Summary
Vi beskriver en protokoll for å måle transmigration av monocytter over menneskelige endotelial monolayers og deres påfølgende modning i skum celler. Dette gir en allsidig metode å vurdere atherogenic egenskapene av monocytter isolert fra folk med ulike sykdom forhold og vurdere faktorer i blodet som kan forbedre denne tilbøyelighet.
Abstract
Koronarsykdom (CAD) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Aterosklerose, en ledende årsak til DAK, startes av transmigration av medfødte immunforsvaret monocytter inflammatorisk områder av avsatt lipid kalt fet striper, som finnes i arterial vegger av middels til store arterier. De viktigste patogene funksjonen av lesjoner på dette tidlige stadium av aterosklerose er modning av monocytter som migrerer til arteriene å danne skum celler eller lipid-laden makrofager. Betydelige bevis støtter hypotesen at risikoen for åreforkalkning økes med kronisk opphissende vilkårene følger sykdommer som revmatoid artritt og HIV, i tillegg til de generelle aldring, og at denne risikoen er spådd av monocyte aktivisering. Musen modeller gir en god plattform for å undersøke rollen av monocytter i atherogenesis i vivo, de krever genetisk endring av naturlige kolesterol metabolismen og drastisk endring av normal mus dietter, og har begrenset egnethet for studiet av atherogenic påvirkninger av menneskelig komorbide sykdommer. Dette motivert oss å utvikle en menneskelig i vitro modell for å måle atherogenic potensialet av monocytter isolert fra personer med definerte sykdomstilstander. Foreløpig er menneskelige i vitro modeller begrensende i at de vurderer monocytt transmigration og skum celle formasjon i isolasjon. Her beskriver vi en protokoll som monocytter isolert fra pasientens blod transmigrate over menneskelige endotelceller i en type 1 kollagen matrise, og deres tilbøyelighet til å modne i skum celler i tilstedeværelse eller fravær av eksogene lipid måles. Protokollen er validert for bruk av menneskelige monocytter renset fra personer med HIV-infeksjon og eldre HIV infisert enkeltpersoner. Denne modellen er allsidig og lar monocytt transmigration og skum celle formasjon evalueres ved hjelp av enten mikroskopi eller flowcytometri så vel som tillater vurdering av atherogenic faktorer til stede i serum- eller.
Introduction
Monocytt transmigration er et viktig skritt i utviklingen av aterosklerotisk plakk som kan føre til hjerteinfarkt, blodpropp og slag. Aterosklerotisk plaketter utvikle fra fet striper, generelt finnes på nettsteder av lav oscillasjon blodstrøm i middels til store arteriene, der avsatt lipid bidrar til endotelial aktivisering og lokalisert betennelse1. Monocytter er rekruttert til endotelceller i fet striper via monocyte chemotactic proteiner (for eksempel CCL2) og transmigrate i intima2. Etter transmigration, kan monocytter danne atherogenic, lipid-laden makrofager kalt skum celler av lipid opptak, lipid syntese, ned-regulering av kolesterol middelklasseinnbyggere eller en kombinasjon av de ovennevnte faktorene. Monocytter kan også samle lipider i sirkulasjon og har en "skummet" fenotype, muligens disponerer celler for skum celle formasjon3,4. Skum cellene er de definerende trekk ved fet striper og tidlig stadium aterosklerotisk plaketter og deres dannelse påvirkes av både lipid og inflammatoriske mediatorer5. Alternativt, monocytter har evnen til å reversere transmigrate fra arterien i blodet6, og dermed fjerne lipid fra intima og fungerende å opprettholde helsen til arterien.
Bestemme tilbøyelighet av monocytter å transmigrate over arteriell endotelet og skjemaet skum celler i intima eller reversere transmigrate og bære lipid av plakk, er viktig for forståelsen av monocyte aktivisering i økende aterosklerotisk risiko. Musen modeller av CADs som atherosclerosis er viktig i Klargjørende sanntid i vivo informasjon med fet strek/aterosklerotisk plakk utvikling. Disse modellene krever imidlertid en genetisk endring av naturlige kolesterol behandling evner av disse dyrene vanligvis kombinert med drastiske endringer i kosthold (for eksempel ApoE-/-Western-type diett modell)7,8, dermed inducing ikke-fysiologiske akkumulering av sirkulerende lipid nivåer der stasjon plakk utviklingen. Disse modellene kan ha begrenset relevans til kronisk inflammatorisk menneskelige forhold som HIV-infeksjon som ikke er forbundet med økt sirkulerende kolesterol eller lav tetthet lipoprotein (LDL) nivåer. Videre forskjeller i monocytt biologi mellom mennesker og mus gjør testing av immunologiske spørsmål om relevansen av subpopulasjoner av monocytter (som mellomliggende monocytter (CD14++CD16+))9 vanskelig. Dette er viktig når studere mekanismer kjøring kardiovaskulær sykdom som mellomliggende monocytt teller uavhengig forutsi hjerte hendelser10,11. Mens analyser eksisterer for å måle sekvensielt enten monocytt transmigration eller skum celle formasjon i isolasjon, er ingen i vitro analysen validert for kvantifisering både aspekter av tidlig atherogenesis bruker de samme cellene fra klinisk kohorter. Transwell modeller bruker en modifisert Boyden to-kammer system der celler er lastet inn i toppen kammeret og transmigrate over en porøs plast-barrieren eller celle monolayer i en lavere kammer som vanligvis inneholder medier med chemoattractant12 , 13. mens mye brukt for å analysere leukocytter transmigration, disse modellene ikke generelt inkorporere et lag som representerer intima, noe som resulterer i transmigrated cellene migrerer til løsning, og tillater ikke for måling av skum celle formasjon eller omvendt transmigration til de samme cellene. Derimot gjøre modeller av skum celle formasjon ikke rede for eventuelle transmigratory-indusert endringer monocytter eller effekter av endothelial aktivering som er kjent for å bidra til å skumme celle formasjon14. Videre disse systemene indusere skum celle formasjon fra makrofager overholdt celle kultur plater med tillegg av Mette konsentrasjoner av eksogene oksidert low-density lipoprotein (oxLDL)15,16, en nøkkel induser skum celle-formasjonen. LDL brukes i disse modellene er ofte oksidert av ikke-fysiologisk-relevante prosesser som CuSO4 behandling17, derfor avhør fysiologiske betydningen av studier med disse modellene.
Her beskriver vi en analyse som quantifies monocytt transmigration og skum celle dannelsen av de samme cellene som ikke krever tillegg av ytre oxLDL, dermed bedre modellering rollen av monocytter i skum celle formasjon. Denne modellen ble opprinnelig utviklet av Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18, og har blitt ytterligere forbedret i vårt laboratorium å vurdere ex vivo atherogenicity av monocytter isolert under ikke-aktivering forhold fra personer med underliggende inflammatoriske tilstander følger sykdommer som HIV infeksjon19 samt aldring20, som er forbundet med økt risiko for åreforkalkning. Denne modellen gir også en plattform for å svare på grunnleggende biologisk spørsmål om tilbøyelighet av ulike monocytt delsett til skjemaet skum celler20, påvirkning av endothelial aktivering av cytokiner som TNF på skum celle formasjon14 , og vandrende egenskapene av monocytter som dyp og hastigheten på transmigration i gels19. Videre monocytt transmigration og skum celle formasjon kan kvantifiseres bruker standard mikroskopi, live celle bildebehandling, flow cytometri og bildebehandling flowcytometri, derfor gir en allsidig metode for å vurdere rollen av monocytter i atherogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: alle eksperimenter ved hjelp av menneskelig biologiske prøver ble utført med etikk godkjennelse fra Alfred sykehus menneskelige etikk komiteen, Melbourne. Alle eksperimentene ble utført i klasse II Biosafety skap med mindre spesifisert. " Prewarmed " refererer til reagenser varmet til 37 ° C i en waterbath.
1. forberedelse av Type jeg fibrøs kollagen Gels: dag 1
polymerized- forberede kollagen gels av fortløpende legge og miksing 35.7 mM NaOH, 0.71 x M199, 4.58 mM eddiksyre og 1.71 mg/mL skriver jeg fibrøs kollagen i en 5 mL polystyren rør som tabell 1.
Merk: Kontroller at kollagen er godt blandet ved forsiktig pipettering opp og ned 5 ganger for å stoppe dannelsen av kollagen ' lommer ' i gel blandingen. Forberede 4-6 gels per testvilkår for mikroskopi eller 15 gels per testvilkår for flowcytometri. - Vel når blandet, aliquot 50 µL av kollagen gel blandingen i hver brønn av et sterilt flat bunn 96-brønns vev kultur plate. Ikke bruk utenfor rader og kolonner, men fylle disse med 200 µL av 1 x Dubecco ' s fosfat bufret saltvann (PBS) å beskytte geléer fra uttørking. Inkuber plater på 37 °C/5% CO 2 for 2t tillate kollagen å danner.
Merk: Plassere plater direkte på rent metall rack i inkubator å sikre jevn. - Etter inkubasjon overlegg gels med 150 µL av 1 x supplert M199 (se Tabell for materiale) og Inkuber i 5 dager før bruk.
2. Utvidelse av lagret HUVEC: dag 1
- etikett og pels 10 cm diameter Petriskål med 1 mL av 50 µg/mL fibronectin fortynnet i 1 x PBS ruge ved romtemperatur for 10 min.
- Tøvær dele cryopreserved primære menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC, 1.0 x 10 6 celler) i 10 mL M20.
Merk: HUVEC bør være forberedt tidligere beskrevet 21 og brukt på noen lavt passasje (< passasje 4). HUVEC kan erstattes med menneskelige koronar endotelceller her. - Resuspend HUVEC i 10 mL M20 og legge til fibronectin belagt parabol, aspirating overflødig fibronectin før tillegg av celler og kultur der (ca 5 dager), erstatter media på dag 3.
3. Dyrking HUVEC Monolayer på kollagen Gels: dag 5
- på dag 5, koble HUVEC aspirating kultur supernatant fra Petriskål og vask bort serum inneholder medier med 10 mL av serum-free M199.
- Legge til 5 mL 0,05% trypsin/0.53 EDTA i M199 HUVEC og Inkuber i 1-2 min i romtemperatur, risting forsiktig inntil cellene løsner.
- Når løsrevet, raskt skyll Petriskål med 5 mL M20 og overføre mediet som inneholder celler slik 10 mL.
- Sentrifuge eksempler på 300 x g i 5 min i romtemperatur, Sug opp nedbryting, resuspend celler i 200 µL av M20 og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Resuspend cellene til 2,0 x 10 5 celler/mL i M20, Sug opp M199 på geléer fra 96-brønns platen (trinn 1.3) og legge til 100 µL av resuspended HUVEC (2,0 x 10 4 celler) til hver kollagen gel forberedt ovenfor (trinn 1.2). Kultur plater for en ytterligere 3 dager på 37 °C/5% CO 2.
Merk: Integriteten til HUVEC monolayer kan bekreftes etter 3 dager av sølv nitrat flekker 22 eller immunohistochemistry for tett krysset proteiner 23 på dette stadiet. Ekstra gels må være forberedt for dette formålet.
4. Aktivering av HUVEC Monolayer og isolasjon/aktivisering av monocytter for Transmigration: dag 8
- på dag 8, aktivere hver HUVEC monolayer før tilsetning av monocytter ved aspirating i M20 media overliggende geléer og legge 100 µL av 10 ng/mL menneskelige TNFα i M20 per gel. Ruge på 37 °C/5% CO 2 for 4 h.
Merk: Ingen-aktivert HUVEC forhold kan også bli inkludert om nødvendig som kontroller. - Under 4 h HUVEC aktiveringen, isolere monocytter fra PBMCs ved hjelp av magnetiske perle teknikker negativt velge for celler som produsenten ' s instruksjoner. Minimum 6.5 x 10 6 PBMCs skal brukes på dette trinnet for å gjenopprette pålitelig 3.0 x 10 5 monocytter kreves for en betingelse, som monocytter vanligvis utgjør ca 10-15% av PBMCs.
Merk: For å evaluere effekten av monocyte aktivisering før monocytt transmigration og skum celle formasjon, monocytter kan aktiveres på dette stadiet. Monocytter kan isoleres fra tinte PBMCs hvis nødvendig (dvs. lagret pasientprøvene). Monocytt delsett isolert av FACS sortering kan være forberedt på tillegg til gels (figur 1).
5. Transmigration av primære menneskelige monocytter: dag 8
- å måle monocytt transmigration, Fjern TNFα inneholder medier og vaske gels to ganger med 100 µL M199 ved å legge til og fjerne media. Etter vasking, legge 2.0 x 10 5 nylig isolert eller Tint og vasket cryopreserved PBMCs eller 5.0 x 10 4 fersk isolert monocytter eller renset monocytt delsett til HUVEC monolayers i 100 µL M20. Inkuber 1t på 37 ° C og 5% CO 2 å la frem transmigration av monocytter i gel. Det er best å la 6 brønner for hver eksperimentelle tilstand undersøkt.
Merk: For å evaluere effekten av autologous serum på transmigration og skum celle-formasjonen, ruge celler med M20 inneholder ønsket konsentrasjonen av inaktivert donor serum og sammenligne vilkårene med grupperte humant serum kontroll. Leukocytter enn monocytter kan legges til på dette stadiet. Hvis undersøker virkningen av bestemte lipider/lipid arter (f.eks HDL, oxHDL), kan du utføre alle følgende med serum-frie medier som inneholder 20-50 µg/mL lipider. - Etter 1 h av frem transmigration, samle inn ikke-transmigrated cellene ved å vaske gels to ganger med 100 µL prewarmed 1 mm EGTA i 1 x PBS, og én gang med 100 µL M199 (samme sentrifuge forhold), samle supernatants fra hver brønn av samme eksperimentell tilstand (vanligvis 6 wells) i en 1,5 mL microcentrifuge rør på is. Sentrifuge cellene ikke-transmigrated på 4 ° C, 300 x g i 5 min og resuspend i 30 µL 1 x PBS.
- Telle celler samlet i nedbryting å bestemme antall frem transmigrated celler.
- Prosentandelen av frem transmigrated celler fastsettes som følger:
- dekke de vasket gelé som inneholder transmigrated celler med 100 µL M20 og Inkuber for en ytterligere 48 h.
- Etter 48 h, samle nedbryting og vask ikke-transmigrated celler to ganger med 100 µL prewarmed 1 mM EGTA/PBS, innsamling og pooling nedbryting fra hver betingelse som i trinn 5.2.
Merk: Fenotypen av omvendt transmigrated celler kan testes på disse cellene following standard flowcytometri Fargeprotokoller. - Sentrifuge celler ved 4 ° C, 300 x g i 5 min og resuspend celler i 30 µL 1 x PBS. Telle celler og bestemme levedyktigheten via trypan blå flekker.
- Finne ut prosentandelen av omvendt transmigrated celler ved hjelp av følgende ligning:
Merk: regnskap for antall frem transmigrated celler gir en mer nøyaktig angivelse av omvendt transmigration som det er usannsynlig frem transmigration blir 100%. - For analyse av mikroskopi, fikse geléer legger til 100 µL 2% formaldehyd (siste konsentrasjon) i hver brønn, også dekke plater i aluminium folie og lagre på 4 ° C før analysen. For flowcytometri, ikke fikse cellene på dette stadiet. Se protokollene nedenfor for mikroskopi (inndelingen 6) eller flyt cytometri (del 7) analyse.
FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig og etsende; Bruk personlig verneutstyr (PVU). Forsiktighet bør utvises når formaldehyd, men trenger ikke dette trinnet utføres i avtrekksvifte på grunn av lav konsentrasjon brukes.
6. Kvantifisering av skum celler og makrofager av mikroskopi (olje-rød O flekker)
- fjerne formaldehyd og vask gels med 100 µL av 50% (v/v) metanol i 5 min og deretter 100 µL 78% (v/v) metanol i 15 min.
Merk: Punktene flekker kan utføres på laboratoriebenken og ikke i en klasse II Biohazard skap. - Flekk for lipid dråper av legge 100 µL av nylagde 0,2% (w/v) olje-rød O (se Tabell for materiale for detaljer) 1t ved romtemperatur.
- Fjern overflødig flekken ved å vaske geléer 4 ganger med 100 µL av 78% (v/v) metanol, aspirating og forkaster nedbryting etter hver Wash
- Counterstain for 15 min ved romtemperatur med 100 µL av Giemsa, utvannet 1:10 i destillert vann.
- Sug opp Giemsa flekken og vaske gels gang med vann.
- For å koble geléer fra platen, rim brønnene med en 21 G nål, skråkanten vender utover, rundt kanten av gel.
- Monteres geléer på et mikroskop lysbilde, slå to hull (6,35 mm diameter) i en 2,54 cm x 1,5 cm stripe dobbeltsidig tape. Fastsette båndet til en standard mikroskop side og fjern den beskyttende belegget ovenfra.
- Legge til en dråpe vann til hullene i båndet ved hjelp av en overføring pipette. Bruke pinsett, forsiktig overføre gels i hullene i bånd og dekk med en størrelse 1,5 glass dekkglassvæske. Trykk forsiktig på dekkglassvæske å følge det båndet.
- Undersøke med differensial forstyrrelser kontrast lyse-feltet mikroskopi bruker 40 X målet på en invertert mikroskopet.
- Ta HUVEC monolayer i fokus på 40 X forstørrelse og bla ' i ' gel, telle makrofager/skum celler gjennom hele dybden av gel. Gjenta for tre distinkte synsfelt ligger i samme avstand fra kanten av gel for å minimere mulig kanteffekter. Dette vil sikre gel dybden er samsvar mellom telling regioner.
Merk: Score celler i gel som enten skum celler (definert som cellene som inneholder > 1/3 av deres cytoplasma som olje-rød O farget lipid dråper) eller makrofager innen 2 timer med montering på lysbilder ( figur 2). Skum celle-formasjonen er uttrykt som en prosentandel av skum celler i forhold til det totale antallet overførte celler og uttrykkes som median teller i 3 synsfelt undersøkt for 6 gels per betingelse, derfor en median på 18 mål per betingelse. Et eksempel på rå celletall fra et typisk eksperiment er vist i tabell 2.
Merk: Klassifisere en celle som en skum celle vs macrophage av mikroskopi er subjektiv og følgelig kan være etterforsker-avhengige. I kliniske studier, der eksperimenter utføres over en lengre periode, er det viktig for alle teller utføres blendet av en enkelt etterforsker. Eksempler på skum celler og makrofager i gels finnes i figur 2.
- Ta HUVEC monolayer i fokus på 40 X forstørrelse og bla ' i ' gel, telle makrofager/skum celler gjennom hele dybden av gel. Gjenta for tre distinkte synsfelt ligger i samme avstand fra kanten av gel for å minimere mulig kanteffekter. Dette vil sikre gel dybden er samsvar mellom telling regioner.
7. Analyse av Transmigrated celler av Flow cytometri
- svært karakterisere skum celler og makrofager etter transendothelial overføring, fordøye geléer ved å legge til 100 µL av 37 ° C prewarmed 1 mg/mL collagenase D fortynnet i M199 til hver godt og ruge etter 20 min på 37 °C/5% CO 2.
Merk: Plassere 96-brønns plater direkte på rent metall rack i inkubator å sikre jevn. - Etter inkubasjon macerate gels med en 200 µL pipette tips og Inkuber for ytterligere 20 min på 37 °C/5% CO 2.
- En gang fullt fordøyd, filter og bassenget fordøyd Repliker geléer gjennom 35 µm nylon maske avkortet FACS rør på is, og vask en gang med FACS vask (se tabell av materialer) på 4 ° C, 300 x g. Resuspend cellene i 100 µL av FACS Wash
- Ruge resulterende cellene med fluorophore-konjugerte antistoffer spesifikke for CD45, merketråd live/dead cellen og overflaten/intracellulær fenotypiske eller funksjonelle markører rundt ved hjelp av standard flyt cytometri protokoller.
Merk: Forberede kontroll rør for kompensasjon ved hjelp av riktig fluorophores og Ig kompensasjon perler. Utdraget celler kan også hentes på glass lysbilder for immunofluorescence mikroskopi cytospinning. Også har vi lykkes samlet celler ved hjelp av denne protokollen for vurdering via imaging flowcytometri. - Kjøpe celler ved hjelp av en flow cytometer og utføre kompensasjon som kreves.
Merk: Skum celler/makrofager ikke nødvendigvis personlige populasjoner med lyse scatter egenskaper og kan variere betydelig i størrelse og form, angi liberale frem xy (FSC) og siden xy (SSC) porter for å fange alle overførte celler som vist i < sterk class = "xfig" > figur 3A. - Etter oppkjøpet, utføre dataanalyse ved hjelp av flyt cytometri programvare. Identifisere overførte celler, Merk cellene som negativ for live/dead markøren som vist i figur 3B. Deretter utføre en enkeltcelle diskriminering ved å opprette en fast gate rundt cellene vises på en SSC-området vs SSC høyde tomt.
- Velg CD45 + celler og gate store befolkning overførte celler i et FSC/SSC plott som disse er makrofager/skum cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantifisere monocytt transmigration
Monocytter er lagt til i modellen som beskrevet i figur 1, og seks gels er forberedt for hvert vilkår. Monocytter for 6 gels per donor (i.e.5.0 x 104 monocytter per gel 6 gels = 3.0 x 105 monocytter per donor) er resuspended til et endelig antall 600 µL M199 medietyper som inneholder den nødvendige serum/isolert lipid. Celler (dvs, 100 µL per gel = 5.0 x 104 monocytter) er så aliquoted på gels og inkubert som ovenfor om 1t å lette monocytt transmigration. Etter transmigration telles ikke-transmigrated celler som ovenfor. I dette eksemplet ble 1,5 x 104 ikke-transmigrated celler gjenopprettet. Andelen frem transmigration ble bestemt ved hjelp av formler som beskrevet i trinn 5.4:
Etter 48 timer med inkubering gjenvunnet 3.6 x 104 omvendt transmigrated celler som ovenfor. Prosentandelen av omvendt transmigration ble bestemt ved hjelp av formelen i trinn 5,8:
Revers transmigration kan sammenlignes mellom vilkår bruker passende statistiske tester og monocytter forberedt fra flere uavhengige givere til å bestemme om monocytt transmigration mulighet er endret mellom eksperimentell forhold.
Evaluere skum celle-formasjonen
Brightfield mikroskopi
Oksidert lipoproteiner er kjent for å fremme monocytt-avledet skum celle formasjon i vitro i forhold til unoxidized lipider15. Her bekrefte vi at behandling av monocytter med oxLDL, brukte å indusere skum celle-formasjonen i konvensjonelle skum celle induksjon modeller, forbedrer monocytt-avledet skum celle-formasjonen i denne modellen av transendothelial migrasjon og skum celle-formasjonen i forhold til opprinnelige LDL. Etter monocytt transmigration og skum celle formasjon i gels inkubert med M199 som inneholder 50 µg/mL innfødt eller CuSO4-oksidert LDL (se trinn 5.1, figur 1), celler ble analysert av mikroskopi. Eksempler på skum celler og makrofager i representant eksperimenter er vist i figur 2. Cellene ble talt, i tre ulike felt per gel, med fokus på HUVEC monolayer og fokuserer stadig dypere inn i gel. Celletall registreres for hver giver som vist i tabell 2 for en enkelt donor, sammenligne prosentandelen av skum celler i respons til oksidert og innfødt LDL. Samle data fra n = 12 uavhengig teller er vist i Figur 4 å bekrefte at inkubering av monocytter med oxLDL i denne modellen induserer mer skum celle formasjon enn forhold der monocytter er ruges med innfødt LDL eller M199 media alene.
Flowcytometri
For å avgjøre fenotypen av overførte celler, er cellene utdraget fra fordøyd gels og merket en standard flyt cytometri panelet. Celler ble merket med merketråd live/dead cellen og antistoffer spesifikke for CD45 og andre overflate fenotypen markører ved hjelp av standard flyt cytometri protokoller. Kompensasjon kontroller må også være forberedt på full kompensasjon som standard flyt cytometri teknikker. Overførte celler er gated som vist i Figur 3 tomter representant for 10 uavhengig eksperimenter. Lever celler er gated bruker live/dead celle levedyktighet analyser (figur 3B) og doublets er utelukket ved enkelt celle analyse (Figur 3 c). Celler er deretter gated som CD45+ for å utelukke HUVEC (som disse cellene er CD45-, figur 3D). Den store befolkningen deretter Portes av fremover scatter/side scatter diskriminering (figur 3E) og mener fluorescens intensiteten (MFI) av reseptorer rundt fastsettes i forhold til enten fluorescens minus én (FMO) eller isotype kontroll ( Figur 3F) å avgjøre uttrykk (ΔMFI) eller en prosentandel av positive celler.
Figur 1 : En i vitro modell av monocyte transmigration og skum celle formasjon. (A) PBMC, (B) totalt monocytter eller (C) FACS-sortert monocytt delsett legges skrive jeg fibrøs kollagen gels dannet i 96-brønnen plater og kledde med en monolayer av aktivert primære menneskelige navle vene endotelceller (HUVEC), som har integritet vurderes av sølv flekker ((D)) og (E) transmigrate 1t i nærvær av serum- eller lipid inneholder medier. Non-transmigrated celler telles (F) og gels er ruges i et ytterligere 48 timer med den samme serum/lipid inneholder medier. Etter inkubasjon (G) omvendt overførte celler telles og prosentandelen av skum celler og makrofager i gel bestemmes av (H) fase kontrast mikroskopi etter farging med olje-rød O eller fenotypen av overførte celler bestemmes av (jeg) flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempler på skum celler og makrofager i en i vitro modell av monocyte transmigration og skum celle formasjon. RepresentatIve eksempler på celler scoret som skum celler (hvite piler) og makrofager (svart piler) etter Giemsa flekker for å visualisere celler og olje-rød O flekker å visualisere lipid dråper som fase kontrast mikroskopi utdraget gelé med en omvendt mikroskopet på 40 X forstørrelse. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Gating strategi transmigrated celler av flowcytometri. Transmigrated celler er svært preget av flowcytometri etter utvinning av celler fra gels. Celler er gated av (A) FSC/SSC, (B) lever celler, (C) enkeltceller, (D) CD45+, (E) FSC/SSC og (F) uttrykk for reseptor sammenlignet isotype eller fluorescens minus én (FMO) kontroll. Uttrykket av reseptorer av interesse er definert som mener fluorescens intensitet (MFI) og uttrykt med hensyn til nivåer av isotype. ΔMFI = flekker (MFI) minus isotype/FMO kontroll (MFI). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Effekten av exogenously ekstra oxLDL og LDL på monocytt-avledet skum celle formasjon. Skum celle formasjon bestemmes under forhold der monocytter fra en enkelt donor er ruges med media (M199) eller 50 µg/mL unoxidized lav tetthet lipoprotein (LDL) eller kobber (II) sulfat oksidert LDL (oxLDL) legges til gels etter transmigration. Teller for 12 forskjellige områder vises. Skum celler uttrykkes som en prosentandel av total overførte celler. Median og interquartile vises i stolpediagrammer og sammenligninger ble gjort ved hjelp av ikke-parametriske Mann-Whitney U tester. p < 0,001, *** p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | [Lager] | [Ferdig] | Volumet for 60 gels (µL) |
| NaOH | 100 mM | 35.7 mM | 1071 |
| M199 | 10 x | 0.71 x | 213 |
| AcCOOH | 20 mM | 4.58 mM | 687 |
| Kollagen | 5 mg/mL | 1.71 mg/mL | 1029 |
| Totalt volum | - | - | 3000 |
Tabell 1: Type I fibrøs kollagen gel forberedelse
| LDL | oxLDL | |||||||
| Gel | Antall | Skum celler1 | Overførte celler1 | Skum celler (%)2 | Skum celler1 | Overførte celler1 | Skum celler (%)2 | |
| 1 | 1 | 5 | 44 | 11.4 | 26 | 55 | 47.3 | |
| 2 | 5 | 27 | 18,5 | 10 | 23 | 43.5 | ||
| 3 | 11 | 52 | 21,2 | 19 | 39 | 48,7 | ||
| 2 | 1 | 5 | 34 | 14.7 | 9 | 31 | 29 | |
| 2 | 14 | 50 | 28 | 32 | 55 | 58,2 | ||
| 3 | 5 | 37 | 13.5 | 19 | 37 | 51,4 | ||
| 3 | 1 | 10 | 37 | 27 | 28 | 52 | 53.8 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 11 | 31 | 35.5 | ||
| 3 | 7 | 38 | 18.4 | 28 | 53 | 52.8 | ||
| 4 | 1 | 9 | 44 | 20.5 | 14 | 33 | 42.4 | |
| 2 | 7 | 33 | 21,2 | 22 | 47 | 46,8 | ||
| 3 | 11 | 50 | 22 | 11 | 30 | 36.7 | ||
| Median skum celler (%) | 20,8 | 47 | ||||||
| Gjennomsnittlig skum celler (%) | 19,8 | 45,5 | ||||||
Tabell 2: rå celle teller fra sammenligning av monocytt-avledet skum celler etter LDL vs oxLDL behandlinger. 1 Cellen teller per synsfelt i gel. 2 Prosentandel av skum celler = skum celle teller/totalt overførte celle teller x 100. * Data er representant for et eksperiment ved hjelp av monocytter fra en enkelt donor
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tilbyr en allsidig og fysiologisk relevante metode for å vurdere atherogenicity av monocytter fra menneskelige kliniske kohorter, ved å kombinere både monocytt transmigration og skum celle formasjon. Denne modellen har fordeler over alternativ metoder av skum celle formasjon som tar hensyn til effekten av monocyte transmigration på skum celle formasjon og lar måling av omvendt transmigration6 i tillegg til den iboende tilbøyelighet av monocytter å modne i skum celler i tilstedeværelse eller fravær av ytre faktorer. Videre er rollen endothelial aktivisering også tatt hensyn som vi har vist at endothelial aktivisering upregulates oksidasjon av lipid arter som er forbundet med skum celle formasjon14. Endelig kan fenotypen av monocytter som gjennomgå egress (en egenskap knyttet plakk regresjon) være kvantifisert og preget av mikroskopi og flyt cytometri.
På grunn av tredimensjonale natur transmigration i gels, identifisere og scoring transmigrated cellene som skum celler og makrofager kan være vanskelig som celler transmigrate til ulike nivåer i gel19. For å hjelpe identifisering av skum celler, må frisk olje-rød O flekken alltid brukes. Det er også merke at ulike ex vivo sykdomstilstander eller i vitro betingelser kan endre monocytt transmigration i gel. Vi har brukt levende celle imaging for å identifisere at monocytter fra HIV-infiserte individer tendens til å transmigrate til grunnere poeng i gels og på ulike hastigheter enn uninfected enkeltpersoner19. Videre skum celle-formasjonen er forbundet med mindre monocytt motilitet i gel så celler pleier å gå i sirkler på en bestemt z-inndeling i forhold til celler fra HIV-infisert individer som pleier å overføre i en relativt rett linje mot den bunnen av gel. Disse funnene øke muligheten for et lignende fenomen forekommer i eksperimenter med menneskelige pasientprøvene fra andre sykdomstilstander knyttet til økt monocytt atherogenicity.
Når du utfører flyt cytometri-baserte analyser er det vanlig å observere en betydelig andel av døde celler i befolkningen gjenopprettede cellen ved fastsetting levedyktighet ved hjelp av live/dead celle markører (figur 4B). Disse cellene er overveiende CD45- HUVEC som har blitt skadet under kollagen fordøyelsen/maserasjon trinn kreves for å trekke ut monocytt-avledet celler fra kollagen matrix. Denne prosessen er spesielt hardt på HUVEC monolayer, men er ikke skadelig for phenotyping transmigrated cellene.
Denne modellen er forskjellig fra andre i at ingen kunstig oksidert eksogene lipid kreves i kultur media stasjonen monocytt-avledet skum celle-formasjonen. I stedet er skum celle-formasjonen i denne analysen påvirket av serum i kultur media, slik at for diskret virkningene av løselig faktorer fra klinisk prøver å bli vurdert. Slik har vi vist at inkubasjonstiden for kontroll monocytter med serum fra unge HIV-smittede19 eller eldre HIV-infisert20 personer fremmer skum celle formasjon, som indikerer at løselig faktorer kan uavhengig fremme skum celle-formasjonen. Som analysen er påvirket av løselig komponenter, må en enkelt gruppe med grupperte humant serum brukes for eksperimenter sikte på å fastsette iboende forskjellen atherogenic egenskaper av monocytter avledet fra ulike individer for å standardisere kontrollere forhold. Denne analysen kan også brukes til å vurdere rollen til bestemte lipid arter fra klinisk prøver (Figur 3). For eksempel har vi funnet at inkubering av monocytter med mediet som inneholder isolert lipid arter som high-density lipoproteiner fra personer med kjente lipid dysfunksjon24 også fremmer skum celle formasjon. I dette tilfellet kan monocytter fra en sunn enkeltperson eller gruppe av individer brukes i serum eller serum faktorer avledet fra test fag. Derfor gir denne modellen konkrete spørsmål stilles om diskrete effekter av både løselige og cellulære komponenter på skum celle formasjon.
Denne analysen benytter HUVEC som modell av koronar endotelet på grunn av praktiske problemer å skaffe stort antall lave passasje antall primære koronar celler. Men vi har sammenlignet resultatene fra analyser både menneskelige koronar endotelceller eller HUVEC og observert liten forskjell i monocytt transmigration eller skum celle-formasjonen (data ikke vist), som indikerer at bruk av HUVECs i dette systemet er en akseptabel erstatning. Manuelle telle celleområde skum er en begrensende faktor i denne modellen som det kan introdusere operatør bias. Derfor må alle prøver montert på lysbildene bli blendet til operatøren for å fjerne potensialet skjevhet. Vi har imidlertid forhold skum celle formasjon målt ved manuell teller og tenkelig flowcytometri og funnet at disse metodene gir lignende resultater19. En nøkkel begrensning av denne modellen er at monocytt vedheft og transmigration skje i fravær av skjær krefter knyttet fysiologiske blod flyte i vivo. Vi hypothesize at skjær flyt påvirker hovedsakelig monocytt transmigration og ikke senere skum celle-formasjonen i matrix; men må dette vurderes når tolke resultatene fra denne analysen. Denne analysen også modell ikke påvirkning av glatte muskelcellene i monocytt-avledet skum celle formasjon som er en fysiologisk begrensning av systemet; men er dette konsekvent i alle forhold slik at diskret atherogenic potensialet av monocytter sammenlignes mellom forskjellige sykdomstilstander.
I sammendraget gir denne modellen en allsidig og fysiologisk relevante metode for kvantifisere monocytt transmigration og skum celle formasjon fra prøver fra mennesker i ulike sykdom stater ex vivo. Denne modellen har ytterligere programmer for å vurdere tilbøyelighet av monocytter å danne skum celler i forhold der monocytt atherogenicity er forbundet med økt risiko for CAD som fedme25, diabetes26 og kronisk nyresykdom sykdom27. Denne modellen kan derfor også optimaliseres for bruk i sykdom stater enn aterosklerose der mobilnettet transmigration kan påvirke sykdom patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig arbeidet med Prof William Muller og Dr. Clare Westhorpe for sin viktige rolle i utviklingen av tidligere gjentakelser av denne modellen. Forfatterne vil også gjerne takke AMREP Flow cytometri kjernen for sorteringen av monocyte delsett og Alfred sykehus smittsom sykdom enheten klinisk forskning sykepleiere for rekruttering av HIV + individer for noen studier. Forfatterne erkjenner takknemlig bidrag til dette arbeidet Victoria operative infrastruktur støtteprogrammet mottatt av Burnet Institute. TAA støttes av en RMIT University-Visekanslers postdoktorstipend. Dette arbeidet ble støttet av NHMRC prosjekt stipend 1108792 tildelt AJ og AH. TK støttes av NIH gir NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel preparation reagents | |||
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465-500G | 0.1 M NaOH diluted in H20 |
| 10x M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | |
| AcCOOH | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | 20 mM Acetic acid diluted in H20 |
| Cultrex Bovine Collagen I | R&D Systems | 3442-050-01 | Type I Fibrous Collagen |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| M199 | Life Technologies | 11150-059 | M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine and 100 U/mL penicillin/streptomycin |
| M20 | Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199. |
||
| HUVEC | Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially. | ||
| Human coronary artery endothelial cells | Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially. | ||
| EDTA | BDH Merck | 10093.5V | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889-500G | Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0 |
| 0.05% trypsin EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X) |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | L-glutamine (200 mM) |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin) |
| New born calf serum | Gibco | 16010-142 | New born calf serum: New Zealand origin |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1056-1MG | Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored |
| PBS (1x) | Gibco | 14200-075 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20 |
| 0.1% TNF | Gibco | PHC3015 | Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots |
| Low-density lipoprotein | Merck Millipore | LP2-2MG | Low-density lipoprotein (LDL) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy | |||
| 1 or 2% formaldehyde | Polysciences | 4018 | 1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20 |
| 50% and 78% methanol | Ajax Finechem | 318-2.5L GL | 50% or 78% v/v methanol, diluted with H20 |
| Oil Red O stain | Sigma-Aldrich | O0625-25G | Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol |
| Microscope slides | Mikro-Glass | S41104AMK | Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm) |
| Cover slips | Menzel-Gläser | MENCS224015GP | 22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips |
| Double-sided tape | 3M Scotch | 4011 | Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m) |
| Giemsa stain | Merck Millipore | 1.09204.0500 | Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20) |
| Hole punch | Hand-held single hole punch (6.35 mm punch) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow cytometry | |||
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL |
| 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes | BD Biosciences | 352235 | 35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes |
| Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain | Life Technologies | L34959 | Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain |
| FACS wash | Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96 well plate | Nunclon | 167008 | Delta surface flat-bottomed 96 well plate |
| 10 cm Petri Dish | TPP | 93100 | Sterile 10 cm Petri dish |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | Eppendorf tubes |
| Transfer pipette | Samco Scientific | 222-20S | Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb) |
References
- Napoli, C., et al. Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).
- Xu, L., et al. Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).
- Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets. Scientific Reports. 6, 20038 (2016).
- Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease. Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).
- Llodrá, J., et al. Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal Models of Atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Meir, K. S., Leitersdorf, E. Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).
- Hilgendorf, I., Swirski, F. K. Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease. Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography. J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).
- Boyden, S. The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes. J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model. Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).
- Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).
- Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).
- Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. Oxidized Low-Density Lipoprotein. Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).
- Muller, W. A., Weigl, S. A. Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay. J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).
- Maisa, A., et al. Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration. AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).
- Angelovich, T. A., et al. Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms. Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).
- Westhorpe, C. L. V., et al. Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages. J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).
- Müller, A. M., et al. Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro. Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Gacka, M., et al. Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes. J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease. Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).
