Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/56294
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Diamond Light Source, Harwell Science & Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science & Innovation Campus

Summary

En strömlinjeformad protokoll för att utföra en omfattande biokemiska och strukturell karaktärisering av ett kolhydrat substrat bindande protein från Streptococcus pneumoniae presenteras.

Abstract

Utvecklingen av nya antimikrobiella ämnen och vacciner för Streptococcus pneumoniae (pneumokocker) är nödvändiga för att stoppa den snabba ökningen flera resistenta stammar. Kolhydrat substrat bindande proteiner (SBPs) representerar livskraftig mål för utvecklingen av protein-baserade vacciner och nya antimikrobiella medel på grund av deras extracellular localization och centralityen av kolhydrat import för pneumokocker ämnesomsättning, respektive. Beskrivs här är en rationaliserad integrerad protokoll att genomföra en omfattande karakterisering av SP0092, som kan utökas till andra kolhydrater SBPs från pneumokocker och andra bakterier. Detta förfarande kan stöd struktur-baserade utformningen av hämmare för denna klass av proteiner. Presenteras i den första delen av detta manuskript är protokoll för biokemisk analys av termiska Skift assay, multi-vinkel ljusspridning (MALS), och storlek utslagning kromatografi (SEC), som optimerar stabilitet och homogenitet av provet riktade till kristallisering prövningar och så öka sannolikheten att lyckas. Den andra delen av den här proceduren beskriver karakterisering av SBP kristaller med en avstämbara våglängd avvikande diffraktion synkrotron beamline och data insamling protokoll för mätdata som kan användas för att lösa kristalliserad proteinet struktur.

Introduction

S. pneumoniae (pneumokocker) är en grampositiv bakterie bosatt asymptomatiskt i de övre luftvägarna i människans luftvägar med möjligheten att migrera till normalt steril nischer orsakar öroninflammation, lunginflammation, sepsis, blodförgiftning, och meningit1,2. Dessutom är pneumokockinfektion den ledande orsaken till samhällsförvärvad pneumoni, som bidrar till en kliniska och ekonomiska bördan i världen3,4. Antibiotikaresistenta stammar av S. pneumoniae har spridit sig över hela världen och även om en sju-valent och en 13-valent konjugerat protein konjugerat vaccin har hjälpt minska graden av antimikrobiell resistens, ersättare stammar från Vaccinet har uppstått och har lett till ökade krav på forskning i utvecklingen av nya behandlingar för pneumokocksjukdom5,6,7,8.

Pneumokocker beror på socker som importerats från mottagande som ett kol källa9,10; verkligen ägnar det 30% av dess importera maskiner till transporten av 32 olika kolhydrater11,12,13. Dessa importörer inkludera minst åtta ABC-transportörer13. I ABC transportörer spelar de extracellulära SBPs en grundläggande roll i att bestämma specificiteten för liganden och presentera det för integrerad membran transportören för upptag i cellen. SBPs representera giltiga mål för design av nya vacciner och antimikrobiella medel eftersom de är ytproteiner och deras viktiga roll i cellulära processer.

Mål protein karakterisering och detaljerad beskrivning av strukturella funktioner som ligand fickor och interdomain flexibilitet, ger ett användbart verktyg för strukturbaserad design14,15. Röntgenkristallografi är metoden för val av strukturella karakterisering av proteiner vid nära atomär upplösning, men kristallisation är oförutsägbara, tidskrävande och inte alltid framgångsrik. Systematiska metoder har förbättrat framgång och viktiga faktorer är provets kvalitet och stabilitet. Framgången av kristallisering är influerad av protein kemiska egenskaper och prov förberedelse metod. Effekten av dessa kan bedömas och informeras av biokemisk karakterisering16,17.

En ytterligare komplikation för struktur-baserad design är kristallografiska fas problemet, som måste åtgärdas. Så mer protein strukturerar har blivit tillgängliga, kan många strukturer lösas genom metoden molekylär ersättning, som kräver en homologa strukturen18. Som SBPs presenterar en flexibel domänstruktur, kan molekylär ersättning också vara utmanande19. Om en strukturell modell som är tillräckligt lik målproteinet inte är tillgänglig, kan ett antal tekniker användas för att erhålla experimentella fasa20. Bland dessa metoden Single-våglängd avvikande Dispersion (SAD) har vuxit fram som den primära tekniken och har i stor utsträckning används för att lösa fas problem21. Användningen av metoden SAD har tidigarelagts vidare med förbättringar i maskinvara och programvara, samt data collection strategier för att möjliggöra identifiering och användning av svaga avvikande signaler för utfasning22,23, 24. Dessutom förskott i direkta metoder för lösa strukturer av makromolekyler, som tidigare krävde diffraktion data till atomär upplösning, kan nu utnyttjas genom att kombinera exempelvis stereokemiska kunskap som genomförts i programmet ARCIMOLDO25. En nyttig genomgång av metoder för att lösa problemet fas i kristallografi ges av Taylor26.

Här presenterar vi en rationaliserad protokoll för karakterisering av kolhydrat transport SBP, SP0092 av S. pneumoniae, integrera biokemiska och strukturella tekniker (figur 1). Detta stegvisa protokoll ger ett användbart exempel testfall strategier för att förbättra andelen framgångsrika strukturella studier på SBPs i allmänhet, som återfinns i alla riken av liv. I synnerhet protokollet understryker att karaktärisera den mest stabila Oligomera staten av proteinet i lösning i en snabb och effektiv metod, och möjliggör identifiering av de bästa arterna att följa upp för kristallisering experiment. Det finns över 500 SBP strukturer rapporterade i Protein Data Bank27, kan molekylär ersättning vara svårt på grund av den inneboende flexibiliteten i de två α/β-domänerna, som förbinds av en gångjärnet regionen19. Således, den andra delen av protokollet beskriver metoden ledsen för utfasning från bundna metalljoner, vilket är vanligt i SBPs, liksom införlivandet av selenometionin och användning av selen (Se) ledsen fasa.

Protocol

Obs: kodning sekvensen som signal peptiden raderas är klonad i pOPINF vektorn efter ett standardprotokoll för i-fusion; infödda proteinet uttrycks som en His-tag fusion i Escherichia coli BL21 Rosetta celler 28 , 29. den selenometionin märkt variant uttrycks följande standardmetoder enligt tillverkaren 30. Den rekombinant SBP renas som tidigare beskrivs 31 , 32.

1. biokemisk karakterisering

  1. Thermal test
    1. förbereda 48 buffertlösningar med pH alltifrån 4.0 till 9,5 och NaCl koncentrationen från 0 till 0,5 M och fördela 40 µL i en plattan med 96 brunnar som beskrivs i Tabell 1 33.
    2. lägga till varje väl 5 µL av SBP lösningen vid koncentration av 1-2 mg/mL.
    3. Lägg till varje väl 5 µL 20 x fluorescerande fläcken för proteiner (se Tabell för material).
    4. Blanda lösningarna genom pipettering, försegla plattan med hjälp av en genomskinlig självhäftande film och snurra i 2 min på 112 x g rumstempererat.
    5. Köra experimentet på en realtid maskin: ställa in en temperatur ramp 3 ° C/min från 4 till 99 ° C med hålltid 10 s, och läsa fluorescensen varje 0,5 ° C med excitation vid 483 nm och utsläpp på 568 nm.
    6. Analysera fluorescens utsläpp kurvorna för varje buffert tillstånd, att identifiera smälttemperatur (T m) som ett minimum av derivatan.
      Obs: Detta förfarande ger en bra indikation på bästa buffertlösningen till stöd i förbättring av protein stabilitet. Välj pH-område och salt koncentrationen baserat på villkoret buffert med den högsta T m och lägga till 2,5% (v/v) av glycerol och 0,5 mM av tris(2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) att definiera buffertlösningen för följande steg (SEC-buffert).
  2. MALS och analytiska SEK
    1. utför ett två-kolonn volym tvättningen av kolumnen färdigförpackade gel filtrering med avgasade filtrerat vatten (Använd en rad molekylvikt 24 mL kolumn).
    2. Ansluta kolumnen till ljusspridning detektorn och jämvikta kolonnen med beslutsamma SEC-bufferten från termisk Skift analysen.
    3. Injicera 100 µL av renat SBP vid 5 mg/mL till skakad SEC kolumn och flöde en kolumn volym av SEC-bufferten.
    4. Kontrollera eluering kromatogrammet för enstaka eller multipla toppar och granska scattering data via programvaran analys att erhålla Molmassa och polydispertion index för alla arter.
      Obs: För varje topp som motsvarar en Oligomera art, är det fördelaktigt att kontrollera polydispertion index beräknat som Molmassa vägt på massa/molar massa vägt genomsnittligt antal molekyler (Mw/Mn). Ett polydispertion värde nära 1 tyder en monodispersed topp.
      Obs: När alla oligomerisering arter definieras, det är användbart att studera deras beroende av proteinkoncentration, som högre koncentrationer kan gynna större oligomer bildandet.
    5. Köra flera analytiska SEK körningar; Injicera 100 µL av renat SBP på ökande koncentrationer (0,1 - 10 mg/mL) i kolumnen skakad gel filtrering (Använd en rad molekylvikt 5 mL kolumn) och flöde en kolumn volym av SEC-buffert varje gång.
    6. Kontrollera eluering kromatogrammet för enstaka eller multipla toppar och analysera stödnivåerna som absorbansen vid 280 nm av kurvorna motsvarar olika start protein koncentrationer. Om de relativa intensiteten hos de olika topparna förblir konstant, då är ingen interkonversion mellan Oligomera arterna närvarande. Variationer i de relativa stödnivåerna vid olika koncentrationer är en indikation på omvandling mellan olika Oligomera arter som är beroende av proteinkoncentration.
      Obs: Denna karakterisering steg är grundläggande att definiera vilka arter som är mer lämplig för kristallisering. Faktiskt, distinkta monodispersed arter är mer benägna att kristallisera om de är i en stadig Oligomera tillstånd vid en definierad koncentration.

2. Protein förberedelse och kristallisering

  1. preparativ SEC
    1. efter en en kolumn volym tvätta med avgasade filtrerat vatten, jämvikta med SEC-buffert kolumnen preparativ färdigförpackade gel filtrering (ett brett utbud molekylär vikt 120 mL kolumn).
    2. Injicera skakad gel filtrering kolumn och flöde en kolumn volymen av SEC-buffert 1-5 mL renat SBP på 5-50 mg/mL.
    3. Samla den kolumn genomflöde i 1 mL fraktioner.
    4. Pool de fraktioner som motsvarar en enda monodisperse topp; snurra provet i 15 mL centrifugering filter vid 1500 g och kvantifiera koncentration tills önskad koncentration uppnås (vanligen 50-100 mg/mL för SP0092).
  2. Kristallisering
    1. bestämma den optimala koncentrationsintervall för kristallisering experimentet med det före kristallisering Test som beskrivs av tillverkaren:
      1. dispensering 0,5 - 1,0 mL av varje av de fyra kristallisering testet lösningar i en annan reservoar av en 24-väl sittande släppa kristallisering plattan.
      2. Förbereda kristallisering dropparna genom att blanda 1 µL protein lösning med 1 µL reservoar lösning, försegla plattan och inkubera vid rumstemperatur för inte mindre än 1 h (mer tillförlitliga resultat erhålls efter natten inkubation).
      3. Kontrollera droppe kvaliteten för varje koncentration med 10 x förstoring Mikroskop.
        Obs: Testa minst tre olika proteinkoncentration: (I) de flesta av dropparna återstående tydligt ange att proteinet är alltför utspädd för kristallisering; (II) förekomsten av tunga fällningen i majoriteten av dropparna innebär en alltför hög koncentration; och (III) en balanserad förekomsten av både tydliga droppar och fällningen (bättre om ljus) är en bra indikation på att den testa koncentrationen är gynnsamt för kristallisering.
    2. Förbereda 96 brunnar sittande drop kristallisering plattor; Dispensera 100 µL av olika kommersiella kristallisering lösning i varje reservoar väl 34 , 35 , 36 , 37.
    3. Dispensera 100 nL protein prov vid den tidigare definierade koncentrationen (steg 1.1.6) i alla de kristallisering droppe brunnar med en kristallisering robotsystem.
    4. Dispensera 100 nL av reservoaren olika lösningar på motsvarande kristallisation släppa wells att blanda med protein dispenseras i steg 2.2.3. Försegla kristallisering plattan för att undvika avdunstning och aktivera Jämviktstiden av kristallisering droppe med reservoaren.
    5. Kolla droppar regelbundet (initialt varje 1-2 dagar, senare varje vecka) med en 10 x (åtminstone) förstoring Mikroskop för att utvärdera crystal bildandet och tillväxt.
      Obs: Ett automatiserat imaging system för protein kristallisation kan användas för sjunker visualisering och fånga.
< p class = ”jove_title ”> 3. Crystal karakterisering och röntgen datainsamling

  1. Crystal montering
    1. bereda frysskyddmedel lösning genom att lägga till 25% (v/v) av glycerol (slutlig koncentration) till kristallisation villkoret (ersätter därmed 25% vatten i inledande blandning) 38.
    2. Fyller en skum dewar med flytande kväve och placera den prov inhägnad del av en uni-puck i dewar. Låt den svalna till flytande kväve temperatur.
    3. Klippa och ta bort försegla tejpa från kristallisering plattan över drop där kristallerna bildas.
    4. Placera en droppe 1 µL frysskyddmedel lösning på en coverslide placerad i närheten av målet drop.
    5. Överföra valda kristallen från ursprungliga drop till frysskyddmedel lösning släppa med en nylon cryo-loop på en ryggrad standard bas monterad på en magnetisk trollstav 39 , 40.
    6. Snabbt överföra kristallen i frysskyddmedel listrutan till flytande kväve, placera öglan i den första tomma positionen av uni-pucken provhållaren.
    7. Upprepa (från tätning band skär steg) tills alla önskade kristaller skördas och lagras i uni-pucken provhållaren.
    8. Plats uni-pucken basera på uni-pucken med pucken staven och ta pucken till beamline (villkor flytande kväve).
      Varning: Extremt låg temperatur!
    9. Använda cryo-tången och pucken dewar lastmaskin att läsa in uni-puck(s) i beamline sample changer roboten dewar. Uni-pucken provhållaren kommer loss från bas locket lämnar prov loop innehavare upprätt i provet roboten dewar och därmed utsatta för det flytande kvävgasen och tillgänglig för sample changer roboten.
  2. Crystal karakterisering
    Obs: skördade kristallerna kan sedan undersökas för diffraktion kvalitet med hjälp av antingen en laboratorium röntgen källa eller på en synkrotronstrålning (SR) röntgen källa. Makromolekylär kristallografi (MX) linjer ger en avstämbara energikälla för att utnyttja avvikande diffraktion struktur lösning. I följande avsnitt, en serie av arbetsinstruktioner i linje med de experimentella funktionerna av Diamond Light Source MX linjer föreslås, men dessa riktlinjer kan också anpassas till MX linjer på andra synkrotroner världen över.
    1. Som ett första steg, det är nyttigt att antingen bekräfta eller identifiera avvikande scatterers i kristallen. Detta kan bekvämt uppnås genom att mäta en X-ray fluorescens spektrum från kristallen. Först kontrollera röntgen energin av beamline är tillräckligt hög för att väcka alla element som normalt kan förväntas för makromolekylära kristaller (14 keV eller högre).
    2. Använda programvaran beamline kontroll för att välja provet monteras av sample changer roboten; slingan centreras automatiskt i röntgen strålen och den crystal centrering kan bekräftas manuellt med beamline kontroll mjukvaran.
    3. Registrera en X-ray fluorescens spektrum med programvaran beamline kontroll: användaren väljer en exponeringstid och initierar mätning (fluorescens/fluorescens spektrum inställning, → kör, figur 2A). Beamline kontroll mjukvaran placerar automatiskt X-ray fluorescens detektorn i placera och bestämmer den minsta incidenten röntgen flux att få en läsbar signal på fluorescens detektorn. Förvärvade spektrumet analyseras sedan i ett automatiserat sätt med utsläpp toppar monteras på naturligt förekommande biologiska element. Dessa rutiner finns inom beamline kontroll programvara grafiska användargränssnittet (GUI) - GDA (www.opengda.org) på vårt företag och på synkrotroner i hela Europa 41 , 42.
    4. Om lämpliga element identifieras som kan utnyttjas för ett avvikande diffraktion experiment, utföra en X-ray absorption kanten energi sökning för att fastställa optimal våglängd för avvikande diffraktion uppgifter från kristallen: på beamline Kontrollera programvara, markerar du elementet och initiera sökningen (fluorescens/fluorescens Skanna inställning, → Atom namn, → kör, figur 2B).
      Observera: För en enda avvikande diffraktion experiment, toppen av absorption kanten används att maximera avvikande spridningen. Experimentell överväganden för att utföra ett flera våglängder avvikande diffraktion experiment har varit tidigare detaljerade 43.
    5. Att bestämma den crystal enhet cell parametrar, symmetri och diffraktionsgränsen, mäta tre röntgendiffraktion mönster 45° mellanrum med metoden svängning (Data insamling/Screening → kör ström, Figur 2 c). Beamline kontroll mjukvaran ger användaren ett val av svängningen vinkel och exponeringstid och möjlighet att ange procentuella överföringen av röntgen balken. För en standard crystal screening rekommenderas en svängning vinkel på 0,5 °, en exponeringstid på 0.5 s och 5% X-ray balk transmission. Uppmätta diffraktion bilderna analyseras automatiskt av rörledningen EDNA och returnerar en uppsättning strategier för insamling av en fullständig datauppsättning 22.
  3. Röntgen datainsamling
    Obs: användaren kan välja att samla in data i standard svängning eller omvänd beam läge, vilket gör Friedel kompisar registreras nära i tid och röntgen dos, och med ungefär samma absorption beteende möjliggör en mer exakt mätning av avvikande skillnader. Det sistnämnda är användbar särskilt om små avvikande skillnader förväntas eller proverna är strålning känsliga när de utför ett avvikande diffraktion experiment. Överväganden om de bästa data collection strategierna att använda har varit omfattande granskade 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47.
    1. med beamline kontroll mjukvaran, importera data collection parametrarna som föreslagits av programmet strategi som kommer att ge:
      i. startposition ω-rotation axis
      ii. Svängningen bredd ω-axis rotation vinkel för varje diffraction bild
      iii. Exponeringstid för varje diffraction bild
      iv. Antal bilder för en komplett datamängd (indirekt definiera totala ω-axis rotationsvinkeln för hela datainsamlingen)
      v. andelen dämpning av röntgen balken att undvika överexponering och strålning skada
      Anmärkning: på vår institution, för Kör datainsamlingen, programvara rörledningarna för automatiserad behandling av insamlade data är väl etablerade: (i) diffraktion data reduceras (indexerade, integrerad och skalad) av xia2 rörledningen, som genererar reflektion mtz filer för användaren som indata för utfasning och struktur lösning/förfining 48. (ii) när en betydande avvikande signal detekteras under dataanalys, en första snabb automatisk struktur lösning pipeline (fast_ep) som använder SHELX försöker lösa tunga Atomen underkonstruktionen av experimentella fasa, som ger en stegvis elektron densitet karta där så är möjligt. En andra mer omfattande struktur lösning pipeline automatiskt åtar sig försöken att lösa och bygga kapitalstrukturenRe med oberoende programvara sviter 49 , 50 , 51 , 52; i fall där detta är framgångsrik, kommer användaren förses med en första modell och elektron densitet karta. Detta utgör grunden för användaren att slutföra förfining och validera modellen med de kristallografiska programserier val.

Representative Results

Detta integrerade protokoll har visat sig vara framgångsrik med fyra (två publicerade och opublicerade två strukturer) av sex kolhydrat bindande protein mål från pneumokocker analyseras hittills32,53. I detta avsnitt presenterar vi de biokemiska och strukturell karaktärisering av SP0092 som representativa resultat att vägleda strukturella studier av SBPs i allmänhet.

Efter den SBP SP0092 har uttryckt och renat tidigare angivna32, renat protein analyserades för buffert stabilitet med en termisk Skift-analys: SP0092 uppvisar en ökad Tm vid pH 6,5 och i närvaro av NaCl i 0 - 0,2 M koncentrationsintervall (figur 3A). Mot denna bakgrund buffertlösningen för följande steg definierades som: 0,02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5% (v/v) glycerol, 0,5 mM TCEP. Den absoluta Molmassa av olika oligomerisering påstår av SP0092 mättes genom MALS kopplat till SEC mäta en molekylvikt av 187,2, 140,8, 97,0 och 49,4 kDa, motsvarar tetrameriskt, trimeric, dimeriskt och monomer arter, respektive () Figur 3B). Analysen av SEC profilen på olika protein utspädningar visade att oligomerisering utlöses av ökad proteinkoncentration, tyder på att de större oligomererna är mer stabil i högre koncentrationer än vad som normalt används i kristallisering. Faktiskt, renat större Oligomera arter riktad till kristallisation prövningar, framgångsrikt producerade proteinkristaller medan monomeren arter inte gjorde.

Den optimerade kristaller erhålls från infödingen och Se-metionin märkt former av SP0092 präglades av röntgendiffraktion. Mätning av röntgen fluorescensen från dessa kristaller avslöjade i båda fallen utsläpp toppar för Zn att vara bunden till proteinet, medan Se upptäcktes endast för Se-metionin kristallerna som förväntat. Senare, utfördes X-ray absorption skanningar i Se och Zn kanterna, vilket gav direkt experimentella data till tune incident röntgen våglängden på respektive X-ray absorption kanterna av Zn eller Se presentera i kristallerna att maximera avvikande signalen kan erhållas från den resulterande data (figur 4A–B).

Efter mätning tre diffraktionsmönster på låg överföring, erhölls en komplett uppsättning för avvikande data användning av data collection strategi föreslås av EDNA (figur 4 c). Avvikande signalen närvarande utlöser den automatiserade fasa pipelinen på beamline att bestämma understrukturen och baserat på de första experimentella faser härrör, producerar initial kartor och modeller, som sedan kan förfinas och validerade (figur 4 d ).

Sammanfattningsvis är potentiella fallgropar av teknik centrerade främst på crystal tillgänglighet och kvalitet. Optimering av buffert förutsättningar att förbättra protein stabilitet samt identifiering av lämpligaste Oligomera staten av proteinet att använda, när mer än en oligomer identifieras i lösning kan minska risken för misslyckande på kristallisation skede. Utnyttjar användningen av bundna metalljoner som identifieras i ett tidigt skede kan påskynda struktur lösning och undvika onödig produktion av selenometionin märkt protein när molekylär ersättning metoder misslyckas.

Figure 1
Figur 1. Diagram över arbetsflödet för biokemiska och strukturell karaktärisering av kolhydrat SBPs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Crystal karakterisering i GDA. (A) skärmdump av fliken X-ray fluorescens kontroll av programvaran GDA beamline kontroll. (B) skärmdump av fliken X-ray energi edge-scan control i GDA. (C) skärmdump av fliken data collection crystal screening i GDA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Biokemisk karakterisering av SP009239-491. (A) 3D-yta graf plottning smälttemperatur av SP009239-491 som funktion av pH samt NaCl koncentrationen av buffertlösningen. (B) SEK och MALS resultat för SP009239-491. Absorption vid 280 nm visas i blått. Den molära massan staters olika oligomerisering visas i rött. Panelen (B) har ändrats från32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Strukturell karaktärisering av SP009239-491. (A) och (B) X-ray absorption energi skanna på Zn och Se kanten för SP009239-491 kristaller. Den uppmätta fluorescensen från Zn och Se som innehåller kristaller visas i blått och cyan, den beräkna f' och f ”avvikande scattering fraktioner är i grönt och rött, respektive. (C) exempel på röntgendiffraktion mönster som samlats in från SP009239-491 kristaller. (D) tecknad representation av SP009239-491 dimer strukturen. En protomer är färgade vita och andra magenta (rester 39-366) och violett (rester 367-491), och avvikande scattering atomerna visas som blå och cyan bollar för Zn och Se, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

0,1 M citronsyra pH 4.0 0,1 M citronsyra pH 4,5 0,1 M fosfatbuffert pH 5,0 0,1 M citrat pH 5,5 0,1 M Bis-tris pH 6 0,1 M ADA pH 6,5 0,1 M moppar pH 7 0,1 M HEPES pH 7,5 0,1 M Imidazol pH 8,0 0,1 M Tris pH 8.5 0,1 M CHES pH 9 0,1 M CHES pH 9,5
NaCl 0 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL
40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,1 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,2 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL NaCl 0,5 M 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL 40 ΜL

Tabell 1. Buffert sammansättning för termisk Skift analysen.

Discussion

I detta papper, vi beskriva och validera ett integrerat protokoll för biokemiska och strukturell karaktärisering av kolhydrat SBPs med särskild tonvikt på proteiner från S. pneumoniae. Dock kan detta användas som ett standardförfarande för analys av andra SBPs från olika organismer och även andra orelaterade lösliga proteiner.

Den första delen av protokollet är inriktad på att tillhandahålla biokemiska information om protein stabilitet och Kvartär struktur, som kan utnyttjas vid utarbetandet av protein prover för kristallisering. I avsnittet termisk Skift analyser beskriver vi endast pH och NaCl koncentrationen variationer att upprätthålla den allmänna karaktären hos detta förfarande. Trots detta många andra buffert villkor kan testas på ett liknande sätt, till exempel inklusive någon kemisk förening som används som en stabiliserande tillsats: de faktiska ligand(s) som binder till en specifik SBP är särskilt anmärkningsvärt effektiva för att öka Tm av några grader Celsius31. I vissa fall kan denatureringen kurvor definieras dåligt på grund av låg signal eller en hög fluorescence bakgrund, som orsakas av protein aggregation eller delvis utspelas. Undvik detta genom kan en protein: färgämne titrering utföras för att optimera oklart denatureringen kurvorna. Om ingen förbättring erhålls, screening olika tillsatser som kan lindra stabiliteten av protein rekommenderas, och lämpliga skärmar har varit tidigare beskrivna54.

Vanligtvis de flesta SBPs är monomer i deras naturliga miljö, men som visas här multimerization kan uppstå vid de högsta koncentrationer som används i kristallisering experiment, oligomerisering beteende karakterisering som MALS och SEC är således viktigt att bedöma den mest gynnsamma stabil monodisperse oligomerisering staten för kristallisering. Det är dock svårt att förutsäga effekten av olika kemikalier som ingår i villkoret kristallisering på oligomerisering uppförandet av proteiner. Om SEK och MALS undersökningen visar omfattande aggregering av protein provet, vi rekommenderar följande för att minska sannolikheten att detta inträffar: använda färska protein prov (inte frysa-tinade) och utöka stabilisering analysen utförs med termisk Skift-analyser, tester möjliga tillsatser och milda tvättmedel som sista resurs, att minimera aggregering. I detta papper presentera vi grundläggande riktlinjer för kristallisering med hög genomströmning sparse matrix kommersiella kristallisering screening för att behålla den allmänna karaktären hos detta protokoll. Få högupplösta röntgendiffraktion proteinkristaller måste däremot iterativ finjustering för att optimera kristallisering villkoren vad gäller fällningsmedel koncentration, pH, tillsats av kemiska tillsatser, olika temperaturer, och andra faktorer förändrade jämvikt dynamiken mellan de crystal drop och reservoar16,17.

Den andra delen av protokollet beskriver karakterisering av protein kristallerna för att fastställa den optimala strategin för röntgendiffraktion datainsamling med särskilt fokus på förvärv av avvikande data för SORGLIGT fasa. Även om SBPs upprätthålla en liknande allmän arkitektur (och det finns många insatta 3D-strukturer potentiellt användbara som utgångsmaterial modeller), utfasning av dessa proteiner av metoden molekylär ersättning är inte alltid enkel på grund av variationer i den sekundärt strukturera element och den inneboende flexibiliteten av dessa proteiner. Därför vi föreslår metoden SORGLIGT och markera att dessa proteiner kan redan har intimt bundna metaller eller faktiskt icke-specifik bindning av metaller från kristallisering buffert villkorar, som kan ge en rad avvikande diffracting element som en standard steg i våra allmänna protokoll.

Avslutningsvis definierar detta protokoll en guidad standardarbetsflöde för förfaranden som möjliggör en detaljerad beskrivning av de biokemiska och strukturella funktionerna av SBPs som kan utnyttjas för att öka framgång struktur bestämning, samt påskynda strukturella karakterisering av SBPs i allmänhet.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner OPPF-UK för hjälp med kloning, Gemma Harris för SEC-gallerior och forskarna av linjer I03 och I04 på Diamond Light Source.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SelenoMethionine Medium Complete Molecular Dimensions MD12-500 Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plate Applied Biosystems 4306737 The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO Orange Molecular Probes S6651 SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive film Applied Biosystems 4311971 The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS II Wyatt DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GL GE Healthcare 28906561 Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335 HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization Plate MiTeGen XQ-P-24S-A The 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization Test Hampton HR2-140 The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 6098xx Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601 The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam Dewar Molecular Dimensions MD7-35 5.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop - 20 micron Hampton HR4-955 Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607 This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, Suppl 3. S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway? Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. Bergfors, T. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD? Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Tags

Biokemi fråga 128 ABC transportörer Streptococcus pneumoniae kolhydrat upptag substrat-bindande protein termisk Skift assay multi angle ljus spridning (MALS) storlek utslagning kromatografi (SEC) kristallografi röntgen diffraktion uppgiftsinsamling protein struktur lösning
Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D.… More

Culurgioni, S., Tang, M., Hall, D. R., Walsh, M. A. Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092. J. Vis. Exp. (128), e56294, doi:10.3791/56294 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter