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Biochemistry

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/56294
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

Summary

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Abstract

Desarrollo de nuevos antimicrobianos y vacunas para el Streptococcus pneumoniae (neumococo) son necesarios para frenar el rápido aumento de cepas resistentes a múltiples. Proteínas de unión de sustrato de carbohidratos (SBPs) representan objetivos viables para el desarrollo de nuevos antimicrobianos y vacunas basados en proteínas debido a su localización extracelular y la centralidad de la importación de carbohidratos para el metabolismo del respectivamente. Se describe aquí es un protocolo integrado racionalizado para llevar a cabo una caracterización completa de SP0092, que puede ampliarse a otros carbohidratos SBPs de los neumococos y otras bacterias. Este procedimiento puede ayudar el diseño basado en la estructura de los inhibidores para esta clase de proteínas. Presentado en la primera parte de este manuscrito son protocolos para el análisis bioquímico mediante ensayo de cambio térmico, multi ángulo de dispersión de la luz (MALS) y tamaño de cromatografía de exclusión (SEC), que optimizan la estabilidad y homogeneidad de la muestra dirigida a ensayos de cristalización y así aumentar la probabilidad de éxito. La segunda parte de este procedimiento describe la caracterización de los cristales SBP utilizando una línea de longitud de onda sintonizable difracción anómala sincrotrón y protocolos de recogida de datos para datos de medición que pueden utilizarse para resolver la proteína cristalizada estructura.

Introduction

S. pneumoniae (neumococo) es una bacteria gram-positiva que residen asintomáticamente en las vías aéreas superiores de las vías respiratorias humanas con la capacidad de migrar a lugares normalmente estériles que causa neumonía, sepsis, otitis, septicemia, y meningitis1,2. Por otra parte, la infección neumocócica es la principal causa de neumonía adquirida en la comunidad, que contribuye a una carga clínica y económica en todo el mundo3,4. Las cepas antibiótico resistentes de S. pneumoniae se han extendido en todo el mundo y aunque una 7-Valente y una trece proteínas antineumocócica vacuna conjugada han ayudado a reducen la tasa de resistencia a los antimicrobianos, las cepas de reemplazo de uso de la vacuna han surgido y han conducido a las demandas crecientes para la investigación en el desarrollo de nuevos tratamientos para la enfermedad neumocócica5,6,7,8.

El neumococo depende de azúcares procedentes de la hostia como una fuente de carbono9,10; de hecho dedica el 30% de su maquinaria de importación para el transporte de 32 diferentes carbohidratos11,12,13. Estos importadores son al menos ocho transportadores ABC13. En transportadores ABC, SBPs extracelulares juegan un papel fundamental en la determinación de la especificidad por el ligando y presentación al transportador de la membrana integral de absorción en la célula. SBPs representan objetivos válidos para el diseño de nuevas vacunas y los antimicrobianos porque son proteínas de la superficie y su papel vital en los procesos celulares.

Caracterización de la proteína objetivo y descripción detallada de características estructurales, como bolsillos de ligando y flexibilidad entre dominios, proporcionan una herramienta útil para el diseño de fármacos basado en estructura14,15. Cristalografía de la radiografía es el método de elección para la caracterización estructural de proteínas en a resolución atómica, pero el proceso de cristalización es impredecible, desperdiciador de tiempo y no siempre exitosa. Métodos sistemáticos han mejorado la tasa de éxito y factores importantes son la calidad de la muestra y la estabilidad. La tasa de éxito de cristalización está influenciada por las propiedades químicas de la proteína y la metodología de preparación de muestra. El efecto de estos puede ser evaluado e informado por caracterización bioquímica16,17.

Otra complicación para el diseño de estructura es el problema de la fase cristalográfica, que debe abordarse. Como estructuras de más proteínas se han convertido en disponibles, muchas estructuras pueden resolverse por el método de sustitución molecular, que requiere una estructura homóloga18. Como SBPs presentan una estructura de dominio flexible, reemplazo molecular también puede resultar un reto19. Si no existe un modelo estructural que es lo suficientemente similar a la proteína diana, puede utilizarse una serie de técnicas para obtener la fase experimental20. Entre estos, el método de dispersión anómala sola longitud de onda (SAD) ha emergido como la técnica primaria y ha sido ampliamente utilizado para resolver el problema de fase21. El uso del método triste ha sido más avanzado con mejoras en hardware y software, así como estrategias de colección de datos para permitir la detección y el uso de señales débiles anómalas para la eliminación de22,23, 24. Además, los avances en métodos directos para resolver estructuras de macromoléculas, que en el pasado requieren datos de difracción a resolución atómica, ahora puede ser utilizado combinando por ejemplo, conocimiento estereoquímica como el implementado en el programa ARCIMOLDO25. Una útil revisión de métodos para resolver el problema de la fase en Cristalografía es dada por Taylor26.

Aquí presentamos un protocolo racionalizado para la caracterización del transporte de hidratos de carbono PAS, SP0092 de S. pneumoniae, integración de técnicas bioquímicas y estructurales (figura 1). Este protocolo paso a paso proporciona un caso de prueba de ejemplo útil de estrategias para mejorar la tasa de éxito de los estudios estructurales en SBPs en general, que se encuentran en todos los reinos de la vida. En particular, el protocolo destaca la importancia de caracterizar el más estable estado oligomérico de la proteína en la solución en un método rápido y eficaz y permite la identificación de las mejores especies para seguimiento de experimentos de cristalización. Aunque hay más de 500 estructuras SBP en el Protein Data Bank27, reemplazo molecular puede ser difícil debido a la inherente naturaleza flexible de los dos dominios α/β, que son conectadas por una bisagra región19. Así, la segunda parte del protocolo describe el triste método para la eliminación de los iones del metal enlazados, que es común en SBPs, así como la incorporación de selenio-metionina y el uso de selenio (Se) en triste eliminación.

Protocol

Nota: la secuencia de codificación para lo cual se elimina el péptido señal es clonada en el vector de pOPINF siguiendo un protocolo estándar en fusión; la proteína nativa se expresa como una fusión de su etiqueta en células de Escherichia coli BL21 Rosetta 28 , 29. la metionina marcada variante se expresa siguiendo métodos estándar según el fabricante 30. La recombinante SBP se purifica como se ha descrito 31 , 32.

1. caracterización bioquímica

  1. térmico cambio ensayo
    1. 48 preparar soluciones con un pH de 4.0 a 9.5 y la concentración de NaCl de 0 a 0,5 M y dispensar 40 μL en una placa de 96 pocillos como se describe en Tabla 1 33.
    2. añadir a cada pozo 5 μl de la solución de la SBP en concentración de 1-2 mg/mL.
    3. Añadir a cada pozo 5 μl de 20 x mancha fluorescente para las proteínas (véase Tabla de materiales).
    4. Mezclar las soluciones mediante pipeteo, sellar la placa con una película adhesiva transparente y exprimir por 2 min a 112 x g a temperatura ambiente.
    5. Ejecutar el experimento en una máquina en tiempo real: configurar una rampa de temperatura de 3 ° C/min de 4 a 99 ° C con un tiempo de espera de s 10 y leer la fluorescencia cada 0,5 ° C con excitación a 483 nm y emisión a 568 nm.
    6. Analizar las curvas de emisión de fluorescencia para cada condición de búfer, determinar la temperatura de fusión (T m) como mínimo de la derivada.
      Nota: Este procedimiento le da una buena indicación de la mejor solución de tampón para ayudar en la mejora de la estabilidad de la proteína. Elegir el rango de pH y concentración de la sal basado en la condición de amortiguación con el más alto T m y añadir 2,5% (v/v) de glicerol y 0,5 mM de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) para definir la solución tampón para los siguientes pasos (tampón de seg.).
  2. MALS y analítico SEC
    1. realizar un lavado de volumen de dos columnas de la columna de la filtración de gel empacadas con agua filtrada desgasificada (uso de una columna de 24 mL de peso molecular amplia gama).
    2. Conectar la columna al detector de dispersión de la luz y equilibrar la columna con el SEC-buffer determinado desde el ensayo de cambio térmico.
    3. Inyectar 100 μl de SBP purificada 5 mg/ml en el equilibrado seg columna y caudal una columna volumen de tampón de SEC.
    4. Comprobar el cromatograma de elución para uno o varios picos y examinar los datos de dispersión utilizando el software de análisis, obtener la masa molar y el índice de polidispersidad para todas las especies.
      Nota: Para cada pico corresponde a una especie oligomeric, es beneficioso para controlar la polidispersidad índice se calcula como masa molar, cargada en masa/molar masa ponderado en número de moléculas (Mw/Mn). Polidispersidad el valor cercano a 1 indica un pico monodispersados.
      Nota: Una vez que se definen todas las especies de Oligomerización, es útil estudiar la dependencia de la concentración de proteína, como concentraciones más altas pueden favorecer mayor formación de oligómero.
    5. Ejecutar múltiples analíticos segundos funciona; inyectar 100 μl de SBP purificada en el aumento de las concentraciones (0.1 - 10 mg/mL) en la columna de la filtración de gel equilibrado (uso de una columna de 5 mL de peso molecular amplia gama) y flujo de un volumen de columna de SEC-buffer cada vez.
    6. Comprobar el cromatograma de elución para uno o varios picos y analizar las intensidades de la absorbancia a 280 nm de las curvas correspondientes a diferentes concentraciones de proteína inicial. Si se mantienen constantes las intensidades relativas de los diferentes picos, entonces no hay interconversión entre las especies oligoméricas está presente. Variación en las intensidades relativas a diferentes concentraciones es una indicación de la interconversión entre las distintas especies oligoméricas que depende de la concentración de proteína.
      Nota: Este paso de caracterización es fundamental para definir qué especies son más adecuadas para la cristalización. De hecho, son más propensas a cristalizar si están en un constante estado oligomérico en una concentración definida especies de distinta generación.

2. Preparación de la proteína y la cristalización

  1. preparativa SEC
    1. después de un volumen de una columna de lavado con agua filtrada desgasificada, equilibrar con tampón de SEC la columna de la filtración de gel empacadas preparativa (una variedad molecular peso 120 mL la columna).
    2. Inyectar 1-5 mL de SBP purificada 5-50 mg/ml en el gel equilibrado filtración columna y caudal una columna volumen de tampón de s.
    3. Recoge la columna paso en fracciones de 1 mL.
    4. Piscina las fracciones correspondientes a un pico único monodispersa; girar la muestra en filtros de centrifugación de 15 mL a g 1.500 y cuantificar la concentración hasta que se alcanza la concentración deseada (normalmente 50-100 mg/mL de SP0092).
  2. Cristalización
    1. determinar el rango de concentración óptima para el experimento de cristalización utilizando la prueba de cristalización antes descrito por el fabricante:
      1. dosificación 0.5 - 1.0 mL de cada uno de la prueba de cuatro cristalización soluciones en un depósito diferente de una sesión de 24 pocillos placa de cristalización de la gota.
      2. Preparar las gotas de cristalización mezclando 1 μl de solución de proteína con 1 μl de la solución de depósito, la placa de sello e incubar a temperatura ambiente durante no menos de 1 h (resultados más confiables se obtienen después de la incubación durante la noche).
      3. Comprobar la calidad de la gota para cada concentración utilizando un microscopio de aumento 10 x.
        Nota: Prueba de concentración de al menos tres proteínas diferentes: (I) la mayoría de las gotas restantes claro indica que la proteína es demasiado diluida para la cristalización; (II) la presencia de precipitado pesado en la mayoría de las gotas implica una concentración excesivamente alta; y (III) un equilibrado ocurrencia de gotas claras y precipitado (mejor si es luz) es un buen indicio de que la concentración probada es favorable para la cristalización.
    2. Preparar la caída de la sesión 96 pocillos platos de cristalización, dispensar 100 μl de solución de cristalización comercial diferente en cada depósito bien 34 , 35 , 36 , 37.
    3. dispense 100 nL de la muestra de proteína la concentración definido anteriormente (paso 1.1.6) en todos los pozos de caída de cristalización utilizando un sistema robótico de cristalización.
      4. Soluciones
    4. dispense 100 nL de depósito diferentes a la cristalización correspondiente caída de pozos se mezcle con la proteína en paso 2.2.3. Sellar la placa de cristalización para evitar la evaporación y permitir el equilibrio de la caída de cristalización con el embalse de.
    5. Compruebe periódicamente las gotas (inicialmente cada 1-2 días, después cada semana) con un x 10 (al menos) microscopio de aumento para evaluar el crecimiento y la formación de cristales de.
      Nota: Un sistema automatizado de proyección de imagen para la cristalización de proteínas puede ser utilizado para las gotas de visualización y captura de.
< clase p = "jove_title "> 3. Caracterización de cristal y recopilación de datos de rayos x

  1. cristal montaje
    1. Prepare la solución de crioprotector mediante la adición de 25% (v/v) de glicerol (concentración final) a la condición de la cristalización (reemplazando 25% de agua en la inicial mezcla) 38.
    2. Llenar una espuma dewar con nitrógeno líquido y la parte de la caja de muestra de un duende malicioso de la uni en el dewar. Deje que se enfríe a temperatura de nitrógeno líquido.
    3. Corte y quite el lacre de la cinta de la placa de cristalización sobre la caída donde se forman los cristales de.
    4. Coloque una gota de 1 μl de solución de crioprotector en un coverslide situado en las proximidades de la gota del destino.
    5. Transferir el cristal seleccionado de la gota original a la gota de solución crioprotector usando un cryo-lazo de nylon sobre una base de columna estándar montada en una varilla magnética 39 , 40.
    6. Transferir rápidamente el cristal de la caída de crioprotector en nitrógeno líquido, colocar el lazo en la primera posición vacía uni-puck muestra del titular de la.
    7. Repita (desde el paso de corte de cinta lacre) hasta que todos los cristales deseados son cosechados y almacenados en el soporte de la muestra uni-puck.
    8. Lugar uni-puck en el uni-puck con la varilla de puck y llevar el disco a la línea (bajo condiciones de nitrógeno líquido).
      PRECAUCIÓN: Muy baja temperatura!
    9. Utilizar el cryo-pinzas y el puck herramienta de carga de dewar para cargar la uni-puck(s) en el robot de cambiador de muestra línea dewar. El sostenedor de la muestra uni-puck se separará de la tapa base dejando los portamuestras de bucle vertical en el robot muestra dewar y así expuestos para el nitrógeno líquido y accesible para el robot de cambiador de muestra.
  2. Caracterización de cristal
    Nota: los cristales cosechados pueden proyectará entonces calidad de difracción usando una fuente de rayos x de laboratorio o en una fuente de rayos x de radiación sincrotrón (RS). Líneas de Cristalografía macromolecular (MX) proporcionan una fuente de energía ajustables para explotar difracción anómala para la solución de la estructura. En la siguiente sección, se propone una serie de instrucciones de trabajo en consonancia con las capacidades experimentales de diamante luz fuente MX líneas, pero estas directrices también pueden adaptarse a líneas de MX en otras sincrotrones en el mundo.
    1. Como un primer paso, es útil para confirmar o identificar dispersores anómalos en el cristal. Esto puede lograrse bien por medir un espectro de fluorescencia de rayos x de cristal. En primer lugar garantizar la energía de rayos x de la línea se encuentra lo suficientemente alta como para excitar a todos los elementos normalmente esperados para cristales macromoleculares (14 keV o superior).
    2. Utilizar el software de control de línea para seleccionar la muestra a ser montado por el robot de cambiador de muestra; el bucle automáticamente se centrarán en el haz de rayos x y el centrado de la cristal se puede confirmar manualmente mediante el software de control de línea.
    3. Registrar un espectro de fluorescencia de rayos x mediante el software de control de línea: el usuario selecciona un tiempo de exposición y se inicia la medición (ajuste del espectro de fluorescencia/fluorescencia, → ejecutar, figura 2A). El software de control de línea coloca automáticamente los rayos x detector de fluorescencia en lugar y determina el mínimo incidente flujo de rayos x para obtener una señal legible en el detector de fluorescencia. El espectro adquirido entonces se analiza de una manera automatizada con picos de emisión a natural elementos biológicos. Estas rutinas están disponibles dentro de la línea control software interfaz utilizador gráfico (GUI) - GDA (www.opengda.org) en nuestra compañía y en sincrotrones en toda Europa 41 , 42.
    4. Si se identifican elementos adecuados que pueden ser aprovechados para un experimento de difracción anómala, realizar un análisis de energía de rayos x absorción borde para determinar la longitud de onda óptima para la recogida de datos de difracción anómala desde el cristal: en la línea de software de control, seleccione el elemento e iniciar el análisis (ajuste de exploración/fluorescencia fluorescencia, → nombre de átomo, → ejecutar, figura 2B).
      Nota: Para un experimento de difracción anómala única, el pico del borde de absorción se utiliza para maximizar la dispersión anómala. Consideraciones experimentales para llevar a cabo un experimento de difracción anómala de la multi-longitud de onda han sido previamente detallada 43.
    5. Para determinar los parámetros de la celda de cristal unidad, la simetría y el límite de difracción, medir tres patrones de difracción de rayos x a intervalos de 45° usando el método de oscilación (colección de datos/investigación → ejecutar actual, Figura 2). El software de control de línea proporciona al usuario una elección del ángulo de oscilación y tiempo de exposición y la capacidad para establecer el porcentaje de transmisión del haz de rayos x. Para una proyección de cristal estándar, se recomienda un ángulo de oscilación de 0.5°, un tiempo de exposición de 0,5 s y 5% transmisión de haz de rayos x. Las imágenes de difracción medido son analizadas automáticamente por la tubería de EDNA y devolver un conjunto de estrategias para la recolección de un conjunto completo de datos 22.
  3. Colección de datos de rayos x
    Nota: el usuario puede seleccionar datos en modo de oscilación estándar o rayo inverso, que permite a compañeros de Friedel grabado cerca en tiempo y dosis de rayos x y con aproximadamente el mismo comportamiento de absorción lo que permite una medición más precisa de las diferencias anómalas. El último es útil, especialmente si se espera que pequeñas diferencias anómalas o las muestras son radiación sensible al llevar a cabo un experimento de difracción anómala. Consideraciones sobre las mejores estrategias de recogida de datos a utilizar han sido comprensivo ha 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47.
    1. mediante el software de control de línea, importar los parámetros de colección de datos según lo sugerido por el programa de estrategia que proporcionará:
      posición del eje de rotación ω i.
      ii. Ancho de la oscilación de la rotación del eje del ω del ángulo para cada imagen de difracción
      iii. Tiempo de exposición para cada imagen de difracción
      iv. Número de imágenes para un conjunto de datos completo (indirectamente definir el ángulo de giro total ω-eje para la recopilación de datos entero)
      v. porcentaje de atenuación del haz de rayos x para evitar el daño de la radiación y exposición excesiva
      Nota: en nuestra institución, para ejecutar la recopilación de datos, las tuberías de software para el tratamiento automatizado de los datos recogidos están bien establecidas: datos (i) la difracción se reducen (indexadas, integrados y escala) por la tubería de xia2, que genera archivos de mtz de reflexión para el usuario como entrada de fases y estructura de solución/refinamiento 48. (ii) cuando se detecta una señal anómala importante durante el análisis de datos, una primera tubería de solución rápida estructura automatizada (fast_ep) mediante SHELX intenta resolver la estructura del átomo pesado experimental progresivamente, proporcionando un mapa de densidad electrónica por fases cuando sea posible. Una segunda tubería de solución más completa de estructura compromete automáticamente intenta resolver y construir la estrucre uso independiente de software suites 49 , 50 , 51 , 52; en los casos donde esto tiene éxito, el usuario proporcionará un mapa de densidad inicial de modelo y de electrones. Esto proporciona la base para el usuario para refinamiento de completar y validar el modelo con las suites de software cristalográfico de elección.

Representative Results

Este protocolo integrado ha demostrado para ser exitoso con cuatro (dos y dos estructuras) de seis carbohidratos proteínas objetivos de vinculantes de neumococo analizan hasta la fecha32,53. En esta sección, presentamos la caracterización bioquímica y estructural de SP0092 como resultado representativo para estudios estructurales de SBPs en general.

Después de la SP0092 del PAS ha sido expresado y purificado como se define anteriormente32, la proteína purificada fue analizada para la estabilidad del buffer usando un análisis de cambio térmico: SP0092 exhibe un aumento Tm a pH 6,5 y en presencia de NaCl en el 0 - 0,2 M rango de concentración (Figura 3A). A la luz de esto, la solución tampón para los siguientes pasos se definió como: 0.02 M pH MES 6.5 de 0.2 M NaCl, 2,5% (v/v) de glicerol, 0,5 mM TCEP. La masa molar absoluta de los Estados diferentes de la Oligomerización de SP0092 se midió por MALS juntada a segundo medir un peso molecular de 187.2, 140.8, 97.0 y 49,4 kDa, correspondiente a especies tetramérica, dimérica, trimérica y monoméricas, respectivamente () Figura 3B). El análisis del perfil del SEC en diluciones diferentes de proteínas reveló que la Oligomerización es accionado por la concentración creciente de la proteína, sugiriendo que los oligómeros más grandes son más estables a altas concentraciones que normalmente se usa en cristalización. De hecho, las especies oligoméricas más purificadas dirección a ensayos de cristalización, cristales proteicos producidos con éxito mientras que el monómero no especies.

Los cristales optimizados de los nativos y Se-metionina etiquetado formas de SP0092 se caracterizaron por difracción de rayos x. Medición de la fluorescencia de rayos x de estos cristales revelaron en ambos casos picos de emisión para Zn estando limitado a la proteína, mientras que Se detectaron sólo para los cristales de Se-metionina como se esperaba. Más tarde, se realizaron análisis de absorción de rayos x en los bordes Se y Zn, que proporcionó datos experimentales directos para ajustar la longitud de onda de rayos x incidente a los bordes de absorción de rayos x respectivos de Zn o Se presentan en los cristales para maximizar la señal anómala que puede obtenerse de los datos resultantes (Figura 4A–B).

Después de medir tres patrones de difracción en el bajo de la transmisión, un conjunto completo de datos anómalo se obtuvo utilizando la estrategia de recolección de datos sugerida por EDNA (figura 4). La señal anómala provoca la tubería fase automatizada en línea para determinar la sub-estructura, y basado en las fases experimentales iniciales derivadas, produce inicial mapas y modelos, que pueden ser refinados y validados (figura 4 ).

En Resumen, peligros potenciales de la técnica se centran principalmente en la calidad y la disponibilidad de cristal. Optimización de las condiciones de buffer para mejorar la estabilidad de la proteína, así como identificar el más adecuado estado oligomérico de la proteína a utilizar, cuando más de un oligómero se identifica en la solución, puede reducir el riesgo de fracaso en la cristalización etapa. Explotar el uso de iones metálicos enlazados en una etapa temprana puede acelerar la solución de la estructura y evitar la producción innecesaria de selenometionina etiquetado proteína cuando no de métodos moleculares.

Figure 1
Figura 1. Diagrama de flujo de trabajo para la caracterización bioquímica y estructural de carbohidratos SBPs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Caracterización de cristal en GDA. (A) captura de pantalla de la ficha de control de fluorescencia de rayos x del software de control de línea GDA. (B) captura de pantalla de la ficha de control de borde-análisis de radiografía energía en GDA. (C) captura de pantalla de la ficha de datos de detección de cristal de colección en GDA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Caracterización bioquímica de SP009239-491. (A) gráfico de superficie 3D trazar la temperatura de fusión de SP009239-491 en función del pH y concentración de NaCl de la solución tampón. (B) SEC y MALS resultados para SP009239-491. Absorción a 280 nm se muestra en azul. Las masas molares de las Oligomerización diferentes Estados se muestran en rojo. Panel (B) se ha modificado de32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Caracterización estructural de SP009239-491. (A) y la energía de absorción de rayos x (B) la exploración en el borde para SP009239-491 cristales Zn y Se. La fluorescencia medida del Zn y Se, que contiene cristales aparece en azul y cian, el f calculado "y f" dispersión anómala de fracciones son en verde y rojo, respectivamente. (C) ejemplos de patrones de difracción de rayos x obtuvieron de SP009239-491 cristales. (D) representación de la estructura del dímero de SP009239-491 de la historieta. Un protómero es color blanco y el magenta (residuos 39-366) y violeta (residuos 367-491), y los átomos dispersión anómala se muestran como bolas azul y cian para Zn y Se, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

0.1 M ácido cítrico pH 4.0 0.1 M ácido cítrico pH 4.5 0,1 de fosfato M pH 5.0 0.1 pH de citrato M 5.5 0.1 Bis-tris, M pH 6 0.1 M pH de ADA 6.5 0.1 MOPS de M pH 7 0.1 M pH HEPES 7.5 0.1 M pH de imidazol 8.0 0.1 M Tris pH 8,5 0.1 M pH CHES 9 0.1 M pH CHES 9.5
NaCl M 0 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL
40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0.1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,2 m. 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,5 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL

Tabla 1. Composición del buffer para análisis de cambio térmico.

Discussion

En este papel, describimos y validar un protocolo integrado para la caracterización bioquímica y estructural de carbohidratos SBPs con un especial énfasis en las proteínas de S. pneumoniae. Sin embargo, esto puede utilizarse como un procedimiento estándar para el análisis de otros SBPs de diferentes organismos y aún otras proteínas solubles sin relación.

La primera parte del Protocolo se centra en proporcionar información bioquímica sobre la estabilidad de la proteína y estructura cuaternaria, que puede ser explotada en la preparación de las muestras de proteína para la cristalización. En la sección de análisis de cambio térmico, describimos solamente el pH y las variaciones de concentración de NaCl para mantener el carácter general de este procedimiento. A pesar de esto, muchas otras condiciones de buffer pueden ser probados de una manera similar, por ejemplo, como cualquier compuesto químico utilizado como un aditivo estabilizador: en particular el real ligand(s) que se unen a un PAS específicas es notablemente eficaz en el aumento de la Tm por unos pocos grados31. En algunos casos, las curvas de desnaturalización pueden ser mal definidas debido a la baja de la señal o un fondo de alta fluorescencia, que es causado por la agregación de proteína o despliegue parcial. Para evitar esto, puede realizarse una valoración de la proteína: tinte para optimizar las curvas de desnaturalización claro. Si no se ha obtenido ninguna mejora, detección varios aditivos que pueden mejorar la estabilidad de la proteína se recomienda, y pantallas adecuadas han sido previamente descritos54.

Por lo general, la mayoría SBPs son monoméricas en su ambiente natural, pero como se muestra aquí multimerization puede ocurrir en las concentraciones más altas utilizadas en experimentos de cristalización, por lo tanto la caracterización del comportamiento de Oligomerización de MALS y SEC es esenciales para evaluar el estado de Oligomerización monodispersa estable más favorable para la cristalización. Sin embargo, es difícil predecir el efecto de diferentes productos químicos incluidos en la condición de la cristalización en el comportamiento de la Oligomerización de las proteínas. Si el examen SEC y MALS muestra amplia agregación de la muestra de proteína, le recomendamos lo siguiente para reducir la probabilidad de que esto ocurra: usar muestra de proteína fresco (no congelado-descongelado) y ampliar el análisis de estabilización realizado con térmica cambio de ensayos, pruebas de posibles aditivos y detergentes suaves como un último recurso, para reducir al mínimo la agregación. En este trabajo, presentamos los lineamientos básicos para la cristalización utilizando proyección de cristalización comercial matriz escasa de alto rendimiento para mantener el carácter general del presente Protocolo. Sin embargo, obtener cristales de proteínas de difracción de rayos x de alta resolución puede ser que necesite ajuste fino iterativo para optimizar las condiciones de cristalización con respecto a la concentración de precipitante, pH, adición de aditivos químicos, diferentes temperaturas, y otros factores cambiante dinámica de equilibrio entre el cristal gota y depósito16,17.

La segunda parte del protocolo describe la caracterización de los cristales de la proteína con el fin de definir la estrategia óptima para la recolección de datos de difracción de rayos x con un enfoque específico en la adquisición de datos anómalos para la triste eliminación. Aunque SBPs mantener una arquitectura general similar (y hay muchas estructuras 3D depositadas potencialmente utilizable como modelos de partida), eliminación de estas proteínas por el método de sustitución molecular no siempre es sencillo debido a la variabilidad de la elementos de estructura secundaria y la flexibilidad intrínseca de estas proteínas. Por lo tanto, proponemos el método triste y resaltar que estas proteínas pueden ya haber intrínsecamente enlazado metales o unión de hecho no específica de metales de las condiciones de buffer de cristalización, que pueden proporcionar una gama de elementos diffracting anómalas como una paso estándar en nuestro protocolo general.

En conclusión, este protocolo define un flujo de trabajo estándar guía de procedimientos que permitan la descripción detallada de las características bioquímicas y estructurales de SBPs que pueden explotarse para aumentar la tasa de éxito de determinación de estructura, así como acelerar la caracterización estructural de SBPs en general.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos OPPF-Reino Unido para la asistencia en la clonación, Gemma Harris para SEC-centros comerciales y los científicos de líneas I03 y I04 en fuente de luz diamante.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop - 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.

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References

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

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Transportadores ABC de bioquímica número 128 de Streptococcus pneumoniae la absorción de carbohidratos proteína de unión a sustrato ensayo de cambio térmico multi ángulo la luz dispersa (MALS) cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) Cristalografía de rayos x difracción recopilación de datos solución de estructura de proteínas
Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono
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Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).

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