Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/56294
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

Summary

En strømlinjeformet protokoll for å utføre en omfattende biokjemiske og strukturelle karakteristikk av et karbohydrat substrat bindende protein fra Streptococcus pneumoniae er presentert.

Abstract

Utvikling av nye poesi aksent og vaksiner for Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) er nødvendig for å stoppe den raske veksten i flere resistente bakteriestammer. Karbohydrater substrat bindende proteiner (SBPs) representerer levedyktig mål for utvikling av protein-basert vaccines og nye poesi aksent på grunn av deres ekstracellulære lokalisering og betydningen av karbohydrater import for pneumokokk stoffskiftet, henholdsvis. Beskrevet her er en rasjonelle eksponenten integrert protokoll å gjennomføre omfattende karakteristikk av SP0092, som kan utvides til andre karbohydrater SBPs fra pneumococcus og andre bakterier. Denne fremgangsmåten kan hjelpe struktur-baserte utformingen av hemmere for denne klassen av proteiner. Presentert i første del av dette manuskriptet er protokoller for biokjemiske analyse av termisk Skift analysen, multi vinkel lysspredning (MALS) og størrelse utelukkelse kromatografi (SEC), som optimalisere stabiliteten og homogenitet av prøven mot krystallisering prøvelser og så øke sannsynligheten for å lykkes. Den andre delen av denne prosedyren beskriver karakterisering av SBP krystallene bruker en tunable bølgelengde uregelrett Diffraksjon synchrotron beamline og dataene samling protokoller for måling data som kan brukes til å løse krystallisert protein struktur.

Introduction

S. pneumoniae (pneumokokker) er en gram-positive bakterie bosatt asymptomatically i øvre luftveiene menneskelige luftveiene med muligheten for å migrere til normalt sterilt nisjer forårsaker otitis, lungebetennelse, sepsis, septicemia, og hjernehinnebetennelse1,2. Videre er pneumokokk infeksjon den ledende årsaken til markedsstøtte ervervet lungebetennelse, som bidrar til en klinisk og økonomisk byrde verdensomspennende3,4. Antibiotika resistente stammer av S. pneumoniae har spredt over hele verden, og selv om en syv-valent og en tretten-valent pneumokokk protein konjugat vaksine har hjulpet redusere hastigheten på resistensutvikling, erstatning stammer fra vaksinen har dukket opp og har ført til økende behov for forskning i utviklingen av nye behandlingsmetoder for pneumokokksykdom5,6,7,8.

Pneumococcus avhenger av sukker importert fra verten som en karbon kilde9,10; faktisk vier det 30% av sin import maskiner til transport av 32 forskjellige karbohydrater11,12,13. Disse importører inkluderer minst åtte ABC-transportører13. I ABC transportører spiller de ekstracellulære SBPs en grunnleggende rolle i å bestemme spesifisiteten for ligand og presentere det integrert membran transporter for opptak i cellen. SBPs representerer gyldige mål for design av nye vaksiner og poesi aksent fordi de er overflaten proteiner og deres avgjørende rolle i cellulære prosesser.

Målet protein karakterisering og detaljert beskrivelse av strukturelle funksjoner, for eksempel ligand lommer og interdomain fleksibilitet, gir et nyttig verktøy for struktur-baserte narkotika design14,15. Røntgenkrystallografi er metoden for valg for strukturelle karakterisering av proteiner i nærheten atomic oppløsning, men krystallisering prosessen er uforutsigbar, tidkrevende og ikke alltid heldig. Systematisk metoder har forbedret suksessraten viktige faktorer er eksempel kvalitet og stabilitet. Suksessrate på krystallisering påvirkes av protein kjemiske egenskaper og prøve forberedelse metodikk. Effekten av dette kan vurderes og informert av biokjemiske karakterisering16,17.

En mer komplikasjon for struktur-basert design er krystallografisk fase problemet, som må adresseres. Som flere proteinstrukturer har blitt tilgjengelig, kan mange strukturer løses av molekylære erstatning metoden, som krever en homologe struktur18. Som SBPs presenterer en fleksibel domenestruktur, kan molekylær erstatning også være utfordrende19. Hvis en strukturell modell tilstrekkelig lik målet protein ikke er tilgjengelig, kan en rekke teknikker brukes til å få den eksperimentelle innfasing20. Blant disse metoden Single-bølgelengde uregelrett spredning (SAD) har dukket opp som den primære teknikken og har vært mye brukt til å løse fase problemet21. Bruk av metoden trist har vært mer avanserte med forbedringer i maskinvare og programvare, i tillegg til dataene samling strategier for å tillate oppdaging og bruk av svake uregelrett signaler for innfasing22,23, 24. videre fremskritt i direkte metoder for løse strukturer av makromolekyler, som tidligere krevde Diffraksjon data å Atom løsning, kan nå benyttes ved å kombinere for eksempel stereokjemiske kunnskap som gjennomføres i programmet ARCIMOLDO25. En nyttig gjennomgang av metoder for å løse fase problemet i krystallografi er gitt av Taylor26.

Her presenterer vi en rasjonelle eksponenten protokoll for karakterisering av karbohydrater transport SBP, SP0092 av S. pneumoniae, integrere biokjemiske og strukturelle teknikker (figur 1). Denne trinnvise protokollen gir en nyttig eksempel test av strategier for å forbedre suksessrate på strukturelle studier på SBPs, som finnes i alle kongedømmene i livet. Spesielt protokollen fremhever betydningen av karakteriserer den mest stabile oligomeric delstaten proteinet i løsningen på en rask og effektiv metode, og tillater identifisering av de beste artene oppfølging for krystallisering eksperimenter. Selv om det over 500 SBP strukturer i Protein databank27, kan molekylær erstatning være utfordrende på grunn av iboende fleksibel natur de to α/β domenene, som er forbundet med en hengsel regionen19. Dermed, den andre delen av protokollen beskriver med metoden trist for innfasing fra bundet metall ioner, som er vanlig i SBPs, samt inkorporering av selenomethionine og bruk av selen (Se) i trist fase.

Protocol

Merk: koding sekvensen som signal peptid slettes er klonet i pOPINF vektoren etter en standard i-fusion-protokoll, innfødt protein uttrykkes som en hans-tag fusjon i Escherichia coli BL21 Rosetta celler 28 , 29. selenomethionine merket variant uttrykkes etter standardmetoder ifølge produsenten 30. Rekombinant SBP er renset som tidligere beskrevet 31 , 32.

1. biokjemiske karakterisering

  1. termisk skifte analysen
    1. forberede 48 buffer løsninger med pH fra 4.0 til 9.5 og NaCl konsentrasjon fra 0 til 0,5 M og dispensere 40 µL i en 96-brønns plate som beskrevet i Tabell 1 33.
    2. legge til hver vel 5 µL av SBP løsning på 1-2 mg/mL konsentrasjonen.
    3. Legge til hver vel 5 µL av 20 x fluorescerende flekken for proteiner (se Tabell av materialer).
    4. Blande løsninger av pipettering forsegle platen ved hjelp av et transparent lim filmen og spinne i 2 minutter på 112 x g ved romtemperatur.
    5. Kjøre forsøket på en sanntid maskin: sette en temperatur rampe på 3 ° C/min fra 4 99 ° c med en 10 s hold tid, og lese fluorescensen hver 0,5 ° C med eksitasjon på 483 nm og utslipp på 568 nm.
    6. Analysere fluorescens utslipp kurver for hver buffer tilstand, identifisere Smeltetemperaturen (T m) som minst deriverte.
      Merk: Denne prosedyren gir en god indikasjon på den beste buffer løsningen å hjelpe i forbedring av protein stabilitet. Velg pH området og saltkonsentrasjon basert på betingelsen buffer med høyeste T m og Legg til 2,5% (v/v) til glyserol og 0,5 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) å definere buffer løsning for følgende (SEC-buffer).
  2. MALS og analytisk sek
    1. utføre en tokolonners volum vask av pre-pakket gel filtrering kolonnen med degassed filtrert vann (bruk en rekke molekylvekt 24 mL kolonne).
    2. Koble kolonnen til lysspredning detektoren og equilibrate kolonnen med bestemt SEC-bufferen fra termisk Skift analysen.
    3. Injisere 100 µL av renset SBP på 5 mg/mL i equilibrated SEC kolonne og flyt én kolonne volum av SEC-buffer.
    4. Sjekk tilsettes chromatogram for én eller flere topper og undersøke spredning dataene ved hjelp av analyseprogramvare, molar massen og polydispersity indeksen for alle arter.
      Merk: For hver topp tilsvarer en oligomeric arter, er det nyttig å sjekk polydispersity indeks beregnet som molar masse vektet masse/molar masse vektet antallet molekyler (Mw/Mn). En polydispersity verdi nær 1 angir en monodispersed peak.
      Merk: Når alle oligomerization arter er definert, er det nyttig å studere sin avhengighet av protein konsentrasjon, som høyere konsentrasjoner kan favorisere større oligomer formasjonen.
    5. Kjøre flere analytiske SEC kjører, injisere 100 µL av renset SBP på økende konsentrasjoner (0.1 - 10 mg/mL) i kolonnen equilibrated gel filtrering (bruk en rekke molekylvekt 5 mL kolonne) og flyte en kolonne volumet av SEC-buffer hver gang.
    6. Når tilsettes chromatogram for én eller flere topper og analysere absorbansen intensiteten på 280 nm av kurver tilsvarer ulike Start protein konsentrasjoner. Hvis relative intensiteten av de forskjellige toppene forblir konstant, finnes det ingen mellom konvertering mellom oligomeric arter. Variasjon i relative intensiteten i ulike konsentrasjoner er en indikasjon på interconversion mellom ulike oligomeric arter som er avhengige av protein konsentrasjonen.
      Merk: Dette karakterisering trinnet er grunnleggende for å definere hvilke arter er mer egnet for krystallisering. Faktisk distinkte monodispersed arter er flere liggende å utkrystallisere hvis de er i en stabil oligomeric tilstand i en definert konsentrasjon.

2. Protein forberedelse og krystallisering

  1. skytevåpen sek
    1. etter en Enkolonners volum vask med degassed filtrert vann, equilibrate med SEC-buffer kolonnen for skytevåpen pre-pakket gel-filtrering (en rekke molekylær vekt 120 mL kolonnen).
    2. Injisere 1-5 mL renset SBP på 5-50 mg/mL i equilibrated gel filtrering kolonne og flyt én kolonne volumet av SEC-buffer.
    3. Samle den kolonnen gjennomflytsenhet i 1 mL fraksjoner.
    4. Pool fraksjoner svarer til en enkelt monodisperse topp, spinne eksemplet i 15 mL sentrifugering filtre på 1500 g og kvantifisere konsentrasjonen til ønsket konsentrasjonen er oppnådd (vanligvis 50-100 mg/mL for SP0092).
  2. Krystallisering
    1. finne optimal konsentrasjon området for krystallisering eksperimentere med pre krystallisering Test som beskrevet av produsenten:
      1. Dispense 0,5 - 1,0 mL av hver av de fire krystallisering testen løsninger i et annet reservoar av en 24-og sittende slippe krystallisering plate.
      2. Forberede krystallisering dråper ved å blande 1 µL av protein løsning med 1 µL av reservoaret løsning, forsegle platen og ruge ved romtemperatur for ikke mindre enn 1 h (mer pålitelige resultater er oppnådd etter overnatting inkubasjon).
      3. Sjekk miste kvaliteten for hver konsentrasjon bruke 10 x forstørrelse mikroskop.
        Merk: Prøv minst tre forskjellige protein konsentrasjon: (I) de fleste av dråper igjen klart indikerer at protein er også fortynne for krystallisering; (II) tilstedeværelsen av tunge utløse i fleste dråper innebærer en svært høy konsentrasjon. og (III) en balansert forekomsten av både klart drops og utløse (bedre hvis lys) er en god indikasjon på at testet konsentrasjonen er gunstig for krystallisering.
    2. Forberede 96-brønns sittende drop krystallisering plater, dispensere 100 µL av ulike kommersielle krystallisering løsning i hver reservoaret vel 34 , 35 , 36 , 37.
    3. dispensere 100 nL av protein prøve på tidligere definerte konsentrasjonen (trinn 1.1.6) i alle krystallisering slipp brønnene bruker a robotic systemet er krystallisering.
    4. Dispensere 100 nL av ulike reservoaret løsninger til tilsvarende krystallisering slippe brønner å blande med protein utlevert i trinn 2.2.3. Forsegle krystallisering platen for å unngå fordampning og aktivere balanse av krystallisering slippe med reservoaret.
    5. Sjekk dråper regelmessig (utgangspunktet hver 1-2 dager, senere hver uke) med 10 x (minst) forstørrelsen microscope evaluere dannelse av krystaller og vekst.
      Merk: Telefonsvareren tenkelig protein krystallisering kan benyttes drops visualisering og fange.
< p class = "jove_title "> 3. Crystal karakterisering og X-ray datainnsamling

  1. krystall montering
    1. forberede kryoprotektant løsningen ved å legge til 25% (v/v) glyserol (siste konsentrasjon) krystallisering betingelsen (dermed erstatte 25% av vann i første blanding) 38.
    2. Fylle et skum dewar med flytende nitrogen og Legg eksempel kapslingen delen av en uni-pucken inn dewar. La den avkjøles til flytende nitrogen temperatur.
    3. Klippe og fjern tetting tape fra krystallisering platen over det miste der krystallene dannes.
    4. Plasser en dråpe 1 µL kryoprotektant løsning på en coverslide plassert i nærheten av målet drop.
    5. Overføre valgte krystall fra det opprinnelige miste til kryoprotektant løsning drop med en nylon cryo-løkke på RYGGRADEN standard base montert på en magnetisk wand 39 , 40.
    6. Raskt overføre krystall fra rullegardinlisten kryoprotektant til flytende nitrogen, plassere loopen i den første tomme posisjonen av uni-pucken eksempel holderen.
    7. Gjenta (fra tetting tape kuttet trinn) til alle ønskede krystallene er høstet og lagret i uni-pucken eksempel innehaveren.
    8. Sted uni-pucken basere på uni-pucken med pucken tryllestaven og ta pucken til beamline (under flytende nitrogen forhold).
      Advarsel: Ekstremt lav temperatur!
    9. Bruke cryo-tang og pucken dewar lasting verktøy laste uni-puck(s) inn i beamline eksempel veksler roboten dewar. Uni-pucken eksempel abonnenten vil løsne fra base lokket forlate prøve loop innehaverne oppreist i prøve-robot dewar og dermed utsatt for flytende nitrogen og tilgjengelig for eksempel veksler roboten.
  2. Krystall karakterisering
    Merk: høstes krystaller kan deretter bli vist for Diffraksjon kvalitet benytter enten en laboratorium X-ray kilde eller på en synchrotron (SR) X-ray strålingskilder. Macromolecular krystallografi (MX) beamlines gir en tunable energikilde utnytte uregelrett Diffraksjon struktur løsning. Nedenfor, en rekke arbeider instruksjoner i tråd med eksperimentelle funksjonene av Diamond Light kilde MX beamlines er foreslått, men disse retningslinjene kan også tilpasses MX beamlines på andre synchrotrons over hele verden.
    1. Som et første skritt, er det nyttig å bekrefte eller identifisere uregelrett scatterers i krystallklart. Dette kan oppnås beleilig ved å måle en X-ray fluorescens spekteret fra krystall. Først kontrollere X-ray energien i beamline ligger høyt nok å opphisse alle elementene vanligvis forventet for macromolecular krystaller (14 keV eller høyere).
    2. Bruk av beamline programvare for å velge prøven å monteres utvalg skifter roboten; loopen midtstilles automatisk i røntgenbilde stråle og krystall midtstillingen kan bekreftes manuelt ved hjelp av beamline kontroll programvare.
    3. Registrere en X-ray fluorescens spektrum programmvre beamline kontroll: brukeren velger en eksponeringstid og starter måling (fluorescens/fluorescens spektrum innstillingen → kjører, figur 2A). Beamline Kontrollprogramvaren plasserer automatisk X-ray fluorescens detektor i sted og bestemmer minimum hendelsen X-ray flux å få et lesbart signal på fluorescens detektoren. Ervervet spekteret er deretter analysert i et automatisert mote med utslipp topper montert til naturlig forekommende biologiske. Disse rutinene er tilgjengelige innenfor beamline kontroll programvare grafiske brukergrensesnittet (GUI) - GDA (www.opengda.org) ved vårt selskap og synchrotrons over hele Europa 41 , 42.
    4. Hvis egnet elementene identifiseres som kan utnyttes for et unormalt Diffraksjon eksperiment, utføre en X-ray absorpsjon kanten energi skanning for å bestemme optimale bølgelengde for samling av unormalt Diffraksjon data fra krystallen: på beamline styre programvare, merker du elementet og starte skanningen (fluorescens/fluorescens skanne innstillingen, → Atom navn, → kjører, figur 2B).
      Merk: For en enkelt uregelrett Diffraksjon eksperiment, toppen av absorpsjon kanten til å maksimere uregelrett spredning. Eksperimentell vurderinger for å utføre en multi bølgelengde uregelrett Diffraksjon eksperiment har vært tidligere detaljert 43.
    5. å bestemme krystall enheten cellen parametere, symmetri og Diffraksjon grense, måle tre X-ray Diffraksjon mønstre på 45° intervaller med metoden oscillasjonen (Data Collection/Screening → kjøre gjeldende, Figur 2C). Kontrollprogramvaren beamline gir brukeren et valg oscillation vinkel og eksponeringstid og muligheten til å angi prosentandelen sendingen av røntgenbilde stråle. For en standard krystall screening anbefales en svingning vinkel på 0,5 °, en eksponeringstid på 0,5 s, og 5% røntgenbilde stråle overføring. Målt Diffraksjon bildene analyseres automatisk av EDNA rørledningen og få strategier for samling av en komplett datasett 22.
  3. X-ray datainnsamling
    Merk: brukeren kan velge å samle inn data standard oscillation eller omvendt strålen modus, som lar Friedel kameratene skal registreres nær i tid og X-ray dose, og med omtrent samme absorpsjon virkemåte gir en mer nøyaktig måling av unormalt forskjeller. Sistnevnte er nyttig særlig hvis små uregelrett forskjeller er forventet og/eller prøvene er stråling følsom når et unormalt Diffraksjon eksperiment. Hensyn på beste data samling strategies bruke har vært grundig gjennomgått 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47.
    1. ved hjelp av beamline kontroll programvare, importere dataene samling parametre som foreslått av programmet strategi som vil gi:
      i. ω-rotasjonsakse startposisjon
      ii. Svingning bredden av ω-aksen rotasjon vinkel for hvert Diffraksjon bilde
      iii. Eksponeringstid for hvert Diffraksjon bilde
      iv. Antall bilder for et komplett dataset (indirekte definere totale ω-aksen rotasjonsvinkelen for hele datainnsamling)
      v. andelen demping av røntgenbilde stråle å unngå over-eksponering og stråling skader
      Merk: på våre institusjonen, for kjører datainnsamling, programvare rørledningene for automatisert behandling av de innsamlede dataene er veletablert: (i) Diffraksjon data reduseres (indeksert, integrert og skalert) av rørledningen xia2 som genererer refleksjon mtz filer for brukeren som inndata for innfasing og struktur løsning/raffinement 48. (ii) når et betydelig uregelrett signal er oppdaget under dataanalyse, en første rask automatisert struktur løsning rørledning (fast_ep) bruker SHELX prøver å oppklare tunge atom underkonstruksjonen av eksperimentelle fase, og gir en gradvis elektron tetthet kart der det er mulig. En andre mer omfattende struktur løsning rørledning automatisk forplikter seg forsøk på å løse og bygge structure bruker uavhengig programvare suites 49 , 50 , 51 , 52; i tilfeller der dette er vellykket, gis brukeren med en første modell og electron tetthet kart. Dette gir grunnlaget for brukeren å fullføre raffinement og godkjenne modellen med krystallografisk programvarepakkene valgfrihet.

Representative Results

Denne integrerte protokollen har vist seg for å være vellykket med fire (to publisert og to upubliserte strukturer) seks karbohydrater bindende protein mål fra pneumokokker analysert hittil32,53. I denne delen presenterer vi biokjemiske og strukturelle karakterisering av SP0092 som et representativt resultat å veilede strukturelle studier av SBPs generelt.

Etter SBP-SP0092 er uttrykt og renset som definert tidligere32, renset protein ble analysert for bufferen stabilitet med en termisk Skift analysen: SP0092 viser en økt Tm ved pH 6,5 og i nærvær av NaCl i 0 - 0,2 M konsentrasjon utvalg (figur 3A). I lys av dette, buffer løsning for følgende ble definert som: 0.02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glyserol, 0,5 mM TCEP. Absolutt molar masse forskjellige oligomerization statene SP0092 ble målt ved MALS kombinert til SEC måle en molekylvekt av 187.2, 140.8, 97.0 og 49,4 kDa, tilsvarer tetramerisk, trimeric, dimeric og monomerisk Art, henholdsvis ( Figur 3B). Analyse av SEC profilen ved annet protein fortynninger avslørt at oligomerization utløses av økt protein konsentrasjon, antyder at større oligomers er mer stabil på høyere konsentrasjoner enn vanligvis brukes i krystallisering. Faktisk renset større oligomeric arter rettet mot krystallisering forsøk, ble produsert protein krystaller mens monomer arter ikke.

Optimalisert krystaller fra innfødte og Se-metionin merket former for SP0092 var preget av X-ray Diffraksjon. Måling av X-ray fluorescens fra disse krystallene avslørte i begge tilfeller utslipp topper for Zn bindes til protein, mens Se ble oppdaget bare for Se-metionin krystaller som forventet. Senere ble X-ray absorpsjon skanner på Se og Zn kantene utført, som gitt direkte eksperimentelle data for å stille hendelsen X-ray bølgelengden til respektive X-ray absorpsjon kantene av enten Zn eller Se presentere i krystaller å maksimere uregelrett signalet skaffes fra resulterende dataene (figur 4A-B).

Etter måling tre Diffraksjon mønstre på lave overføring, ble et komplett uregelrett datasett oppnådd ved hjelp av data samling strategien foreslått av EDNA (figur 4C). Uregelrett signalet stede utløsere automatisert innfasing rørledningen på beamline å finne den sub strukturen og basert på de første eksperimentelle fasene avledet, produserer første kart og modeller, som deretter kan være raffinert og godkjent (Figur 4 d ).

Oppsummert er potensialet fallgrubene teknikken sentrert på crystal tilgjengelighet og kvalitet. Optimalisering av buffer forhold å forbedre protein stabilitet samt identifikasjon av egnede oligomeric protein bruke, når flere oligomer identifiseres i løsning, kan redusere risikoen for feil på krystallisering scenen. Utnytte bruk av bundne metall ioner identifisert på et tidlig stadium kan fremskynde struktur løsning og unngå unødvendig produksjon av selenomethionine merket protein når molekylær erstatning metoder mislykkes.

Figure 1
Figur 1. Diagrammet av arbeidsflyten for biokjemisk og strukturelle karakteristikk av karbohydrater SBPs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Crystal karakteristikk i GDA. (A) skjermbilde av kategorien X-ray fluorescens control for den GDA beamline programvaren. (B) skjermbilde av kategorien X-ray energi kanten-scan kontroll i GDA. (C) skjermbilde av kategorien data samling krystall screening i GDA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Biokjemiske karakterisering av SP009239-491. (A) 3D-overflate graf plotting Smeltetemperaturen for SP009239-491 som en funksjon av pH og NaCl konsentrasjon av buffer løsning. (B) SEC og MALS resultater for SP009239-491. Absorpsjon på 280 nm vises i blått. Molar massene av de ulike oligomerization vises i rødt. Panelet (B) er endret fra32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Strukturelle karakterisering av SP009239-491. (A) og (B) X-ray absorpsjon energi skanne i Zn og Se kanten til SP009239-491 krystaller. Den målte fluorescensen fra Zn og Se som inneholder krystaller vises i blått og cyan, beregnet f' og f "uregelrett spredning fraksjoner er i grønne og røde, henholdsvis. (C) eksempler på X-ray Diffraksjon mønstre samlet fra SP009239-491 krystaller. (D) tegneserie representasjon av SP009239-491 dimer strukturen. En protomer er farget hvit og andre magenta (rester 39-366) og violet (rester 367-491), og unormalt spredning atomene vises som blå og cyan baller for Zn og Se, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

0.1 M sitronsyre pH 4.0 0.1 M sitronsyre pH 4.5 0.1 M fosfat pH 5.0 0.1 M Citrate pH 5.5 0.1 M Bis-tris pH 6 0.1 M ADA pH 6,5 0.1 M MOPPER pH 7 0.1 M HEPES pH 7.5 0.1 M Imidazole pH 8.0 0.1 M Tris pH 8.5 0.1 M oppgaver pH 9 0.1 M oppgaver pH 9,5
NaCl 0 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL
40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,2 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,5 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL

Tabell 1. Bufferen komposisjon for termisk Skift analysen.

Discussion

I dette papiret, vi beskriver og validere en integrert protokoll for biokjemisk og strukturelle karakteristikk av karbohydrater SBPs med en bestemt vekt på proteiner fra S. pneumoniae. Imidlertid kan dette brukes som en standard prosedyre for analyse av andre SBPs fra ulike organismer og selv andre urelaterte løselig proteiner.

Den første delen av protokollen er fokusert på å gi biokjemiske informasjon om protein stabilitet og kvartær struktur, som kan utnyttes i utarbeidelsen av protein prøver for krystallisering. Termisk Skift analyser delen beskriver vi bare pH og NaCl konsentrasjon varianter å opprettholde formuleringene i denne fremgangsmåten. Til tross for dette, mange andre buffer forhold kan testes i en lignende måte, for eksempel inkludert enhver kjemisk forbindelse brukes som et stabiliserende additiv: spesielt de faktiske ligand(s) som binder seg til en bestemt SBP er effektive i å øke Tm med et par grader31. I noen tilfeller kan denaturing kurvene være dårlig definert på grunn av lav signalstyrke eller en høy fluorescens bakgrunn, som er forårsaket av protein aggregasjon eller delvis unfolding. For å unngå dette, kan en protein: fargestoff titrering utføres for å optimalisere uklart denaturing kurvene. Hvis ingen bedring er oppnådd, screening ulike tilsetningsstoffer som kan forbedre stabiliteten av proteinet anbefales og egnet skjermene har vært beskrevet tidligere54.

Vanligvis de fleste SBPs er monomerisk i sitt naturlige miljø, men som vist her multimerization kan oppstå på de høyere konsentrasjonene krystallisering forsøk, dermed oligomerization virkemåte karakteristikk MALS og sek er viktig å vurdere mest gunstige stabil monodisperse oligomerization for krystallisering. Likevel er det vanskelig å forutsi effekten av ulike kjemikalier i krystallisering tilstanden på oligomerization oppførselen til proteiner. Hvis SEC og MALS eksamen viser omfattende samling av protein prøven, vil vi anbefale følgende for å redusere sannsynligheten for dette oppstår: bruke fersk protein utvalg (ikke fryse-tint) og utvide stabilisering analyse utført med termisk Skift analyser, testing mulig tilsetningsstoffer og milde vaskemidler som en siste ressurs, minimere aggregering. I dette papiret presenterer vi grunnleggende retningslinjer for krystallisering med høy gjennomstrømming spredt matrise kommersielle krystallisering screening for å opprettholde formuleringene i denne protokollen. Få høyoppløselige X-ray Diffraksjon protein krystaller kan imidlertid iterativ finjustering for å optimalisere krystallisering betingelser med hensyn til precipitant konsentrasjon, pH, tillegg av kjemiske tilsetningsstoffer, forskjellige temperaturer, og andre faktorer endrede likevekt dynamikken mellom de krystall dråpe og reservoaret16,17.

Den andre delen av protokollen beskriver karakterisering av protein krystaller for å definere den optimale strategien for X-ray Diffraksjon datainnsamling med spesielt fokus på oppkjøp av avvikende data for trist innfasing. Selv om SBPs opprettholde en lignende generelle arkitektur (og det er mange avsatt 3D strukturer potensielt brukes som starter modeller), innfasing av disse proteinene av molekylære erstatning metoden er ikke alltid enkelt fordi variasjon av den sekundær elementer og iboende fleksibiliteten av disse proteinene. Derfor vi foreslår metoden trist og markere at disse proteinene kan allerede ha uløselig forbundet metaller eller faktisk uspesifikk binding av metaller fra krystallisering buffer forhold, som kan gi en rekke anomale diffracting elementer som en standard trinn i vår generelle protokollen.

Avslutningsvis definerer denne protokollen en standard guidede arbeidsflyt prosedyrer muliggjør detaljert beskrivelse av funksjonene biokjemiske og strukturelle av SBPs som kan utnyttes for å øke suksessraten struktur besluttsomhet, i tillegg til å akselerere strukturelle karakterisering av SBPs generelt.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner OPPF-UK hjelp med kloning, Gemma Harris for SEC-KJØPESENTRE og forskere i beamlines I03 og I04 på Diamond lyskilde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop - 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Tags

Biokjemi problemet 128 ABC transportører Streptococcus pneumoniae karbohydrater opptak substrat bindende protein termisk Skift analysen multi vinkel lys spredning (MALS) størrelse utelukkelse kromatografi (SEC) krystallografi røntgen Diffraksjon datainnsamling protein struktur løsning
Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D.… More

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter