permesso di (E) trasmigrano per 1 h in presenza del siero o del lipido che contiene media. Non-trasmigrato celle vengono conteggiate (F) e gel sono incubate per un ulteriore 48 h con lo stesso lipidi del siero contenente supporto. Dopo incubazione, (G) cellule migrate inversione sono contate e la percentuale di cellule schiumose vs macrofagi nel gel è determinata dalla microscopia di contrasto di fase (H) dopo colorazione con olio rosso O o il fenotipo di cellule migrate è determinata dalla (io) citometria a flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esempi di cellule della gomma piuma e macrofagi in un in vitro modello di formazione delle cellule del monocito della trasmigrazione e schiuma. AdultIve esempi delle cellule ha segnate come cellule della gomma piuma (frecce bianche) e macrofagi (frecce nere) dopo Giemsa colorazione per visualizzare le celle e colorazione rosso-olio O visualizzare le goccioline del lipido come determinato da microscopia di contrasto di fase di gel estratti utilizzando un invertito microscopio ad ingrandimento 40x. Barra della scala = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Gating strategia di transmigrated cellule tramite flusso cytometry. Transmigrated cellule fenotipicamente sono caratterizzate tramite flusso cytometry dopo l'estrazione di cellule dal gel. Le cellule sono gated di (A) FSC/SSC, cellule vive (B), (C) cellule singole, CD45 (D)+, (E) FSC/SSC e (F) espressione del recettore rispetto all'isotipo o fluorescenza meno un controllo (FMO). Espressione dei recettori di interesse sono definite come intensità media di fluorescenza (MFI) ed espresse rispetto ai livelli dell'isotipo. ΔMFI = macchia (MFI) meno il controllo di isotipo/FMO (MFI). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Effetto di oxLDL esogenicamente aggiunto e LDL sulla formazione delle cellule monocito-derivate schiuma. Formazione delle cellule della gomma piuma è determinata in condizioni dove i monociti da un singolo donatore sono incubati con i media (M199) o 50 µ g/mL non ossidato lipoproteina a bassa densità (LDL) o solfato di rame (II) ossidato LDL (oxLDL) aggiunto alla post-trasmigrazione gel. Conteggi per 12 siti distinti sono mostrati. Cellule della gomma piuma sono espressi come percentuale del totale cellule migrate. Gamme di mediana ed interquartile sono mostrate nei grafici a barre e confronti sono stati fatti utilizzando test di Mann-Whitney U non-parametrici. p < 0.001, * * * p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | [Stock] | [Finale] | Volume per 60 gel (µ l) |
| NaOH | 100 mM | 35,7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4,58 mM | 687 |
| Collagene | 5 mg/mL | 1,71 mg/mL | 1029 |
| Volume totale | - | - | 3000 |
Tabella 1: Preparazione del gel di collagene fibroso di tipo I
| LDL | oxLDL | |||||||
| Gel | Count | Cellule della gomma piuma1 | Cellule migrate1 | Schiuma di celle (%)2 | Cellule della gomma piuma1 | Cellule migrate1 | Schiuma di celle (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47,3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18,5 | 10 | 23 | 43,5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21,2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14,7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58,2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13,5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53,8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 11 | 31 | 35,5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18,4 | 28 | 53 | 52,8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42,4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36,7 | ||
| Cellule schiumose mediano (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Cellule della schiuma medio (%) | 19,8 | 45,5 | ||||||
Tabella 2: i conteggi delle cellule Raw dal confronto delle cellule monocito-derivate schiuma dopo trattamenti di oxLDL di LDL vs. 1 I conteggi delle cellule per campo visivo in gel. 2 Percentuale di cellule schiumose = schiuma cella conteggi/totale migrati conta x 100. * I dati sono rappresentativi di un esperimento utilizzando monociti da un singolo donatore
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Discussion
Il protocollo descritto qui offre un metodo versatile e fisiologicamente rilevante per valutare il atherogenicity dei monociti da coorti cliniche umane, combinando sia trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello offre vantaggi rispetto ai metodi alternativi di formazione delle cellule della gomma piuma in quanto prende in considerazione l'effetto della trasmigrazione del monocito su formazione delle cellule della gomma piuma e consente la misurazione di trasmigrazione inversa6 oltre l'intrinseca propensione dei monociti di maturare in cellule della gomma piuma in presenza o in assenza di fattori esogeni. Inoltre, il ruolo dell'attivazione endoteliale anche viene presa in considerazione come abbiamo dimostrato che l'ossidazione aumenta l'attivazione endoteliale di specie del lipido che è associato con schiuma cellulare formazione14. Infine, il fenotipo dei monociti che subiscono in uscita (una proprietà associata con regressione della placca) può essere quantificato e caratterizzato da microscopia e flusso cytometry.
A causa della natura tridimensionale di trasmigrazione in gel, segnando le cellule transmigrated cellule schiumose o macrofagi e identificazione può essere difficile come cellule trasmigrano a diversi livelli a gel19. Per facilitare l'identificazione delle cellule della gomma piuma, macchia di olio-rosso O fresca deve essere sempre utilizzato. È anche da notare che stati di malattia diversi ex vivo o in vitro condizioni possono alterare la trasmigrazione di monociti nel gel. Abbiamo usato live cell imaging per identificare che i monociti da individui HIV-infettati tendono a trasmigrano ai punti meno profonde in gel e a velocità diverse rispetto a quelle da individui non infetti19. Inoltre, la formazione delle cellule della gomma piuma è associata con meno motilità del monocito nel gel quindi cellule tendono a muoversi in cerchio a una particolare sezione di z rispetto alle cellule da individui non infetti da HIV che tendono a migrare in una linea relativamente dritta verso il fondo del gel. Questi risultati sollevano la possibilità di un simile fenomeno che accade in esperimenti usando i campioni di pazienti umani da altri Stati di malattia connessi con atherogenicity aumentata del monocito.
Quando si esegue le analisi basate su citometria a flusso è comune osservare una percentuale significativa di cellule morte nella popolazione cellulare recuperati nella valutazione di fattibilità utilizzando gli indicatori delle cellule vive/morte (Figura 4B). Queste cellule sono principalmente CD45– HUVEC che sono danneggiati durante la fase di digestione/macerazione di collagene necessario per estrarre cellule monocito-derivate dalla matrice di collagene. Questo processo è particolarmente duro per il monostrato HUVEC, ma non è dannoso per phenotyping le cellule transmigrated.
Questo modello si differenzia dagli altri in quanto non artificialmente ossidata esogena del lipido è necessaria nel terreno di coltura per la formazione delle cellule monocito-derivati della gomma piuma di unità. Invece, formazione delle cellule della gomma piuma in questo test è influenzato dal siero presente nel terreno di coltura, consentendo i discreti effetti di fattori solubili da campioni clinici da valutare. Come tale, abbiamo dimostrato che l'incubazione dei monociti di controllo con il siero da giovane HIV-infettati19 o anziani individui non infetti da HIV20 promuove formazione delle cellule della gomma piuma, che indica che fattori solubili in modo indipendente possono promuovere la schiuma formazione delle cellule. Come il dosaggio è influenzato dai componenti solubili, un singolo batch di siero umano in pool devono essere utilizzati per esperimenti volti a determinare la differenza intrinseca di proprietà atherogenic dei monociti derivati dagli individui differenti al fine di standardizzare condizioni di controllo. Questo dosaggio può essere usato anche per valutare il ruolo delle specie specifici lipidi da campioni clinici (Figura 3). Ad esempio, abbiamo trovato che incubazione dei monociti con supporti contenenti lipidi isolato specie come lipoproteine ad alta densità da individui con noti del lipido disfunzione24 promuove anche la formazione delle cellule della gomma piuma. In questo caso, monociti da un singolo individuo sano o gruppo di individui utilizzabile in presenza di siero o di fattori del siero derivati da soggetti di prova. Pertanto, questo modello consente specifiche domande da porsi per quanto riguarda gli effetti discreti di componenti cellulari e solubile sulla formazione delle cellule della gomma piuma.
Questo test utilizza HUVEC come modello di endotelio coronarico a causa delle difficoltà pratiche nell'ottenere tantissime cellule di passaggio basso numero primario dell'arteria coronaria. Tuttavia, abbiamo confrontato i risultati dalle analisi usando sia le cellule endoteliali umane dell'arteria coronaria o HUVEC e osservato poca differenza la formazione di cellule monocito trasmigrazione o schiuma (dati non mostrati), che indica che l'uso di HUVECs in questo sistema è un sostituto accettabile. Conteggio manuale delle cellule della gomma piuma è un fattore limitante in questo modello, come può introdurre la polarizzazione di operatore. Pertanto, tutti i campioni hanno montato sulle diapositive devono essere accecati all'operatore al fine di rimuovere il potenziale di polarizzazione. Abbiamo, tuttavia, rispetto la formazione delle cellule della gomma piuma come misurato dal conteggio manuale e da formazione immagine citometria a flusso e trovato che questi metodi dare simili risultati19. Una limitazione chiave di questo modello è che la trasmigrazione e l'adesione del monocito verificarsi in assenza di forze di taglio connesso con flusso fisiologico del sangue in vivo. Supponiamo che flusso di shear interesserà principalmente trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma non successivi all'interno della matrice; Tuttavia, questo deve essere considerato quando si interpretano i risultati di questo test. Questo test non modella anche l'influenza delle cellule muscolari lisce nella formazione delle cellule monocito-derivati della gomma piuma che è un limite fisiologico del sistema; Tuttavia, ciò è coerente in tutte le condizioni che consentano il discreto potenziale atherogenic dei monociti da confrontare tra gli stati differenti di malattia.
In sintesi, questo modello fornisce un metodo versatile e fisiologicamente rilevante per quantificare la trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da campioni umani in stati differenti di malattia ex vivo. Questo modello ha ulteriori applicazioni per valutare la propensione dei monociti a formare cellule della gomma piuma in condizioni dove atherogenicity del monocito è associato con il rischio aumentato di CAD quali obesità25, diabete26 e renali croniche malattia27. Pertanto, questo modello può anche essere ottimizzato per l'utilizzo negli Stati di malattia, diverso da aterosclerosi, dove trasmigrazione cellulare può influenzare la patogenesi della malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine l'opera del professor William Muller e Dr. Clare Westhorpe per il loro ruolo chiave nello sviluppo di precedenti iterazioni di questo modello. Gli autori inoltre vorrei ringraziare il nucleo AMREP citometria a flusso per lo smistamento dei monociti sottoinsiemi e l'Alfred Hospital infettiva malattia unità cliniche infermieri per l'assunzione di persone HIV + per alcuni studi di ricerca. Gli autori riconoscono con gratitudine il contributo a questo lavoro del Victoria programma operativo di infrastruttura di supporto ricevuto dall'Istituto Burnet. TAA è supportato da un RMIT University Vice-Cancelliere di Postdoctoral Fellowship. Quest'opera è stata sostenuta da NHMRC progetto sovvenzione 1108792 assegnato a AJ e AH. TK è supportato da NIH concede NIH K08AI08272, Grant NIH/NCATS # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
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