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Biochemistry

जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/56294
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

Summary

स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया से एक कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट बाइंडिंग प्रोटीन के एक व्यापक जैव रासायनिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के प्रदर्शन के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है ।

Abstract

नई रोगाणुरोधी और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (न्यूमोकोकल) के लिए टीके के विकास के लिए कई प्रतिरोधी उपभेदों में तेजी से वृद्धि को रोकने के लिए आवश्यक हैं । कार्बोहाइड्रेट सब्सट्रेट बाइंडिंग प्रोटीन्स (SBPs) उनके extracellular स्थानीयकरण और pneumococcal चयापचय के लिए कार्बोहाइड्रेट आयात की केंद्रीयता के कारण प्रोटीन आधारित टीकों और नए रोगाणुरोधी के विकास के लिए व्यवहार्य लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमश. यहां वर्णित एक तर्कसंगत एकीकृत करने के लिए बाहर SP0092, जो न्यूमोकोकल और अंय बैक्टीरिया से अंय कार्बोहाइड्रेट SBPs के लिए बढ़ाया जा सकता है की एक व्यापक लक्षण वर्णन ले प्रोटोकॉल है । इस प्रक्रिया के प्रोटीन के इस वर्ग के लिए अवरोधकों के ढांचे आधारित डिजाइन सहायता कर सकते हैं । इस पांडुलिपि के पहले भाग में प्रस्तुत थर्मल शिफ्ट परख, बहु कोण प्रकाश कैटरिंग (मलों), और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), जो की स्थिरता और नमूना निर्देशित की एकरूपता का अनुकूलन द्वारा जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल है क्रिस्टलीकरण परीक्षण और इसलिए सफलता की संभावना को बढ़ाने के । इस प्रक्रिया का दूसरा भाग एक स्वरित्र तरंग दैर्ध्य विषम विवर्तन सिंक्रोट्रॉन beamline का उपयोग कर एसबीपी क्रिस्टल के लक्षण वर्णन है, और डेटा है कि सघन प्रोटीन को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मापने के लिए डेटा संग्रह प्रोटोकॉल संरचना.

Introduction

S. निमोनिया (न्यूमोकोकल) एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु है जो सामान्य रूप से बाँझ niches पैदा करने की क्षमता के साथ मानव श्वसन तंत्र के ऊपरी वायुमार्ग में स्पर्शोन्मुख रहने वाले, मध्यकर्णशोथ, निमोनिया, पूति, गलाघोंटू, और दिमागी बुखार1,2। इसके अलावा, pneumococcal संक्रमण समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया का प्रमुख कारण है, जो दुनिया भर में एक नैदानिक और आर्थिक बोझ के लिए योगदान दे रहा है3,4. एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों के एस निमोनिया दुनिया भर में फैल गया है और हालांकि एक सात valent और एक तेरह valent pneumococcal प्रोटीन संयुग्म वैक्सीन रोगाणुरोधी प्रतिरोध की दर को कम करने में मदद मिली है, प्रतिस्थापन उपभेदों से वैक्सीन का उपयोग करें और उभरा है pneumococcal रोग के लिए नए उपचार के विकास में अनुसंधान के लिए वृद्धि की मांग के लिए नेतृत्व किया है5,6,7,8।

न्यूमोकोकल एक कार्बन स्रोत9,10के रूप में मेजबान से आयातित शर्करा पर निर्भर करता है; वास्तव में यह ३२ अलग कार्बोहाइड्रेट11,12,13के परिवहन के लिए अपनी आयात मशीनरी के 30% भक्त । इन आयातकों में सबसे कम आठ एबीसी-ट्रांसपोर्टर्स13शामिल हैं । एबीसी ट्रांसपोर्टरों में, extracellular SBPs ligand के लिए विशिष्टता का निर्धारण करने में एक मौलिक भूमिका निभाते है और यह कोशिका में ऊपर उठाने के लिए अभिंन झिल्ली ट्रांसपोर्टर को पेश । SBPs नए टीकों और रोगाणुरोधी के डिजाइन के लिए वैध लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते है क्योंकि वे सतह प्रोटीन और सेलुलर प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका कर रहे हैं ।

लक्ष्य प्रोटीन लक्षण वर्णन और संरचनात्मक सुविधाओं का विस्तृत विवरण, जैसे ligand जेब और डोमेन लचीलापन, संरचना के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं आधारित दवा डिजाइन14,15. एक्स-रे क्रि के पास परमाणु संकल्प के पास पर प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए पसंद की विधि है, लेकिन क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया अप्रत्याशित, समय लेने वाली है, और हमेशा सफल नहीं है । व्यवस्थित तरीके सफलता दर में सुधार हुआ है और महत्वपूर्ण कारकों नमूना गुणवत्ता और स्थिरता रहे हैं । क्रिस्टलीकरण की सफलता दर प्रोटीन रासायनिक गुण और नमूना तैयारी पद्धति से प्रभावित है । इन के प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन16,17द्वारा सूचित ।

संरचना आधारित डिजाइन के लिए एक और जटिलता crystallographic चरण समस्या है, जो संबोधित किया जाना चाहिए है । के रूप में अधिक प्रोटीन संरचनाओं उपलब्ध हो गए हैं, कई संरचनाओं आणविक प्रतिस्थापन विधि द्वारा हल किया जा सकता है, जो एक मुताबिक़ संरचना18की आवश्यकता है । के रूप में SBPs एक लचीला डोमेन संरचना वर्तमान, आणविक प्रतिस्थापन भी19चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है । यदि एक संरचनात्मक मॉडल है कि पर्याप्त लक्ष्य प्रोटीन के समान है उपलब्ध नहीं है, तकनीक के एक नंबर के लिए प्रायोगिक20चरणबद्ध प्राप्त किया जा सकता है । इन के अलावा, एकल तरंग दैर्ध्य विषम फैलाव (उदास) विधि प्राथमिक तकनीक के रूप में उभरा है और बड़े पैमाने पर किया गया है चरण समस्या21को हल करने के लिए उपयोग । दुखद विधि का उपयोग आगे हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में सुधार के साथ उंनत किया गया है, साथ ही साथ डेटा संग्रह रणनीतियों का पता लगाने और22,23चरणबद्ध के लिए कमजोर विषम संकेतों के उपयोग की अनुमति, 24. इसके अलावा, अणुओं की संरचनाओं को सुलझाने के लिए प्रत्यक्ष तरीकों में अग्रिम, जो परमाणु संकल्प के लिए पिछले आवश्यक विवर्तन डेटा में, अब उदाहरण के लिए, stereochemical ज्ञान के रूप में कार्यक्रम में कार्यांवित के संयोजन द्वारा उपयोग किया जा सकता ARCIMOLDO25. क्रि में चरण समस्या को हल करने के लिए तरीकों की एक उपयोगी समीक्षा टेलर द्वारा दिया जाता है26.

यहाँ हम कार्बोहाइड्रेट परिवहन एसबीपी के लक्षण वर्णन के लिए एक तर्कसंगत प्रोटोकॉल पेश करते हैं, एस. निमोनियाके SP0092, जैव रासायनिक और संरचनात्मक तकनीक को एकीकृत (चित्रा 1). यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल रणनीति के एक उपयोगी उदाहरण परीक्षण के मामले को सामांय में SBPs पर संरचनात्मक अध्ययन की सफलता की दर में सुधार प्रदान करता है, जो जीवन के सभी राज्यों में पाए जाते हैं । विशेष रूप से, प्रोटोकॉल समाधान में एक तेज और प्रभावी विधि में प्रोटीन के सबसे स्थिर oligomeric राज्य निस्र्पक के महत्व पर प्रकाश डाला गया, और सबसे अच्छा प्रजातियों की पहचान करने के लिए क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए अनुवर्ती की अनुमति देता है । हालांकि वहां ५०० एसबीपी संरचनाएं प्रोटीन डेटा बैंक27में रिपोर्ट पर हैं, आणविक प्रतिस्थापन दो α के अंतर्निहित लचीला प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है/β डोमेन, जो एक काज क्षेत्र19से जुड़े हुए हैं । इस प्रकार, प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के लिए बाध्य धातु आयनों, जो SBPs में आम है से चरणबद्ध के लिए दुखद तरीका का उपयोग कर वर्णन करता है, साथ ही साथ selenomethionine के शामिल करने और सेलेनियम का उपयोग (एसई) उदास चरणबद्ध में ।

Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: कोडिंग अनुक्रम जो के लिए संकेत पेप्टाइड हटा दिया जाता है pOPINF वेक्टर में एक मानक में-फ्यूजन प्रोटोकॉल के बाद क्लोन है; देशी प्रोटीन ई कोलाई BL21 Rosetta कोशिकाओं में एक अपने-टैग संलयन के रूप में व्यक्त की है < सुप वर्ग = "xref" > २८ , < सुप वर्ग = "xref" > २९ . selenomethionine लेबल वाला वैरिएंट मानक तरीकों के अनुसार व्यक्त किया है निर्माता < सुप वर्ग = "xref" > ३० . संयोजक एसबीपी पहले वर्णित के रूप में शुद्ध है < सुप class = "xref" > 31 , < सुप class = "xref" > 32 .

< p class = "jove_title" > 1. जैव रासायनिक लक्षण

  1. थर्मल शिफ्ट परख
    1. एक पीएच के साथ ४८ बफर समाधान तैयार ४.० से ९.५ और NaCl एकाग्रता 0 से ०.५ मीटर, और वितरण ४० & #181; एल में एक ९६-well थाली में वर्णित के रूप में तालिका 1 < सुप वर्ग = "xref" > ३३ .
    2. Add a well 5 & #181; L के एसबीपी समाधान पर 1-2 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता.
    3. Add with येक well 5 & #181; L के 20x & #160; प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट दाग ( सामग्री की मेज देखें) ।
    4. मिश्रण pipetting द्वारा समाधान, प्लेट एक पारदर्शी चिपकने वाली फिल्म का उपयोग कर सील, और 2 मिनट के लिए स्पिन कमरे के तापमान पर ११२ x g पर ।
    5. एक रीयल-टाइम मशीन पर प्रयोग चलाते हैं: 3 & #176 का तापमान रैंप सेट करें; c/4 से ९९ & #176; सी के साथ 10 एस पकड़ समय, और प्रतिदीप्ति हर ०.५ & #176; सी पर उत्तेजना के साथ ४८३ एनएम और उत्सर्जन में ५६८ एनएम पर पढ़ें ।
    6. हर बफर हालत के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन घटता विश्लेषण, पिघलने तापमान की पहचान (टी एम ) व्युत्पंन के ंयूनतम के रूप में ।
      नोट: यह प्रक्रिया प्रोटीन स्थिरता के सुधार में सहायता करने के लिए सबसे अच्छा बफर समाधान का एक अच्छा संकेत देता है । चुनें पीएच रेंज और नमक एकाग्रता उच्चतम टी एम के साथ बफर शर्त पर आधारित है और जोड़ें २.५% (वी/वी) के ग्लिसरॉल और ०.५ मिमी के tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) के लिए बफर समाधान परिभाषित करने के लिए निंन चरणों (SEC-बफर) ।
  2. मलों और विश्लेषणात्मक सेक
    1. degassed फ़िल्टर्ड पानी के साथ पूर्व पैक जेल निस्पंदन कॉलम के एक दो कॉलम मात्रा धोने प्रदर्शन (एक विस्तृत रेंज आणविक वजन 24 एमएल कॉलम का उपयोग करें) ।
    2. प्रकाश बिखरने डिटेक्टर करने के लिए कॉलम कनेक्ट और थर्मल शिफ्ट परख से निर्धारित सेकंड बफर के साथ कॉलम equilibrate ।
    3. इंजेक्षन १०० & #181; शुद्ध एसबीपी के एल में 5 मिलीग्राम/एमएल equilibrated सेकंड कॉलम में और प्रवाह सेकंड के एक कॉलम मात्रा बफर ।
    4. एक या एकाधिक चोटियों के लिए रेफरेंस वर्णलेख की जाँच करें और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कैटरिंग डेटा की जांच, दाढ़ मास और सभी प्रजातियों के लिए polydispersity सूचकांक प्राप्त करने.
      नोट: हर चोटी एक oligomeric प्रजातियों के लिए इसी के लिए, यह polydispersity द्रव्यमान पर भारित दाढ़ जन के रूप में की गणना सूचकांक की जांच करने के लिए फायदेमंद है/दाढ़ जन पर भारित अणुओं की संख्या (मेगावाट/ एक polydispersity मान 1 के करीब एक monodispersed पीक इंगित करता है ।
      नोट: एक बार सभी oligomerization प्रजातियों परिभाषित कर रहे हैं, यह प्रोटीन एकाग्रता पर अपनी निर्भरता का अध्ययन उपयोगी है, के रूप में उच्च सांद्रता बड़ा oligomer गठन एहसान हो सकता है ।
    5. निष्पादन एकाधिक विश्लेषणात्मक सेकंड चलाता है; इंजेक्षन १०० & #181; शुद्ध एसबीपी के एल equilibrated जेल निस्पंदन कॉलम में बढ़ती सांद्रता (०.१-10 मिलीग्राम/एमएल) में (एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करें आणविक वजन 5 मिलीलीटर कॉलम) और प्रवाह सेकंड के एक कॉलम मात्रा-बफर हर बार ।
    6. एक या कई चोटियों के लिए रेफरेंस वर्णलेख की जांच करें और अलग शुरू प्रोटीन सांद्रता के लिए इसी curves के २८० एनएम में अवशोषक तीव्रता का विश्लेषण । यदि विभिंन चोटियों के सापेक्ष तीव्रता स्थिर रहते हैं, तो कोई अंतर oligomeric प्रजातियों के बीच रूपांतरण मौजूद है । विभिंन सांद्रता में सापेक्ष तीव्रता में भिंनता विभिंन oligomeric प्रजातियों कि प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर है के बीच परस्पर विनिमय का एक संकेत है ।
      नोट: इस लक्षणात्मक कदम जो प्रजातियों क्रिस्टलीकरण के लिए और अधिक उपयुक्त है परिभाषित करने के लिए मौलिक है । वास्तव में, अलग monodispersed प्रजातियों अधिक सघन अगर वे एक स्थिर oligomeric राज्य में एक परिभाषित एकाग्रता पर कर रहे है प्रवण हैं ।
< p class = "jove_title" > 2. प्रोटीन तैयारी और क्रिस्टलीकरण

  1. Preparative sec
    1. एक एक कॉलम मात्रा degassed फ़िल्टर्ड पानी के साथ धोने के बाद, सेकंड के साथ equilibrate-बफर Preparative पूर्व पैक जेल निस्पंदन कॉलम (एक विस्तृत रेंज आणविक वजन १२० एमएल column).
    2. equilibrated जेल निस्पंदन कॉलम में 5-50 मिलीग्राम/एमएल में शुद्ध एसबीपी के 1-5 मिलीलीटर सुई और धारा के एक कॉलम मात्रा बफर प्रवाह ।
    3. स्तंभ प्रवाह-के माध्यम से 1 मिलीलीटर अंशों में इकट्ठा ।
    4. पूल एक एकल monodisperse चोटी के लिए इसी भिन्न; १,५०० g पर 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक फिल्टर में नमूना स्पिन और वांछित एकाग्रता जब तक एकाग्रता को बढ़ाता है (आमतौर पर ५०-१०० मिलीग्राम/SP0092 के लिए).
  2. क्रिस्टलीकरण
    1. क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए इष्टतम एकाग्रता रेंज निर्धारित पूर्व का उपयोग कर के रूप में क्रिस्टलीकरण परीक्षण निर्माता द्वारा वर्णित:
      1. औषधालय ०.५-चार क्रिस्टलीय परीक्षण के प्रत्येक के १.० मिलीलीटर समाधान एक 24-अच्छी तरह से बैठे छोड़ क्रिस्टलीकरण प्लेट के एक अलग जलाशय में ।
      2. 1 & #181 मिश्रण से क्रिस्टलीकरण बूंदें तैयार करें; l 1 & #181 के साथ प्रोटीन समाधान की एल; जलाशय समाधान के एल, प्लेट सील, और कोई कम से 1 ज (अधिक विश्वसनीय परिणाम के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी रात भर के बाद प्राप्त कर रहे हैं).
      3. एक 10x & #160 का उपयोग कर प्रत्येक एकाग्रता के लिए ड्रॉप गुणवत्ता की जांच; आवर्धन माइक्रोस्कोप.
        ध्यान दें: परीक्षण कम तीन अलग प्रोटीन एकाग्रता: (I) शेष बूंदों का सबसे स्पष्ट संकेत मिलता है कि प्रोटीन भी क्रिस्टलीकरण के लिए पतला है; (II) बूंदों के बहुमत में भारी हाला की उपस्थिति एक जरूरत से ज्यादा उच्च एकाग्रता का तात्पर्य है; और (III) दोनों स्पष्ट बूंदें और हाला की एक संतुलित घटना (यदि प्रकाश बेहतर) एक अच्छा संकेत है कि परीक्षण एकाग्रता क्रिस्टलीकरण के लिए अनुकूल है ।
    2. तैयार ९६-अच्छी तरह से बैठे छोड़ क्रिस्टलीकरण प्लेटें; औषधालय १०० & #181; प्रत्येक जलाशय में अलग वाणिज्यिक सघन समाधान के एल अच्छी तरह से < सुप वर्ग = "xref" > ३४ , < सुप वर्ग = "xref" > ३५ , < सुप वर्ग = "xref" > ३६ , < सुप वर्ग = "xref" > ३७ .
    3. औषधालय १०० nL एक क्रिस्टलीकरण रोबोट प्रणाली का उपयोग सभी क्रिस्टलीकरण ड्रॉप कुओं में पहले से परिभाषित एकाग्रता (कदम 1.1.6) में प्रोटीन का नमूना ।
    4. औषधालय १०० nL अलग जलाशय समाधान के इसी क्रिस्टलीकरण ड्रॉप वेल्स के लिए कदम 2.2.3 में तिरस्कृत प्रोटीन के साथ मिश्रण करने के लिए । वाष्पीकरण से बचने के लिए क्रिस्टलीकरण प्लेट को सील करें और जलाशय के साथ क्रिस्टलीकरण ड्रॉप की equilibration को सक्षम.
    5. की जाँच करें (शुरू में हर 1-2 दिन, बाद में हर हफ्ते) एक 10x & #160 का उपयोग कर कम से;() आवर्धन माइक्रोस्कोप का मूल्यांकन करने के लिए क्रिस्टल गठन और विकास.
      नोट: प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली बूंदों दृश्य और कैप्चरिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title "> 3. क्रिस्टल लक्षण वर्णन और एक्स-रे डेटा संग्रह

  1. क्रिस्टल बढ़ते
    1. (वी/वी) cryoprotectant के 25% जोड़कर ग्लिसरॉल समाधान तैयार (अंतिम एकाग्रता) के क्रिस्टलीकरण हालत (इस प्रकार प्रारंभिक में पानी की 25% की जगह मिश्रण) < सुप वर्ग = "xref" > ३८ .
    2. तरल नाइट्रोजन के साथ एक फोम देवर भरें और देवर में एक विश्वविद्यालय के नमूना बाड़े भाग जगह । यह तरल नाइट्रोजन तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें ।
    3. कट और ड्रॉप जहां क्रिस्टल का गठन कर रहे है पर क्रिस्टलीकरण प्लेट से सील टेप निकालें ।
    4. जगह 1 & #181 की एक बूंद; cryoprotectant समाधान के एल पर एक coverslide लक्ष्य ड्रॉप के करीब निकटता में तैनात ।
    5. cryoprotectant समाधान ड्रॉप करने के लिए मूल ड्रॉप से चयनित क्रिस्टल स्थानांतरण एक रीढ़ मानक आधार पर एक नायलॉन क्रायो-पाश का उपयोग कर एक चुंबकीय छड़ी पर चढ़कर < सुप वर्ग = "xref" > ३९ , < सुप वर्ग = "xref" > ४० .
    6. जल्दी क्रिस्टल cryoprotectant ड्रॉप से तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण, विश्वविद्यालय के पहले खाली स्थिति में पाश रखकर-पक नमूना धारक.
    7. दोहराने (सील टेप कटौती कदम से) जब तक सभी वांछित क्रिस्टल काटा और विश्वविद्यालय में संग्रहित कर रहे है-पक नमूना धारक ।
    8. जगह उनी-पक आधार पर-पक छड़ी का उपयोग कर और beamline (तरल नाइट्रोजन शर्तों के तहत) के लिए पक लो ।
      सावधानी: अत्यंत कम तापमान!
    9. क्रायो-चिमटे और पक देवर लोडिंग उपकरण का उपयोग करने के लिए beamline नमूना परिवर्तक रोबोट देवर में विश्वविद्यालय-पक (ओं) लोड । विश्वविद्यालय के पक नमूना धारक नमूना पाश धारकों नमूने रोबोट देवर में ईमानदार छोड़ आधार ढक्कन से अलग है और इस तरह तरल नाइट्रोजन के संपर्क में है और नमूना परिवर्तक रोबोट के लिए सुलभ होगा ।
  2. क्रिस्टल लक्षण वर्णन
    नोट: काटा क्रिस्टल तो विवर्तन या तो एक प्रयोगशाला एक्स-रे स्रोत या एक सिंक्रोट्रॉन विकिरण (एसआर) एक्स-रे स्रोत का उपयोग कर गुणवत्ता के लिए जांच की जा सकती है । Macromolecular क्रि (MX) beamlines संरचना समाधान के लिए विषम विवर्तन का दोहन करने के लिए एक स्वरित्र ऊर्जा स्रोत प्रदान करते हैं । निम्नलिखित अनुभाग में, डायमंड लाइट सोर्स एमएक्स beamlines की प्रायोगिक क्षमताओं के साथ कतार में कार्य निर्देशों की एक श्रृंखला प्रस्तावित है, लेकिन इन दिशानिर्देशों को दुनिया भर में अन्य synchrotrons पर MX beamlines के अनुकूल भी किया जा सकता है ।
    1. पहले कदम के रूप में, यह या तो पुष्टि या क्रिस्टल में विषम कैटरर्स की पहचान करने के लिए उपयोगी है । यह आसानी से क्रिस्टल से एक एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । पहले beamline की एक्स-रे ऊर्जा सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त उच्च macromolecular क्रिस्टल (14 कीव या उच्चतर) के लिए अपेक्षित सभी तत्वों को उत्तेजित करने के लिए काफी सेट है ।
    2. नमूना परिवर्तक रोबोट द्वारा घुड़सवार होने के लिए नमूना का चयन करने के लिए beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें; पाश & #160; स्वचालित रूप से एक्स-रे बीम में केंद्रित हो जाएगा और क्रिस्टल सेंटरिंग मैन्युअल रूप से पुष्टि की जा सकती है & #160; beamline कंट्रोल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
    3. रिकॉर्ड एक एक्स-रे प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम का उपयोग कर beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर: उपयोगकर्ता एक जोखिम समय का चयन करता है और माप (प्रतिदीप्ति/प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम सेटिंग, & #8594; भागो, < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ) शुरू होता है । beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से जगह में एक्स-रे प्रतिदीप्ति डिटेक्टर पदों और ंयूनतम घटना एक्स-रे फ्लक्स प्रतिदीप्ति डिटेक्टर पर एक पठनीय संकेत प्राप्त करने के लिए निर्धारित करता है । अधिग्रहण स्पेक्ट्रम तो स्वाभाविक रूप से होने वाली जैविक तत्वों के लिए सज्जित उत्सर्जन चोटियों के साथ एक स्वचालित फैशन में विश्लेषण किया जाता है । इन दिनचर्या में उपलब्ध है beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI)-बीडीए (www.opengda.org) हमारी कंपनी में और यूरोप भर में synchrotrons < सुप वर्ग = "xref" > ४१ , < सुप वर्ग = "xref" > ४२ .
    4. यदि उपयुक्त तत्वों की पहचान कर रहे है कि एक विषम विवर्तन प्रयोग के लिए शोषण किया जा सकता है, एक एक्स-रे अवशोषण एज ऊर्जा स्कैन करने के लिए क्रिस्टल से विषम विवर्तन डेटा के संग्रह के लिए इष्टतम तरंग दैर्ध्य का निर्धारण: beamline पर नियंत्रण सॉफ्टवेयर, तत्व का चयन करें और स्कैन शुरू (प्रतिदीप्ति/प्रतिदीप्ति स्कैन सेटिंग, & #8594; एटम नाम, & #8594; रन, < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ).
      नोट: एक एकल विषम विवर्तन प्रयोग के लिए, अवशोषण एज के शिखर के लिए विषम तितर बितर को अधिकतम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक बहु-तरंग दैर्ध्य विषम विवर्तन प्रयोग करने के लिए प्रयोगात्मक विचार पहले विस्तृत किया गया है < सुप वर्ग = "xref" > ४३ .
    5. क्रिस्टल इकाई कक्ष पैरामीटर्स, समरूपता, और विवर्तन सीमा निर्धारित करने के लिए, ४५ & #176 पर तीन X-ray विवर्तन प्रतिमानों को मापने के लिए, दोलन विधि का उपयोग करते हुए अंतराल (डेटा संग्रह/स्क्रीनिंग & #160; & #8594; रन वर्तमान, < सबल वर्ग = "xfig" > चित्र 2c ) । beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर दोलन कोण और जोखिम समय के एक विकल्प के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करता है, और एक्स-रे बीम के प्रतिशत संचरण निर्धारित करने की क्षमता । एक मानक क्रिस्टल स्क्रीनिंग के लिए, ०.५ के एक दोलन कोण & #176;, ०.५ s के एक जोखिम समय, और 5% एक्स-रे बीम संचरण की सिफारिश कर रहे हैं. मापा विवर्तन छवियों स्वचालित रूप से एडना पाइपलाइन द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं और एक पूरा डेटा सेट के संग्रह के लिए रणनीतियों का एक सेट वापस < सुप वर्ग = "xref" > २२ .
  3. x-ray आंकडा संग्रह
    नोट: उपयोगकर्ता मानक दोलन मोड या व्युत्क्रम बीम मोड में डेटा एकत्रित करने के लिए चुन सकते हैं, जो Friedel साथियों को समय और एक्स-रे खुराक में करीब दर्ज किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है, और लगभग एक ही अवशोषण व्यवहार के साथ विषम मतभेदों के एक अधिक सटीक माप की अनुमति । बाद में विशेष रूप से उपयोगी है अगर छोटे विषम मतभेदों की उंमीद कर रहे है और/या नमूने विकिरण संवेदनशील जब बाहर एक विषम विवर्तन प्रयोग ले रहे हैं । उपयोग करने के लिए श्रेष्ठ डेटा संग्रह कार्यनीतियों पर विचार व्यापक रूप से समीक्षा की गई < सुप class = "xref" > 22 , < सुप class = "xref" > 23 , < सुप class = "xref" > 44 , < सुप class = "xref" > 45 , < सुप वर्ग = "xref" > ४६ , < सुप वर्ग = "xref" > ४७ .
    1. beamline नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, डेटा संग्रह मापदंडों के रूप में रणनीति कार्यक्रम जो प्रदान करेगा द्वारा सुझाए गए आयात:
      i. & #969 की स्थिति प्रारंभ करें;-घुमाव अक्ष
      ii. दोलन की चौड़ाई & #969;-प्रत्येक विवर्तन छवि
      iii के लिए अक्ष रोटेशन कोण । प्रत्येक विवर्तन छवि
      चतुर्थ के लिए जोखिम समय । पूर्ण डेटासेट के लिए छवियों की संख्या (अप्रत्यक्ष रूप से परिभाषित कुल & #969;-पूरे डेटा संग्रह के लिए अक्ष रोटेशन कोण)
      v. एक्स-रे बीम के क्षीणन का प्रतिशत से अधिक जोखिम और विकिरण क्षति से बचने के लिए
      नोट: हमारे संस्थान में, के लिए डेटा संग्रह चल रहा है, एकत्र डेटा के स्वचालित प्रसंस्करण के लिए सॉफ्टवेयर पाइपलाइनों अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं: (i) विवर्तन डेटा xia2 पाइपलाइन द्वारा कम (अनुक्रमित, एकीकृत, और स्केल्ड) कर रहे हैं, जो प्रतिबिंब mtz फ़ाइलों के लिए उपयोगकर्ता जनरेट करता है चरणबद्ध और संरचना समाधान के लिए इनपुट के रूप में/शोधन < सुप वर्ग = "xref" > ४८ . (ii) जब डेटा विश्लेषण के दौरान एक महत्वपूर्ण विषम संकेत का पता चलता है, तो प्रायोगिक चरणबद्ध रूप से भारी एटम उपसंरचना को हल करने के लिए SHELX प्रयासों का उपयोग करते हुए एक प्रथम द्रुत स्वचालित संरचना समाधान पाइपलाइन (fast_ep), चरणबद्ध इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र प्रदान करना जहां संभव हो । एक दूसरे और अधिक व्यापक संरचना समाधान पाइपलाइन स्वचालित रूप से हल और structu के निर्माण के प्रयास करता हैस्वतंत्र सॉफ़्टवेयर सुइट्स का उपयोग कर पुन: < सुप वर्ग = "xref" > ४९ , < सुप क्लास = "xref" > ५० , < सुप क्लास = "xref" > ५१ , < सुप क्लास = "xref" > ५२ ; मामलों में जहां यह सफल होता है, उपयोगकर्ता एक प्रारंभिक मॉडल और इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे के साथ प्रदान किया जाएगा । इस उपयोगकर्ता काे पूरा करने के लिए और पसंद के crystallographic सॉफ्टवेयर suites के साथ मॉडल को मांय करने के लिए आधार प्रदान करता है ।

Representative Results

इस एकीकृत प्रोटोकॉल चार के साथ सफल साबित किया गया है (दो प्रकाशित और दो अप्रकाशित संरचनाओं) न्यूमोकोकल से छह कार्बोहाइड्रेट बाध्यकारी प्रोटीन लक्ष्य के लिए दिनांक३२,५३विश्लेषण किया । इस खंड में, हम जैव रासायनिक और एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए सामांय में SBPs के संरचनात्मक अध्ययन गाइड प्रस्तुत करते हैं ।

के बाद एसबीपी SP0092 व्यक्त किया गया है और पहले के रूप में परिभाषित शुद्ध३२, शुद्ध प्रोटीन बफर स्थिरता के लिए विश्लेषण किया गया था एक थर्मल शिफ्ट परख का उपयोग: SP0092 प्रदर्शित एक पीएच ६.५ में वृद्धि हुई टीएम और NaCl की उपस्थिति में 0 में-०.२ m एकाग्रता रेंज (चित्र 3ए) । इस के प्रकाश में, निम्न चरणों के लिए बफ़र समाधान के रूप में परिभाषित किया गया था: ०.०२ एम एमईएस पीएच ६.५, ०.२ मीटर NaCl, २.५% (वी/वी) ग्लिसरॉल, ०.५ मिमी TCEP. SP0092 के विभिंन oligomerization राज्यों के निरपेक्ष दाढ़ जन को १८७.२, १४०.८, ९७.०, और ४९.४ केडीए, tetrameric, trimeric, dimeric, और monomeric प्रजातियों के लिए इसी के एक आणविक भार को मापने एसईसी को युग्मित द्वारा मापा गया था, क्रमशः ( चित्र बी) । विभिंन प्रोटीन कमजोर पड़ने पर एसईसी प्रोफ़ाइल के विश्लेषण से पता चला कि oligomerization वृद्धि हुई प्रोटीन एकाग्रता से शुरू होता है, सुझाव है कि बड़े oligomers में आम तौर पर इस्तेमाल की तुलना में उच्च सांद्रता पर अधिक स्थिर है क्रिस्टलीकरण. वास्तव में, व्यापक oligomeric प्रजातियों क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के लिए निर्देशित, सफलतापूर्वक प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन किया, जबकि मोनोमर प्रजातियों नहीं था ।

SP0092 के मूल और एसई-मिथीयोनाईन लेबल रूपों से प्राप्त अनुकूलित क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन द्वारा विशेषता थे । इन क्रिस्टल से एक्स-रे प्रतिदीप्ति का मापन दोनों मामलों में पता चला Zn के लिए उत्सर्जन चोटियों प्रोटीन के लिए बाध्य किया जा रहा है, जबकि एसई केवल एसई-मिथीयोनाईन क्रिस्टल के लिए उंमीद के रूप में पाया गया था । बाद में, एक्स-रे अवशोषण एसई और Zn किनारों पर स्कैन किया गया है, जो प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करने के लिए घटना एक्स-रे तरंग दैर्ध्य संबंधित एक्स-रे अवशोषण के किनारों के लिए या तो क्रिस्टल में Zn या एसई वर्तमान को अधिकतम करने के लिए विषम संकेत परिणामी डेटा (चित्र 4a-B) से प्राप्य ।

कम संचरण पर तीन विवर्तन पैटर्न को मापने के बाद, एक पूर्ण विषम डेटा सेट एडना (चित्र 4c) द्वारा सुझाए गए डेटा संग्रह कार्यनीति का उपयोग करके प्राप्त किया गया था. विषम संकेत वर्तमान beamline में स्वचालित चरणबद्ध पाइप लाइन से चलाता है उप संरचना का निर्धारण, और प्रारंभिक प्रयोगात्मक चरणों के आधार पर व्युत्पंन, प्रारंभिक नक्शे और मॉडल है, जो फिर परिष्कृत और मांय किया जा सकता है का उत्पादन (चित्रा 4d ).

संक्षेप में, तकनीक के संभावित नुकसान मुख्य रूप से क्रिस्टल की उपलब्धता और गुणवत्ता पर केंद्रित कर रहे हैं । बफर की स्थिति का अनुकूलन प्रोटीन स्थिरता में सुधार के साथ ही प्रोटीन का सबसे उपयुक्त oligomeric राज्य की पहचान के लिए उपयोग करते हैं, जब एक से अधिक oligomer समाधान में पहचान की है, क्रिस्टलीकरण में असफलता के जोखिम को कम कर सकते है मंच. एक प्रारंभिक चरण में की पहचान की बाध्य धातु आयनों के उपयोग का शोषण संरचना समाधान की गति और selenomethionine के अनावश्यक उत्पादन से बचने कर सकते हैं जब आणविक प्रतिस्थापन तरीकों असफल प्रोटीन लेबल.

Figure 1
चित्र 1. जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट SBPs के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए कार्यप्रवाह का आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. जीडीए में क्रिस्टल लक्षण वर्णन। (क) जीडीए beamline कंट्रोल सॉफ्टवेयर के एक्स-रे प्रतिदीप्ति कंट्रोल टैब का स्क्रीनशॉट । (ख) जीडीए में एक्स-रे एनर्जी एज-स्कैन कंट्रोल टैब का स्क्रीनशॉट । (C) जीडीए में डाटा कलेक्शन क्रिस्टल स्क्रीनिंग टैब का स्क्रीनशॉट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. SP009239-491के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन । (A) 3 डी-सतह ग्राफ SP009239-491 के पिघलने के तापमान की साजिश रच पीएच के एक समारोह और NaCl बफर समाधान के एकाग्रता के रूप में । (ख) सेक और SP009239-491के लए मलों के नतीजे. २८० एनएम में अवशोषण नीले रंग में दिखाया गया है । विभिन्न oligomerization राज्यों की दाढ़ जनता लाल रंग में दिखाई जाती हैं । पैनल (बी) को३२से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. SP009239-491के संरचनात्मक लक्षण वर्णन । (क) और (ख) एक्स-रे अवशोषण ऊर्जा SP009239-491 क्रिस्टल के लिए Zn और एसई एज में स्कैन । Zn और क्रिस्टल युक्त से मापा प्रतिदीप्ति नीले और सियान में दिखाया गया है, गणना एफ ' और एफ "विषम तितर बितर अंश क्रमशः हरे और लाल रंग में हैं । (ग) एक्स-रे विवर्तन SP009239-491 क्रिस्टल से एकत्र पैटर्न के उदाहरण । (घ) SP009239-491 डिमर संरचना का कार्टून निरूपण. एक तोमर सफेद रंग का है और अंय रानी (अवशेषों ३९-३६६) और बैंगनी (अवशेषों ३६७-४९१), और विषम तितर बितर परमाणुओं Zn और एसई, क्रमशः के लिए नीले और सियान गेंदों के रूप में दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

०.१ एम साइट्रिक एसिड पीएच ४.० ०.१ एम साइट्रिक एसिड पीएच ४.५ ०.१ एम फॉस्फेट पीएच ५.० ०.१ M साइट्रेट पीएच ५.५ ०.१ M भा-tris पीएच 6 ०.१ मीटर एडीए पीएच ६.५ ०.१ एम MOPS नं० 7 ०.१ मीटर HEPES पीएच ७.५ ०.१ मीटर Imidazole पीएच ८.० ०.१ मीटर Tris पीएच ८.५ ०.१ एम केएस पीएच 9 ०.१ एम केएस पीएच ९.५
NaCl 0 M ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL
४० μL ४० μL ४० μL NaCl ०.१ मीटर ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL NaCl ०.२ मीटर ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL NaCl ०.५ मीटर ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL ४० μL

तालिका 1. थर्मल शिफ्ट परख के लिए बफर संरचना ।

Discussion

इस पत्र में, हम एस. निमोनियासे प्रोटीन पर एक विशेष बल के साथ कार्बोहाइड्रेट SBPs के जैव रासायनिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन और सत्यापन करते हैं । फिर भी, यह विभिंन जीवों और यहां तक कि अंय असंबंधित घुलनशील प्रोटीन से अंय SBPs के विश्लेषण के लिए एक मानक प्रक्रिया के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल का पहला हिस्सा प्रोटीन स्थिरता और चतुर्धातुक संरचना पर जैव रासायनिक जानकारी प्रदान करने पर केंद्रित है, जो क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन के नमूनों की तैयारी में शोषण किया जा सकता है । थर्मल शिफ्ट परख अनुभाग में, हम केवल पीएच और NaCl एकाग्रता विविधताओं का वर्णन करने के लिए इस प्रक्रिया की सामांय प्रकृति को बनाए रखने । इस के बावजूद, कई अंय बफर शर्तों एक समान तरीके से परीक्षण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, किसी भी रासायनिक एक स्थिर additive के रूप में इस्तेमाल किया यौगिक सहित: विशेष रूप से वास्तविक ligand (ओं) है कि एक विशिष्ट एसबीपी के लिए बांध में उल्लेखनीय है टी बढ़ाने में कारगरएम कुछ डिग्री सेल्सियस31तक । कुछ मामलों में, denaturing घटता खराब कम संकेत या एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि, जो प्रोटीन एकत्रीकरण या आंशिक खुलासा के कारण होता है के कारण परिभाषित किया जा सकता है । इस से बचने के लिए, एक प्रोटीन: डाई अनुमापन अस्पष्ट denaturing घटता का अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । यदि कोई सुधार प्राप्त किया है, विभिंन additives कि प्रोटीन की स्थिरता उंनति कर सकते है स्क्रीनिंग की सलाह दी है, और उपयुक्त स्क्रीन पहले५४बताया गया है ।

आमतौर पर, सबसे SBPs अपने प्राकृतिक वातावरण में monomeric हैं, लेकिन जैसा कि यहां दिखाया multimerization उच्च क्रिस्टलीकरण प्रयोगों में इस्तेमाल किया सांद्रता पर हो सकता है, इस प्रकार oligomerization व्यवहार लक्षण मलों और एसईसी द्वारा प्रदान की जाती है सघन के लिए सबसे अनुकूल स्थिर monodisperse oligomerization राज्य का आकलन करना आवश्यक है. फिर भी, यह प्रोटीन के oligomerization व्यवहार पर क्रिस्टलीकरण हालत में शामिल विभिन्न रसायनों के प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए कठिन है । यदि SEC और मलों की परीक्षा प्रोटीन नमूने के व्यापक एकत्रीकरण से पता चलता है, हम इस होने की संभावना को कम करने के लिए निम्नलिखित सलाह देंगे: ताजा प्रोटीन नमूने का उपयोग करें (फ्रीज-गल नहीं) और थर्मल के साथ प्रदर्शन स्थिरीकरण विश्लेषण का विस्तार बदलाव परख, एक अंतिम संसाधन के रूप में संभव additives और हल्के डिटर्जेंट परीक्षण, एकत्रीकरण को कम करने के लिए । इस पत्र में, हम उच्च प्रवाह विरल मैट्रिक्स वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल की सामांय प्रकृति को बनाए रखने के लिए क्रिस्टलीकरण के लिए बुनियादी दिशानिर्देश पेश करते हैं । हालांकि, उच्च संकल्प एक्स-रे विवर्तन प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए precipitant एकाग्रता, पीएच, रासायनिक additives, अलग तापमान के अलावा के संबंध में क्रिस्टलीकरण की स्थिति का अनुकूलन ट्यूनिंग ठीक चलने की आवश्यकता हो सकती है, और अन्य कारकों क्रिस्टल ड्रॉप और जलाशय16,17के बीच संतुलन गतिशीलता बदल रहा है ।

प्रोटोकॉल के दूसरे भाग के क्रम में प्रोटीन क्रिस्टल के लक्षण वर्णन के लिए एक्स के लिए इष्टतम रणनीति को परिभाषित करने के लिए उदास चरणबद्ध के लिए विषम डेटा के अधिग्रहण पर एक विशेष ध्यान केंद्रित के साथ रे विवर्तन डेटा संग्रह । यहां तक कि अगर SBPs एक समान सामांय वास्तुकला बनाए रखने (और वहां कई जमा 3 डी संभावित मॉडल शुरू करने के रूप में प्रयोग करने योग्य संरचनाओं रहे हैं), आणविक प्रतिस्थापन विधि द्वारा इन प्रोटीन के चरणबद्ध हमेशा की परिवर्तनशीलता की वजह से सीधा नहीं है माध्यमिक संरचना तत्वों और इन प्रोटीन के आंतरिक लचीलापन । इसलिए, हम दुखद तरीका है और प्रकाश डाला है कि इन प्रोटीन पहले से ही आंतरिक रूप से धातु या वास्तव में गैर क्रिस्टलीकरण बफर शर्तों, जो एक के रूप में विषम diffracting तत्वों की एक सीमा प्रदान कर सकते है से धातुओं के विशिष्ट बाध्यकारी हो सकता है प्रस्ताव हमारे सामांय प्रोटोकॉल में मानक कदम ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल SBPs है कि संरचना निर्धारण सफलता दर बढ़ाने के लिए शोषण किया जा सकता है की जैव रासायनिक और संरचनात्मक सुविधाओं का विस्तृत विवरण को सक्षम करने प्रक्रियाओं के एक मानक निर्देशित कार्यप्रवाह परिभाषित करता है, साथ ही तेजी लाने सामांय में SBPs के संरचनात्मक लक्षण वर्णन ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम क्लोनिंग में सहायता के लिए OPPF-ब्रिटेन स्वीकार करते हैं, कली हैरिस सेकंड के लिए-मॉल और beamlines I03 और डायमंड लाइट स्रोत पर I04 के वैज्ञानिकों ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop - 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.

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References

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

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जैव रसायन १२८ अंक एबीसी ट्रांसपोर्टरों स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया कार्बोहाइड्रेट के साथ सब्सट्रेट बाइंडिंग प्रोटीन थर्मल शिफ्ट परख बहु कोण प्रकाश कैटरिंग (मलों) आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) क्रि एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह प्रोटीन संरचना समाधान
जैव रासायनिक और कार्बोहाइड्रेट परिवहन सब्सट्रेट-बाध्यकारी-प्रोटीन SP0092 के संरचनात्मक लक्षण वर्णन
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Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D.… More

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).

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