Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/56294
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

Summary

En strømlinet protokol til at udføre en omfattende biokemiske og strukturel karakterisering af en kulhydrat substrat bindende protein fra Streptococcus pneumoniae er præsenteret.

Abstract

Udvikling af nye antimikrobielle stoffer og vacciner til Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) er nødvendige for at standse den hurtige stigning i flere resistente bakteriestammer. Kulhydrat substrat bindende proteiner (SBPs) repræsenterer levedygtigt mål for udviklingen af protein-baserede vacciner og nye antimikrobielle stoffer på grund af deres ekstracellulære lokalisering og centralitet kulhydrat import for pneumokok metabolisme, henholdsvis. Beskrevet her er en rationel integreret protokol til at foretage en omfattende karakterisering af SP0092, som kan udvides til andre kulhydrat SBPs fra pneumokokker og andre bakterier. Denne procedure kan støtte den struktur-baseret design af inhibitorer for denne klasse af proteiner. Præsenteret i den første del af dette manuskript er protokoller til biokemiske analyser af termisk Skift assay, multi vinkel lysspredning (MALS) og størrelse udstødelse kromatografi (SEC), som optimerer stabiliteten og homogenitet af prøven rettet til krystallisering forsøg og så øge sandsynligheden for succes. Den anden del af denne procedure beskriver karakterisering af SBP krystallerne ved hjælp af en afstemmelige bølgelængde anomale diffraktion synkrotron beamline og data indsamling protokoller for måling data, der kan bruges til at løse det krystallisere protein struktur.

Introduction

S. pneumoniae (pneumokokker) er en gram-positive bakterie bosat asymptomatically i de øvre luftveje i de menneskelige luftveje med evnen til at migrere til normalt sterilt nicher forårsager otitis, lungebetændelse, sepsis, blodforgiftning, og meningitis1,2. Derudover er pneumokok-infektion den hyppigste årsag til EF erhvervede pneumoni, som bidrager til en klinisk og økonomisk byrde på verdensplan3,4. Antibiotika-resistente stammer af S. pneumoniae har spredt over hele kloden og selv om en syv-Valente og en tretten-valent pneumokok protein konjugat vaccine har hjulpet reducere antallet af antimikrobiel resistens, udskiftning stammer fra vaccine er dukket op og har ført til øgede krav til forskning i udvikling af nye behandlinger for pneumokoksygdom5,6,7,8.

Af pneumokokker afhænger sukker importeret fra værten som en carbon kilde9,10; faktisk vier det 30% af dets import maskiner til transport af 32 forskellige kulhydrater11,12,13. Disse importører omfatter mindst otte ABC-transportører13. I ABC-transportører spille de ekstracellulære SBPs en grundlæggende rolle i fastsættelsen specificitet for liganden og forelægger det for integreret membran transporter for optagelse i cellen. SBPs repræsenterer gyldige mål for udformningen af nye vacciner og antimikrobielle stoffer, fordi de er overflade proteiner og deres afgørende rolle i cellulære processer.

Target protein karakterisering og detaljeret beskrivelse af strukturelle træk, ligesom ligand lommer og interdomain fleksibilitet, giver et nyttigt redskab for struktur-baseret drug design14,15. Røntgenkrystallografi er den foretrukne metode til strukturel karakterisering af proteiner i nærheden atomic opløsning, men krystallisering processen er uforudsigelig, tidskrævende og ikke altid vellykket. Systematiske metoder har forbedret succesrate og vigtige faktorer er prøven kvalitet og stabilitet. Succesraten for krystallisering er påvirket af protein kemiske egenskaber og prøve forberedelse metode. Effekten af disse kan vurderes og informeret af biokemiske karakterisering16,17.

En yderligere komplikation for struktur-baseret design er krystallografiske fase problem, som skal løses. Som flere proteinstrukturer blevet tilgængelige, kan mange strukturer løses af molekylære replacement-metoden, som kræver en homolog struktur18. Som SBPs præsentere en fleksibel domænestruktur, Molekylær udskiftning kan også vise sig udfordrende19. Hvis en strukturel model, der er tilstrækkelig lig target proteinet ikke er tilgængelig, kan en række teknikker bruges til at få det eksperimentelle phasing20. Blandt disse, Single-bølgelængde anormal Dispersion (SAD) metode har vist sig som den primære teknik og har været flittigt brugt til at løse fase problem21. Brug af metoden TRIST har været yderligere avanceret med forbedringer i hardware og software, samt data samling strategier til at tillade registrering og brug af svage unormale signaler for udfasning22,23, 24. Derudover forskud i direkte metoder for løse strukturer af makromolekyler, som tidligere krævede diffraktion data til atomic opløsning, kan nu udnyttes ved at kombinere for eksempel stereokemiske viden som implementeret i programmet ARCIMOLDO25. En nyttig gennemgang af metoder for at løse den fase i krystallografi er givet ved Taylor26.

Her præsenterer vi en rationel protokol til karakterisering af kulhydrat transport SBP, SP0092 af S. pneumoniae, integrere biokemiske og strukturelle teknikker (figur 1). Denne trinvise protokol giver et nyttigt eksempel prøvesag af strategier for at forbedre succesrate af strukturelle undersøgelser af SBPs i almindelighed, som findes i alle riger af liv. Navnlig protokollen fremhæver betydningen af kendetegner den mest stabile oligomere tilstand af protein i opløsning i en hurtig og effektiv metode, og giver mulighed for identifikation af de bedste arter at følge for krystallisering eksperimenter. Selv om der er over 500 SBP strukturer indberettet i Protein Data Bank27, Molekylær udskiftning kan være en udfordring på grund af den iboende fleksible karakter af de to α/β domæner, der er forbundet med en hængslet regionen19. Således, den anden del af protokollen beskrives ved hjælp af metoden TRIST for udfasning fra bundne metalioner, som er fælles i SBPs, samt indarbejdelse af selenomethionin og brug af selen (Se) i TRIST udfasning.

Protocol

Bemærk: den kodende sekvens som signal peptid er slettet er klonet i pOPINF vektor efter en standardprotokol i fusion; den nativt protein er udtrykt som en hans-tag fusion i Escherichia coli BL21 Rosetta celler 28 , 29. selenomethionin mærket variant udtrykkes efter standardmetoder ifølge producenten 30. Rekombinant SBP er renset som tidligere beskrevet 31 , 32.

1. biokemiske karakterisering

  1. termiske Skift assay
    1. forberede 48 buffer af opløsninger med pH spænder fra 4.0 til 9,5 og NaCl koncentration fra 0 til 0,5 M, og dispensere 40 µL i en 96-brønd plade som beskrevet i Tabel 1 33.
    2. tilføje til hver godt 5 µL af opløsningen SBP i 1-2 mg/mL koncentration.
    3. Tilføje til hver godt 5 µL af 20 x fluorescerende plet for proteiner (Se Tabel of Materials).
    4. Blandes løsningerne af pipettering, forsegle pladen ved hjælp af en gennemsigtig selvklæbende film og spin for 2 min på 112 x g ved stuetemperatur.
    5. Eksperiment på en real-time maskine: sæt en temperatur rampe på 3 ° C/min. fra 4 til 99 ° C med en 10 s hold tid, og læse fluorescens hver 0,5 ° C med excitations på 483 nm- og på 568 nm.
    6. Analysere fluorescens emission kurver for hver buffer betingelse, at identificere den smeltende temperatur (T m) som minimum af afledede.
      Bemærk: Denne procedure giver en god indikation af de bedste stødpudeopløsning til støtte i forbedring af protein stabilitet. Vælg pH interval og salt koncentrationen baserede på buffer-tilstand med den højeste T m og tilføje 2,5% (v/v) af glycerol og 0,5 mM af tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) til at definere stødpudeopløsning for de følgende trin (SEC-buffer).
  2. MALS og analytiske sek
    1. udføre en to-kolonne volumen vask af kolonnen færdigpakkede gel filtrering med afgassede filtreret vand (brug en bred vifte molekylvægt 24 mL kolonne).
    2. Tilsluttes lysspredning detektor kolonnen og Blandingen henstår kolonnen med den beslutsomme sek-buffer fra termiske Skift assay.
    3. Indsprøjtes 100 µL af renset SBP på 5 mg/mL i den afbalancerede sek kolonne og flow én kolonne volumen af SEK-buffer.
    4. Kontrollere eluering kromatogrammet for én eller flere toppe og undersøge spredning data ved hjælp af analysesoftwaren, at opnå den molar masse og polydispersity indekset for alle arter.
      Bemærk: For hver top, der svarer til en oligomere arter, det er gavnligt at kontrollere polydispersity indeks beregnet som molar masse vægtet på masse/molar masse vægtet antal molekyler (Mw/Mn). En polydispersity værdi tæt på 1 angiver en monodispersed peak.
      Bemærk: Når alle oligomerisering arter er defineret, er det nyttigt at studere deres afhængighed af proteinkoncentration, som højere koncentrationer kunne favorisere større oligomer dannelse.
    5. Udføre flere analytiske sek løber; indsprøjtes 100 µL af renset SBP ved stigende koncentrationer (0,1 - 10 mg/mL) i kolonnen afbalancerede gel filtrering (brug en bred vifte molekylvægt 5 mL kolonne) og flow 1 kolonne rumfang sek-buffer hver gang.
    6. Kontrollere eluering kromatogrammet for én eller flere toppe og analysere absorbans intensiteter på 280 nm af kurverne svarer til forskellige start protein koncentrationer. Hvis de relative intensiteter af de forskellige toppe forblive konstant, så er ingen Inter konvertering mellem de oligomere arter til stede. Variation i de relative intensiteter i forskellige koncentrationer er en indikation af energifremtid mellem forskellige oligomere arter, der er afhængige af proteinkoncentration.
      Bemærk: Denne karakterisering trin er grundlæggende at definere, hvilke arter er mere velegnede til krystallisering. Faktisk adskiller sig monodispersed arter er mere tilbøjelige til at krystallisere hvis de er i en konstant oligomere tilstand ved en bestemt koncentration.

2. Protein forberedelse og krystallisering

  1. forberedende sek
    1. efter en enkelt kolonne volumen vask med afgassede filtreret vand, reagensglasset med SEC-buffer kolonnen forberedende færdigpakkede gel filtrering (en lang række Molekylær vægt 120 mL kolonne).
    2. Tilføre den afbalancerede gel filtrering kolonne og flow én kolonne volumen af SEK-buffer 1-5 mL renset SBP ved 5-50 mg/mL.
    3. Indsamle flow-gennem kolonne i 1 mL fraktioner.
    4. Pool i fraktioner, svarende til en enkelt monodisperse peak; spin prøven i 15 mL centrifugering filtre på 1.500 g og kvantificere koncentrationen, indtil den ønskede koncentration opnås (typisk 50-100 mg/mL for SP0092).
  2. Krystallisering
    1. bestemme den optimale koncentrationsområde for krystallisering eksperiment ved hjælp af pre krystallisering Test som beskrevet af fabrikanten:
      1. dispensere 0,5 - 1,0 mL af hver af de fire krystallisering test løsninger i en forskellige reservoir af en 24-godt møde drop krystallisering plade.
      2. Forberede krystallisering dråber ved at blande 1 µL af protein løsning med 1 µL af reservoir løsning og forsegle pladen inkuberes ved stuetemperatur for ikke mindre end 1 h (mere pålidelige resultater opnås efter natten inkubation).
      3. Check drop kvalitet for hver koncentration ved hjælp af en 10 x forstørrelse microscope.
        Bemærk: Test mindst tre forskellige proteinkoncentration: (I) de fleste af de dråber resterende klart angive, at proteinet er også fortyndet for krystallisering; (II) tilstedeværelsen af tunge bundfald i fleste af dråberne indebærer en alt for høj koncentration; og (III) en afbalanceret forekomst af både klare dråber og bundfald (bedre hvis lys) er en god indikation af at den testkoncentration er gunstige for krystallisering.
    2. Forberede 96-godt møde drop krystallisering plader; afpipetteres 100 µL af forskellige kommercielle krystallisering løsning i hver enkelt reservoir godt 34 , 35 , 36 , 37.
    3. give afkald på 100 nL protein prøve i de tidligere definerede koncentration (trin 1.1.6) i alle krystallisering drop brønde ved hjælp af en krystallisering robotsystem.
    4. Give afkald på 100 nL for de forskellige reservoir løsninger til den tilsvarende krystallisering drop wells at blande med protein udleveres i trin 2.2.3. Forsegle krystallisering plade for at undgå fordampning og aktiverer ækvilibrering af krystallisering drop med reservoiret.
    5. Check dråber med jævne mellemrum (i starten hver 1-2 dage senere hver uge) med en 10 x (mindst) forstørrelse mikroskop til at evaluere crystal dannelse og vækst.
      Bemærk: En automatiseret billedbehandling system til protein krystallisering kan bruges til dråber visualisering og indfange.
< p class = "jove_title "> 3. Krystal karakterisering og X-ray indsamling

  1. krystal montering
    1. forberede kryoprotektant løsning ved at tilføje 25% (v/v) af glycerol (endelig koncentration) til krystallisering tilstand (således at erstatte 25% vand i oprindelige blanding) 38.
    2. Udfylde en skum dewar med flydende kvælstof og sted prøve kabinet del af en uni-puck ind dewar. Lad det køle til flydende kvælstof temperatur.
    3. Skær og fjern forseglingen tape fra krystallisering pladen over drop hvor krystaller dannes.
    4. Placere en dråbe af 1 µL af kryoprotektant løsning på en coverslide, placeret i umiddelbar nærhed af target drop.
    5. Overføre de valgte krystal fra det oprindelige fald til kryoprotektant løsning drop ved hjælp af en nylon cryo-loop på RYGSØJLEN standard base monteret på en magnetiske stav 39 , 40.
    6. Hurtigt overføre krystal fra drop-kryoprotektant til flydende kvælstof, placere løkken i den første tomme position af uni-puck prøveholderen.
    7. Gentag (fra forsegling tape cut trin), indtil alle de ønskede krystaller er høstet og lagret i uni-puck prøveholderen.
    8. Sted uni-puck basere på uni-pucken med pucken wand og tage pucken til beamline (under flydende kvælstof betingelser).
      Forsigtig: Ekstremt lav temperatur!
    9. Bruge cryo-tænger og pucken dewar lastning værktøj til at indlæse uni-puck(s) i beamline prøve changer robot dewar. Uni-puck prøveholderen vil løsne sig fra base låget forlader prøven loop indehavere oprejst i stikprøven robot dewar og dermed udsat for den flydende kvælstof og tilgængeligt for prøven changer robot.
  2. Krystal karakterisering
    Bemærk: de høstede krystaller kan derefter blive screenet for diffraktion kvalitet ved hjælp af enten et laboratorium røntgen kilden eller på en synkrotron stråling (SR) X-ray kilde. Makromolekylære krystallografi (MX) beamlines give en afstemmelige energikilde for at udnytte anomale diffraktion struktur løsning. I det følgende afsnit en række arbejdsvejledninger i overensstemmelse med de eksperimentelle kapaciteter af Diamond lys kilde MX beamlines foreslås, men disse retningslinjer kan også tilpasses til MX beamlines på andre synchrotrons over hele verden.
    1. Som et første skridt, det er nyttigt at enten bekræfte eller identificere unormale scatterers i krystal. Dette kan nås bekvemt ved at måle en X-ray fluorescens spektrum fra krystal. Først sikre X-ray energi af at beamline er indstillet højt nok til at vække alle elementer typisk forventes for makromolekylære krystaller (14 keV eller højere).
    2. Bruge beamline kontrol software for at vælge stikprøven monteres af prøven changer robot; løkken centreres automatisk i X-ray stråle og crystal centrering kan bekræftes manuelt ved hjælp af beamline kontrol software.
    3. Optage en X-ray fluorescens spektrum ved hjælp af beamline kontrol software: brugeren vælger en eksponeringstid og initierer måling (Fluorescens/fluorescens spektrum indstilling, → køre, figur 2A). Beamline kontrol software holdninger automatisk X-ray fluorescens detektor i sted og bestemmer den mindste hændelse X-ray flux at opnå en læsbar signal på fluorescens detektor. Den erhvervede spektrum er derefter analyseret i en automatiseret måde med emission toppe monteret på naturligt forekommende biologiske elementer. Disse rutiner er tilgængelige inden for beamline kontrol software anskuelighed brugergrænsefladen (GUI) - GDA (www.opengda.org) på vores virksomhed og på synchrotrons i hele Europa 41 , 42.
    4. Hvis egnet elementer identificeres der kan udnyttes til en unormal diffraktion eksperiment, udføre en X-ray absorption kant energi scanning for at bestemme den optimale bølgelængde for samling af anomale diffraktion data fra krystal: på beamline kontrol software, skal du vælge elementet og indlede scanningen (Fluorescens/fluorescens Skan indstilling, → Atom navn, → køre, figur 2B).
      Bemærk: For en enkelt anomale diffraktion eksperiment, toppen af absorption kant bruges til at maksimere den unormale spredning. Eksperimentelle overvejelser for at udføre en multi bølgelængde anomale diffraktion eksperiment har været tidligere detaljerede 43.
    5. Til at bestemme krystal enhed celle parametre, symmetri og diffraktion grænse, måle tre røntgen diffraktion mønstre i 45° intervaller ved hjælp af metoden svingning (Data indsamling/Screening → køre aktuelle, Figur 2 c). Beamline kontrol software giver brugeren et valg af svingning vinkel og eksponeringstid og muligheden for at angive den procentvise transmission af X-ray stråle. For en standard krystal screening anbefales en svingning vinkel på 0,5 °, en eksponeringstid på 0,5 s og 5% X-ray stråle transmission. De målte diffraktion billeder analyseres automatisk af EDNA rørledningen og returnere et sæt af strategier for indsamling af en komplet datasæt 22.
  3. X-ray dataindsamling
    Bemærk: brugeren kan vælge for at indsamle data i standard svingning- eller inverse beam tilstand, som muliggør Friedel hjælpere skal registreres tæt i tid og X-ray dosis og med omtrent samme absorption adfærd giver en mere nøjagtig måling af anomale forskelle. Sidstnævnte er nyttigt, især hvis lille anomale forskelle forventes og/eller prøverne er stråling følsomme, når de udfører en unormal diffraktion eksperiment. Overvejelser om de bedste data indsamling strategier til at bruge er blevet grundigt revideret 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47.
    1. med beamline kontrol softwaren, importerer data samling parametre som foreslået af programmet strategi, som vil give:
      i. startposition af ω-rotationsakse
      ii. Svingning bredde af ω-akse rotation vinkel for hvert diffraktion billede
      iii. Eksponeringstid for hver diffraktion billede
      iv. Antallet af billeder til en komplet datasæt (indirekte definere den samlede ω-akse rotationsvinkel for hele dataindsamlingen)
      v. procentdel af dæmpning af X-ray stråle at undgå overeksponering og stråling skader
      NOTE: på vores institution, for kører indsamling af data, software rørledninger for edb-behandling af de indsamlede data er veletableret: (i) diffraktion data reduceres (indekseret, integreret og skaleret) af xia2-rørledningen, som genererer refleksion mtz filer for brugeren som input til udfasning og struktur løsning/raffinement 48. (ii) når en betydelig unormal signal registreres under dataanalyse, en første hurtige automatiserede struktur løsning rørledning (fast_ep) ved hjælp af SHELX forsøg på at løse den tunge atom underkonstruktion af eksperimentelle udfasning, giver en trinvis electron density kort hvor det er muligt. En anden mere omfattende struktur løsning pipeline automatisk forpligter sig til forsøg på at løse og bygge structure ved hjælp af uafhængige software suiter 49 , 50 , 51 , 52; i tilfælde, hvor dette er vellykket, vil brugeren blive forsynet med en indledende model og electron density kort. Dette giver grundlag for brugeren at udføre justering og validere model med de krystallografiske softwarepakker valg.

Representative Results

Denne integrerede protokol har vist sig for at være vellykket med fire (to offentliggjort og to ikke-offentliggjorte strukturer) seks kulhydrat bindende protein mål fra pneumokokker analyseret til dato32,53. I dette afsnit præsenterer vi den biokemiske og strukturel karakterisering af SP0092 som et repræsentativt resultat til at guide strukturelle studier af SBPs i almindelighed.

Når SBP'ET SP0092 har udtrykt og renset som defineret tidligere32, renset protein blev analyseret for buffer stabilitet ved hjælp af en termisk Skift assay: SP0092 udstiller en øget Tm ved pH 6,5 og i overværelse af NaCl i 0 - 0,2 M koncentrationsområde (figur 3A). I lyset heraf stødpudeopløsning for følgende trin blev defineret som: 0,02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glycerol, 0,5 mM TCEP. Absolut molar masse forskellige oligomerisering stater af SP0092 blev målt ved MALS koblet til SEC måler en molekylevægt på 187.2, 140.8, 97.0 og 49,4 kDa, svarende til tetramert, trimeric, dimerisk og monomere arter, henholdsvis () Figur 3B). Analysen af SEC profil på forskellige protein fortyndinger afslørede at oligomerisering udløses af øget proteinkoncentration, tyder på, at større oligomerer er mere stabile ved højere koncentrationer end normalt bruges i krystallisering. Faktisk, den renset større oligomere arter instrueret til at krystallisering forsøg, med succes produceret protein krystaller mens monomer arter ikke gjorde.

Optimeret krystaller opnået fra indfødte og Se-methionin mærket former af SP0092 var kendetegnet ved røntgen diffraktion. Måling af X-ray fluorescens fra disse krystaller afsløret i begge tilfælde emission toppe til Zn er bundet til proteinet, mens Se blev opdaget kun for Se-methionin krystaller som forventet. Senere, blev X-ray absorption scanninger i Se og Zn kanterne udført, som leveres direkte eksperimentelle data til at tune den hændelse X-ray bølgelængde til de respektive X-ray absorption kanter af enten Zn eller Se præsentere i krystaller til at maksimere den anomale signal rekvireres fra de resulterende data (figur 4A-B).

Efter måling tre diffraktion mønstre på lav transmission, blev en komplet anomale datasæt opnået ved hjælp af data indsamling strategi foreslået af EDNA (figur 4 c). Den anomale signal nuværende udløser den automatiske phasing pipeline på beamline til at bestemme sub-struktur, og baseret på de oprindelige eksperimenterende faser afledt, producerer indledende kort og modeller, som kan derefter raffineret og valideret (figur 4D ).

I Resumé, er potentielle faldgruber af teknikken centreret primært på crystal tilgængelighed og kvalitet. Optimering af buffer betingelser at forbedre protein stabilitet samt identifikation af den mest egnede oligomere tilstand af protein til at bruge, når mere end én oligomer er identificeret i løsning, kan reducere risikoen for fejl på krystalliseringen fase. At udnytte brugen af bundne metalioner identificeres på et tidligt stadium kan fremskynde struktur løsning og undgå unødvendige produktion af selenomethionin mærket protein når Molekylær udskiftning metoder mislykkes.

Figure 1
Figur 1. Diagram over arbejdsgangen for biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat SBPs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Krystal karakterisering i GDA. (A) Skærmhentningsbillede af fanen X-ray fluorescens kontrol af GDA beamline kontrol software. (B) Skærmhentningsbillede af fanen X-ray energy kant-scanning kontrol i GDA. (C) Skærmhentningsbillede af fanen data indsamling krystal screening i GDA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Biokemiske karakterisering af SP009239-491. (A) 3D-overflade graf plotte smeltepunktet af SP009239-491 som funktion af pH og NaCl koncentration stødpudeopløsning. (B) SEK og MALS resultater for SP009239-491. Absorption på 280 nm er vist med blåt. Kindtand masserne af de forskellige oligomerisering stater er vist med rødt. Panel (B) er blevet ændret fra32. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Strukturel karakterisering af SP009239-491. (A) og (B) X-ray absorption energi scanne på Zn og Se kanten for SP009239-491 krystaller. Den målte fluorescens fra Zn og Se indeholdende krystaller er vist i blå og cyan, den beregnede f' og f "unormale spredning fraktioner er i grøn og rød, henholdsvis. (C) eksempler på røntgen diffraktion mønstre indsamlet fra SP009239-491 krystaller. (D) tegneserie repræsentation af SP009239-491 dimer struktur. En protomer er farvet hvid og andre magenta (rester 39-366) og violet (rester 367-491), og de unormale spredning atomer er vist som blå og cyan bolde for Zn og Se, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

0,1 M citronsyre pH 4,0 0,1 M citronsyre pH 4.5 0,1 M fosfat pH 5,0 0,1 M citrat pH 5,5 0,1 M Bis-tris pH 6 0,1 M ADA pH 6,5 0,1 M MOPS pH 7 0,1 M HEPES pH 7,5 0,1 M imidazol pH 8.0 0,1 M Tris pH 8,5 0,1 M CHES pH 9 0,1 M CHES pH 9,5
NaCl 0 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL
40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,2 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,5 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL

Tabel 1. Buffer sammensætning for termisk Skift assay.

Discussion

I dette papir, vi beskriver og validere en integreret protokol til biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrater SBPs med særlig vægt på proteiner fra S. pneumoniae. Dette kan dog bruges som en standard procedure for analyse af andre SBPs fra forskellige organismer og endda andre uafhængige opløselige proteiner.

Den første del af protokollen er fokuseret på biokemiske oplysning om protein stabilitet og kvaternære struktur, som kan udnyttes i forberedelsen af protein prøver for krystallisering. I afsnittet termisk Skift assays beskriver vi kun pH og NaCl koncentration variationer at opretholde den generelle karakter af denne procedure. På trods af dette, mange andre buffer betingelser kan testes på en lignende måde, for eksempel, herunder eventuelle kemiske stof anvendes som en stabiliserende tilsætningsstof: navnlig de faktiske ligand(s), der binder sig til en bestemt SBP er bemærkelsesværdigt effektive i at øge Tm af et par grader Celsius31. I nogle tilfælde kan de denaturering kurver defineres dårligt på grund af lavt signal eller en høj fluorescens baggrund, som er forårsaget af protein sammenlægning eller delvis udfoldning. For at undgå dette, kan en protein: farvestof titrering udføres for at optimere de uklare denaturering kurver. Hvis nogen forbedringer er opnået, screening forskellige tilsætningsstoffer, der kan rette op på stabiliteten af proteinet anbefales, og egnede skærme har været tidligere beskrevet54.

Typisk, de fleste SBPs monomere i deres naturlige miljø, men som vist her multimerization kan forekomme ved de højere koncentrationer krystallisering forsøgsdyr, således oligomerisering adfærd karakterisering af MALS og SEC er vigtigt at vurdere de mest favorable stabil monodisperse oligomerisering tilstand for krystallisering. Det er dog svært at forudsige effekten af forskellige kemikalier medtaget i krystallisering betingelse på funktionen oligomerisering af proteiner. Hvis sek og MALS undersøgelsen viser omfattende sammenlægning af protein prøven, vil vi anbefale følgende for at reducere sandsynligheden for at dette sker: Brug friske protein prøve (ikke fryse-optøet) og udvide den stabilisering analyse udført med termisk Skift assays, test mulige tilsætningsstoffer og milde rengøringsmidler som en sidste ressource, at minimere sammenlægning. I dette papir præsenterer vi grundlæggende retningslinjer for krystallisering med høj overførselshastighed sparsomme matrix kommercielle krystallisering screening for at bevare den generelle karakter af denne protokol. Men, at opnå høj opløsning røntgen diffraktion protein krystaller muligvis, iterativ finjustering for at optimere krystallisering betingelser med hensyn til fældningsmiddel koncentration, pH, tilsætning af kemiske tilsætningsstoffer, forskellige temperaturer, og andre faktorer skiftende ligevægt dynamik mellem krystal dråbe og reservoir16,17.

Den anden del af protokollen beskriver karakterisering af protein krystaller for at definere den optimale strategi for røntgen diffraktion dataindsamling med særlig fokus på erhvervelse af anomale data for TRIST udfasning. Selvom SBPs bevare en lignende generel arkitektur (og der er mange deponerede 3D strukturer potentielt anvendelige som udgangspunkt modeller), udfasning af disse proteiner ved molekylært replacement-metoden er ikke altid ligetil, på grund af variabiliteten af de sekundær struktur elementer og den iboende fleksibilitet af disse proteiner. Dermed, vi foreslår metoden TRIST og fremhæve disse proteiner kan allerede have uløseligt bundet metaller eller endog ikke-specifik binding af metaller fra krystallisering buffer betingelser, som kan tilbyde et udvalg af anomale diffracting elementer som en standard skridt i vores generelle protokol.

Til sidst, definerer denne protokol en standard guidede arbejdsgang i procedurer, der muliggør en detaljeret beskrivelse af de biokemiske og strukturelle elementer i SBPs, der kan udnyttes til at øge succesraten struktur bestemmelse, samt fremskynde strukturel karakterisering af SBPs i almindelighed.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender OPPF-UK for bistand i kloning, Gemma Harris for SEK-INDKØBSCENTRE og forskere i beamlines I03 og I04 på Diamanten lyskilde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop - 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Tags

Biokemi spørgsmålet 128 ABC-transportører Streptococcus pneumoniae kulhydrat optagelse substrat-bindende protein termisk Skift assay multi vinkel lys spredning (MALS) størrelse udstødelse kromatografi (SEC) krystallografi X-ray diffraktion dataindsamling protein struktur løsning
Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D.… More

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter