Summary
我们描述了一种实验程序, 测量双光窗口以上的双光窗口双侧原生体感骨 (s1) 在 thy1-gcmp6 转基因小鼠使用2光子 (2p) 显微镜在体内 .
Abstract
哺乳动物的大脑在矢状面上表现出明显的对称性。然而, 对成年哺乳动物大脑对称区域的神经动力学的详细描述仍然难以捉摸。在本研究中, 我们描述了一个实验程序, 测量钙动力学通过双光窗口以上的双侧原生体感皮层 (s1) 在thy1-gcmp6 的转基因小鼠使用2光子 (2p) 显微镜。这种方法可以在同一实验中长时间地记录和定量双侧小鼠大脑区域的神经活动. 此方法的关键方面, 可以在一个小时内完成, 包括微创手术程序, 以创建双光窗, 和2p 成像的使用。虽然我们只在 s1 区域演示了这一技术, 但该方法可应用于活体大脑的其他区域, 从而促进大脑神经网络结构和功能复杂性的阐明。
Introduction
钙及其调节是调节多种生理过程所必需的。监测钙动力学有助于了解正常的大脑功能以及大脑疾病的病理条件1,2,3, 4,5,6 ,7,8。成像 gcmp6 荧光是一个强大的工具, 用于量化尖峰数量, 时间和频率, 以及突触输入水平的体外和体内 9, 10,11。
哺乳动物的大脑在矢状面上表现出明显的对称性。尽管最近的神经研究揭示了创伤性脑或脊髓损伤6、7引发的皮质重塑和神经元活动, 但对称对应区域的完整组织所发挥的作用在复苏仍然是模糊的。
在本研究中, 我们描述了用于体内成像的双侧对称光窗口的实验过程。利用这些光学窗口, 我们描述了使用2p 显微镜测量 gcmp6 转基因小鼠的原代体感皮质 (s1) 中的钙动力学。在结果部分, 我们还显示了在体内树突形态在不同的时间点在 s1 区域的 egfp 转基因小鼠使用2p 成像。双侧 s1 区域网络动力学的观察方法只是一个初步的例子, 说明双开放颅窗将如何帮助神经科学家在正常情况下探索成年哺乳动物大脑中的局部和对称信息处理条件或在体内不同的疾病模型。
Protocol
所有手术和动物处理程序都是根据《实验动物护理和使用指南》 (国家研究理事会) 和印第安纳大学机构医学学院动物护理和使用指南进行的委员会。图 1显示了2光子成像设置的示意图。
1. 为动物成像做准备
- 在手术区放置无菌纱布、棉签和高压灭菌手术工具 (表 1)。打开微型珠子灭菌器, 用于手术工具的手术间灭菌。
- 对老鼠 (雄性或雌性, 1.5-2.5个月, 20-25 克) 由氯胺酮 (17.2 mg/ml)、xylazine (0.475 mg/ml) 和环丙嗪 (0.238 mg/ml) (6 微克-ll) 的混合物注射 (i. p.)。等待, 直到达到适当的麻醉深度, 当动物停止反应的脚趾捏刺激, 并没有角膜反射。在手术过程中, 根据需要给予原剂量的麻醉鸡尾酒的助推器剂量, 以保持原来的麻醉状态。
- 在手术前作为镇痛剂注射丁丙诺非 (. c.; 0.05-0.10 mg/kg)。在动物的眼睛上涂上保护药膏, 以防止角膜干燥和白内障的形成。
- 将 gcamp6 转基因鼠标放在加热垫上, 以防止体温过低, 并用无菌手术悬垂覆盖它。用小鼠的头保持适配器稳定动物的头部。
- 用双刃剃须刀片将头部刮过头皮。用无菌酒精制剂垫清洁手术区域, 然后是 povidone-iodine 溶液。
2. 慢性颅窗准备
- 用剪刀在头骨的一侧 (右) 切割头皮 (2 毫米 x 3 毫米)。用棉签将皮肤推到一边, 形成直径 & gt;3 毫米的曝光面积 (图 3 a)。用钝器显微手术刀片 (手术刀刀片 #10 轻轻刮头骨, 取出附着在头骨上的结缔组织;图 3c)。
- 用牙科钻头在头骨上轻轻绘制一个圆圈 (直径3毫米, 中心配位:-1.5 毫米, 中线2.5 毫米), 在头骨上绘制一个圆圈 (直径3毫米, 中心配位2.5 毫米), 以标记s1 区域 (图 2b)。
- 对左颅骨执行相同的过程 (图 2b)。
- 在骨上涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯超级胶, 为牙科水泥的应用提供基础。
- 在解剖显微镜下, 使用高速微钻 (图 3d) 将 s1 区域周围的头骨上的圆形凹槽变薄。其目的是创建一个平滑的边缘, 用于将光学窗口放置在它上。
- 在细化过程中, 反复对颅骨定期应用人工脑脊液 (acsf, 室温), 以方便钻孔和散热。间歇性地进行钻孔, 以避免摩擦引起的过热。用房子的真空线或真空泵吸走骨头碎片。
- 在钻了大约 2/深度的骨头后, 慢慢地和仔细地将剩余的半骨变薄, 直到头骨的圆形块 (骨瓣) 完全从周围的头骨中解脱出来。
- 用一对 # 5 45 钳慢慢地小心地取出圆形骨瓣, 露出硬脑膜 (图 2c;图 3e)。
- 使用 acsf 保持暴露的大脑区域湿润 (图 3e)。避免对皮膜血管造成任何损害, 因为出血会改变大脑的血液流动, 加速大脑肿胀, 并严重降低成像质量。
- 在颅骨的左侧 (对侧) 执行相同的操作。
- 对于组装光学窗口, 使用光学胶粘剂一次在一个覆盖玻璃层之间粘合和固化。如有必要, 请在孵化器中加热光学窗口 (50°c, 12小时), 以增强粘接。光学窗口包含2个部分: 顶部包含直径为5毫米的单个圆形盖板玻璃, 底部部分包含直径为3毫米的1-3 个圆形盖板玻璃 (图 2d)。
- 将光学窗口储存在乙醇中 (70%, vol/vol), 并在使用前用无菌盐水冲洗。在安装光学窗口之前, 请检查光学窗口是否有缺陷, 包括光学胶粘剂数量不正确或立体显微镜下的校准不准确。
- 在开颅区域安装光学窗口 (图 2d)。光学窗口的顶部位于头骨上, 光学窗口的底部适合在颅骨测量的开口中, 并在 csf 存在的情况下停留在硬脑膜上 (图 2d, e)。
- 用氰基丙烯酸酯超级胶水将光学窗口边缘的顶部密封到头骨 (图 2f;图 3 f)。
- 当氰基丙烯酸酯超级胶水干燥后, 使用黑色牙科水泥 (dentsply) 覆盖玻璃边缘。将牙科水泥涂在所有暴露的头骨和伤口边缘, 以遮挡光线 (图 2g-h;图 3b)。
- 在左侧执行相同的过程。
- 让动物在加热垫上恢复, 并在适当的监测下将动物送回家笼进行恢复。提供湿食物, 以方便咀嚼和水合作。为了减轻疼痛, 每8–12小时在伤后2天服用丁丙诺非. c. (0.05–2.0 mg/kg)。允许鼠标在成像前的7-10天内恢复7-10天。
3. 双光子成像
- 在实验当天, 用氯胺酮和木氨酸麻醉动物 (剂量和维持麻醉, 如上文所述)。用 75% (vol/vol) 乙醇清洁颅窗。
- 将鼠标置于由2p 显微镜和头保持适配器组成的成像设置下, 靠在加热垫上, 其头部通过连接在鼠标头支架上的耳条固定。
- 一次图像光学窗口的一侧。为了最大限度地减少光学畸变, 请确保光学窗口和右头骨垂直于显微镜的光轴。
- 以4倍放大倍率明亮的现场照明的颅骨窗口的初始图片作为参考地图, 用于以更高的放大倍率2p 血管造影进行注册 (图 4x1)。
- 使用10倍放大倍率放大感兴趣的区域 (图 4a2)。
- 在皮质层 i 或 ii 的 s1 区域中选择感兴趣的区域 (在层面表面下方高达 150μm)。如果需要更高的放大倍率, 请使用20x 目标。
- 搜索具有多个神经元的视场。使用2p 显微镜获取图像 (图 4b)。根据 gcmp6 的深度和表达水平确定曝光时间和激发光水平 (910 nm), 较弱的信号需要更长的曝光时间和一致的时间分辨率。我们通常使用 ~ 4μs/像素曝光时间。以 3–5 hz 的帧速率获取图像, 分辨率为512x512 像素。
- 开始记录时间序列。在低放大倍率图像中存储每个感兴趣区域 (roi) 相对于血管模式或基准点的坐标。随着时间的推移, 图像的投资回报率相同。执行相同的程序来观察左半球 s1 区域的钙动态。计算每次投资回报率中荧光的变化。
- 单独或作为延时电影获取图像 (图 4c1-c3、d、e)。
- 利用2p 显微镜对注入啮齿类动物尾静脉的荧光糊精染料进行体内皮质血流动力学研究。使用血管作为地标, 在长时间的成像过程中识别和成像相同的 roi。
4. 数据处理
- 使用 imagej 和原点进行图像分析。使用 imagej 导入图像序列 (图 5a/b)。对于单个图像 (或 t 系列电影), 选择成像神经元内的 roi 和附近2个独立区域进行背景测量 (图 5c)。通过投资回报率管理器获得总强度 (图 5c)。
注:图 6显示了具有代表性的钙图像。钙瞬态 (绿色) 和血管 (红色) 显示在不同的时间点在几秒钟内 (图 6a-d)在老鼠在晚上7点在初始窗口安装后。还显示了红色和绿色通道 (图 6e) 或绿色通道 (图 6E) 3分钟录制周期的 z 投影。z 投影显示影片中所有图像的压缩图像, 从中手动选择粗糙和圆形边界 (包括所有帧中感兴趣的对象神经元), 以及选择2个独立的附近背景区域 (图 6g)。 - 从每个 roi 中, 计算平均荧光背景 fb, fb = (FB1+FB2)/2, 以及 soma (f) 的荧光变化, 表示为 f, f/f = (f-fb)/fb。
- 使用 imagej 的功能逐步执行峰值分析, 包括基线校正、峰值查找/确定、峰值积分、峰值拟合和/或省时峰值分析功能。
Representative Results
利用双侧光学窗口, 我们得到了两个独立实验的结果。第一个实验使用了表达 egfp 的小鼠来成像树突状静脉曲张。图 4c1-3显示了光学窗口植入后在不同时间点拍摄的图像示例。请注意, 树突分支和脊柱的数量和位置在2个视图之间非常稳定 (图 4d、 e、z 投影)。
第二个实验使用thy1-gcmp6转基因小鼠测量细胞内钙瞬态, 从而说明如何在体内单个神经元内测量钙生理 (图 6)。这项技术可用于记录和量化位于皮亚下方深达和 gt;500 的 v 层锥体神经元种群的自发活动。随着时间的推移, 平均自发反应 (以每个时间点的平均响应计算) 可以在许多试验中计算。与多电极记录相比, 2p 技术的优点是在很长一段时间内同时检测大的或分散的神经元群的活动, 对大脑的机械干扰很小。
为了生成可接受的平均测量值, 建议进行5–10项试验。试验的数量将取决于对特定刺激的自发反应或固有变异性。如果所有的步骤都严格遵循, 如上所述, 研究人员接受了薄颅骨窗口技术和体内2p 钙成像的培训, 应该能够获得每天1-2 个动物两侧100–200个神经元的记录。
通过峰值分析后, 可以获得每个峰值的实际位置、实际振幅、面积和最大半宽 (fwhm) 等结果集合。
图 1:用于2光子 (2p) 成像的颅内光学窗口组件的示意图.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:原理图显示了准备颅骨窗口的关键步骤.(a) 在解剖显微镜下, 用一把手术剪刀将手术区域上方的皮肤移除。(b) 使用高速微钻头在 s1 区域上方的头骨上产生一个圆形凹槽 (直径3毫米), 直到凹槽内的骨瓣与周围的骨分离。(c) 慢慢取出骨瓣, 露出潜在的硬脑膜。(d) 用2个不同直径的覆盖玻璃组装光学窗口。上覆盖玻璃的直径较大 (5 毫米), 较低的覆盖玻璃 (通常为 1-3) 的直径较小 (3 毫米)。要安装的盖板眼镜的厚度将取决于头骨的厚度。(e) 将覆盖玻璃放在头骨的圆形开口上, 以创建一个光学窗口。盖板的下部应适合在颅骨开口内。盖板的底部应轻轻接触硬脑膜。(f) 用氰基丙烯酸酯胶将窗户边缘密封到头骨上。(g) 氰基丙烯酸酯干燥时, 将黑色牙科水泥侧涂在胶水壁上。(h) 用 ddh2o填充颅窗, 并使用水浸目标进行成像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.在头骨上创建双侧窗户.(a) 照片图像显示, 头骨两侧的2台颅骨光学窗覆盖 s1 区域。(b) 图像盒装区域的高放大倍率 (a), 显示双侧光学窗口, 暴露潜在的硬脑膜和血管。刻度杆 = 680 微米 (c) 暴露的头骨。(d) 创建一个圆形凹槽, 在其中可以看到中央骨瓣。鳞片杆 = 900μm (e) 骨瓣切除后, 颅开口充满人工脑脊液 (acsf)。刻度杆 = 720 微米 (f) 在颅骨开口上安装光学窗口, 并用超级胶水密封窗口边缘。通过光学窗口可以看到硬脑膜和血管。刻度栏 = 600μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:钙和树突成像.(a1)利用血管 (bv) 作为 thy1-gmcmp6 小鼠的地标, 确定感兴趣的区域。(a2)使用相同的地标和记录, 随着时间的推移识别相同的标记单元格 (红色箭头)。(b) 在原代体感镜皮层 (s1) 的神经元 (红色箭头) 中对钙信号的 z 投影。刻度条 = 10μm (c1-3) 在 b6 中显示树突 (绿色) 和血管 (红色)。在光学窗口安装后 1天, 在 s1 区域 ii 层的不同深度的 cg-tg (thy1-yfp) hjrs j。(d) 在1天的时间内, 在同一区域投影多个图像。(e) 在光学窗口安装后 7天, 在同一区域对多个图像进行 z 投影。请注意, 在光学窗口安装后1天至7天之间, 成人刺和树突分支的数量和位置具有显著的稳定性。刻度杆 = c-e 5μm (c-e)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:钙信号追踪.(A、 B)使用 imagej 导入的 t 系列电影的例子, 用于对2个神经元 (分别为神经元1和神经元 2) 进行数据分析。(c) 电子表格显示感兴趣区域 (roi; 神经元内和附近2个独立区域的照明强度数据作为背景措施)。(d) 峰的计算: f/f = (f-fb)/fb, fb = (FB1+FB2)/2 (平均荧光背景 [fb], 以及以 f/f 表示的 soma [f] 的荧光变化)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6.代表性钙图像.(A-D)钙瞬态 (绿色) 和血管 (红色) 在不同的时间点, 以秒为单位在鼠标在7天后安装光学窗口。黄色箭头: 相对不活跃的神经元。白色箭头: 尖刺神经元。(英、法)红色 (血管) 和绿色 (钙) 通道 (e) 和绿色通道 (仅 f) 3分钟记录周期的 z 投影.(g) 标记选定的神经元及其相邻的背景区域。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
双光子成像可在大脑表面以下约800微米的情况下, 以合理的分辨率同时测量许多细胞的活动。我们将2p 和双光学窗口技术与基因编码的 gcmp6 结合起来, 观察位于皮亚下方 v 型神经元 somata 种群中的钙动力学。该方法在头骨两侧都有一个开放的光学窗口, 可以记录对称哺乳动物大脑区域的神经活动, 以便在体内进行长时间稳定的钙成像。该方法的主要方面包括微创手术的性能, 以创建双开放的头骨光学窗口和2p 成像的神经元活动在对称 s1 区域。
研究双侧 s1 区域的网络活动是如何利用双颅窗探测成人大脑在体内的局部和对称信息处理的一个例子。该方法也可用于研究神经元活性 (例如使用thy1-gmcmp6小鼠) 和皮质可塑性 b6。cg-tg (thy1-yfp) hjrs j 从完整的组织中恢复在分离后, 由于单侧中枢神经系统损伤。该方法还可用于检查皮质活性响应周边刺激策略, 如光生, 电或化学刺激。虽然我们只在 s1 区域演示了这一技术, 但这种方法可用于调查活脑中其他对称区域的活动, 如初级运动皮层 (m1) 的 v 层神经元。脑区域重组观察可为自适应运动行为提供神经底物, 对损伤后功能恢复起着至关重要的作用。它还允许长期测量在头固定小鼠的行为过程中基因鉴定细胞的对称活性。
从技术上讲, 研究人员应注意双颅窗的质量和一致性。薄颅骨窗技术12是强烈推荐初学者练习。脊柱是钙的隔间, 因为它们的形态和局部流入和挤压机制。在这项研究中, 我们使用了 b6。以 cg-tg (thy1-yfp) HJrs/J j 小鼠为例, 在体内演示树突状脊柱动力学 (图 4)。开放的头骨玻璃窗可能会导致高脊柱周转和手术后的反应胶质反应 12 。相反, 与薄头骨窗口技术, 刺和树突可以很好地保存。
光学窗口的尺寸和厚度的选择将取决于所需的视野、头骨曲率、头骨厚度和成像类型13。光学覆盖玻璃对硬脑膜的压力不足可能会导致硬脑膜变厚、颅骨再生和大脑运动增加。相反, 光学覆盖玻璃的过度压力可能会阻碍皮质血液流动。
对于光学窗口组装, 胶和固化额外的层覆盖玻璃一次与光学胶粘剂和长波长的紫外线。为了帮助加强粘接, 在孵化器中加热制造的窗口 (50°c, 12小时)。将光学窗覆盖玻璃储存在70% 的乙醇中, 并在手术前用无菌盐水冲洗。在使用之前, 需要检查光学窗口是否有缺陷 (如光学胶粘剂量不正确或对齐不准确), 以避免故障。如果光学胶粘剂太薄, 空气空间可能会被折痕, 这可能会导致光学畸变或在植入时覆盖玻璃脱离。相反, 过多的光学胶粘剂会导致溢出通过颅窗的边缘。
总之, 我们在这里描述了一个实验程序, 测量钙动力学或树突状形态通过颅窗从2个对称的原生体感觉皮质区域在 thy1-gcmp6 和 thy1-yfp 转基因小鼠, 分别使用2p 显微镜。该技术可以极大地促进神经网络复杂的结构和功能关系的剖析。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们非常感谢美国纽约大学医学院生理学和神经科学系 skirball 研究所和医学编辑帕蒂·雷利 (印第安纳州神经外科系) 提供的优秀技术指导大学医学院), 用于编辑手稿。我们感谢陈金辉博士 (美国印第安纳大学医学院斯塔克神经科学研究所) 提供 b6。cg-tg (thy1-yfp) hjrs j 小鼠。这项工作得到了中国济南军区总医院院长基金会的部分支持, pla 2016zd03 (xjl), 和 nih ns05922, ns073636, dod cdmrp w81xwh-12-1-0562, 美国退伍军人部的优异评论奖 i01 bx002356事务, craig h neilsen 基金会 296749, 印第安纳脊髓和脑损伤研究基金会, mari hulman george 捐赠基金 (xmx)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
| B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
| Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
| Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
| Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
| Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
| Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
| Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
| Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
| Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | - | - | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |
References
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