Imaging neurale aktivitet i den primære somatosensoriske Cortex ved hjælp af Thy1-GCaMP6s Transgene mus

Summary

Vi beskriver en eksperimentel metode til måling af neuronal aktivitet gennem dual optiske vinduer over bilaterale primære somatosensoriske corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s Transgene mus bruger 2-foton (2 P) mikroskopi i vivo.

Abstract

Pattedyr hjernen udviser markante symmetri på tværs af sagittale flyet. Detaljeret beskrivelse af neurale dynamics i symmetrisk hjerneregioner i voksne pattedyr dyr er imidlertid fortsat undvigende. I denne undersøgelse, vi beskriver en eksperimentel procedure til måling af calcium dynamics gennem dual optiske vinduer over bilaterale primære somatosensoriske corticies (S1) i Thy1-GCaMP6s Transgene mus ved hjælp af 2-foton (2 P) mikroskopi. Denne metode giver mulighed for optagelser og kvantificeringer af neurale aktivitet i bilaterale mus hjerneregioner én ad gangen i den samme eksperiment for en langvarig periode i vivo. Vigtige aspekter af denne metode, som kan være afsluttet inden for en time, omfatter minimalt invasiv kirurgi procedurer til oprettelse af dobbelt optisk windows og brug af 2P billeddannelse. Selv om vi kun viser teknikken i området S1, kan metoden anvendes til andre regioner i den levende hjerne letter udredning af strukturelle og funktionelle kompleksiteten af hjernens neurale netværk.

Introduction

Calcium og dets forordning er afgørende i mægle flere fysiologiske processer. Overvågning calcium dynamics er nyttige for at forstå normal hjernefunktion samt patologiske tilstande i hjernen lidelser ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. Imaging GCaMP6s Fluorescens er et kraftfuldt værktøj til kvantificering af spike numre, timing, og hyppighed, samt niveauer af synaptic input både in vitro- og i vivo ^9,10,11.

Pattedyr hjernen udviser markante symmetri på tværs af sagittale flyet. Selv om nyere neurologisk forskning har kastet lys over den kortikale remodellering og neuronal aktivitet udløst af traumatisk hjerne eller rygmarv skade ^6,7, roller, intakt væv af symmetrisk spiller tilsvarende regioner i opsving er stadig uklare.

I denne undersøgelse beskriver vi eksperimentelle procedurer for at skabe bilaterale symmetrisk optisk windows for i vivo billeddannelse. Brug disse optiske vinduer, beskriver vi måling af calcium dynamics fra primære somatosensoriske cortex (S1) i GCaMP6s Transgene mus ved hjælp af 2P mikroskopi. I afsnittet resultater viser vi også i vivo dendritiske morfologi på forskellige tidspunkter i regionen S1 i EGFP Transgene mus ved hjælp af 2 P billeddannelse. Metoden observation vedrørende netværk dynamik i de bilaterale S1 områder er men en indledende eksempel hvordan dual åbne kraniel Vinduer vil hjælpe neuroforskere at sonde lokale og symmetrisk informationsbehandling i den voksne pattedyr hjerne i normal betingelser eller i forskellige sygdom modeller in vivo.

Protocol

Alle kirurgiske og animalske håndteringsprocedurerne blev udført som godkendt i henhold til vejledningen for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (National Research Council) og retningslinjerne fra Indiana University skole af medicin institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget. Den skematisk illustration af 2-foton imaging setup er vist i figur 1.

1. forberede dyret til billedbehandling

1. Placer steril gaze, bomuld svaberprøver og autoklaveres kirurgiske værktøjer i området kirurgi (tabel 1). Drej på en Micro perle Sterilizer for intersurgery Sterilisation af kirurgiske værktøjer.
2. Bedøver mus (han- eller hunstik, 1,5-2,5 måneder, 20-25 g) af intraperitoneal injektion (i.p.) af en blanding af ketamin (17,2 mg/mL), xylazin (0.475 mg/mL) og Acepromazin (0.238 mg/mL) (6 µL/g kropsvægt). Vent, indtil den korrekte dybde af anæstesi er nået, når dyret ophører med at reagere på en tå knivspids stimulus og har ingen cornea refleks. Under operationen, give en booster dosis af 1/3 den oprindelige dosis af narkose cocktail som nødvendig for at opretholde den oprindelige bedøvelsesmiddel tilstand.
3. Injicere buprenorphin subkutant (s.c.; 0,05-0,10 mg/kg) som et smertestillende middel forud for operationen. Anvende beskyttende salve for øjnene af dyret til at forhindre hornhinde tørring og grå stær dannelse.
4. Placer en GCaMP6s Transgene mus på en varmepude at forhindre hypotermi og dække det med en steril kirurgiske drapere. Stabilisere dyrets hoved med et hoved holder adapter til mus.
5. Barbere hovedet over det meste af hovedbunden med en dobbelt-kant barberblad. Rense den kirurgisk område med en steril alkohol forberedelse pad efterfulgt af povidon-jodopløsning.

2. kronisk kraniel vindue forberedelse

1. Gøre et rektangulært tilskåret i hovedbunden (2 mm x 3 mm) med en saks på den ene side (højre) af kraniet. Skubbe huden til side med en vatpind til at oprette et udsat område af > 3 mm i diameter (figur 3A). Fjerne bindevæv knyttet til kraniet ved forsigtigt skrabe kraniet med en stump microsurgical blade (skalpel klinge #10; Figur 3 c).
2. Markere området S1 ved forsigtigt tegne en cirkel (3 mm i diameter, center koordinering:-1.5 mm fra bregma og 2,5 mm fra midterlinjen) på kraniet ved hjælp af en dental bore (figur 2B).
3. Udføre den samme procedure på venstre kraniet (figur 2B).
4. Påfør et tyndt lag af ren Super lim til knogle til at give en base for dental cement program.
5. Under et dissekere mikroskop, tynde ned en cirkulær groove i kraniet omkring S1 området ved hjælp af en højhastigheds microdrill (figur 3D). Formålet er at skabe en jævn kant til placering af en optisk vindue til det.
6. Gentagne gange anvende kunstige cerebrospinalvæske (ACSF, stuetemperatur) til kraniet periodisk under den udtynding proces at lette boring og sprede varmen. Udføre boringen periodisk for at undgå gnidninger-induceret overophedning. Sutte væk knogle snavs med en house vakuum linje eller en vakuumpumpe.
7. Efter ca 2/3 dybde af knoglen er boret, langsomt og omhyggeligt tynd den resterende 1/3 ben indtil en cirkulær stykke af kraniet (knogle flap) er helt fri fra de omkringliggende kraniet.
8. Langsomt og forsigtigt fjerne cirkulære knogle flap med et par af # 5/45 pincet og udsætte dura (figur 2 c; Figur 3E).
9. Holde regionen udsatte hjernen fugtig med ACSF (figur 3). Undgå skader pial fartøjer, da blødning vil ændre cerebral blodgennemstrømning, fremskynde hjernen hævelse og alvorligt forringe billeddiagnostiske kvalitet.
10. Udføre den samme procedure i venstre (kontralaterale) side af kraniet.
11. For montering af optiske vindue, bruge optisk selvklæbende lim og helbrede mellem daekglas lag én ad gangen. Hvis det er nødvendigt, varm det optiske vindue (50 ° C til 12 h) i en inkubator til at forbedre den klæbende limning. Den optiske vindue indeholder 2 dele: den øverste del indeholder en enkelt runde dækning glas med en diameter på 5 mm og den nederste del indeholder 1 – 3 runde dækning glas med en diameter på 3 mm (figur 2D).
12. Gemme den optiske vindue i ethanol (70%, vol/vol) og skyl det med sterilt saltvand før brug. Før optiske vindue installation, indskrive den optiske vindue for mangler, herunder et forkert beløb af optiske klæbende eller unøjagtige justering under en Stereoskopet.
13. Installere det optiske vindue over regionen kraniotomi (figur 2D). Den øverste del af vinduet optisk hviler på kraniet og den nederste del af vinduet optisk passer ind i den craniotomized åbning og hviler på dura i overværelse af CSF (figur 2D, E).
14. Forsegle den øverste del af den optiske vindue kant til kraniet med ren Super lim (figur 2F; Figur 3F).
15. Når ren Super limen er tørret, anvende sort dental cement (Dentsply) til at dække glas kant. Gælde alle udsatte kraniet dental cement og sår margener til at blokere lys (figur 2 g-H; Figur 3B).
16. Udføre den samme procedure i venstre side.
17. Tillade, at dyr til at gendanne på den hede afrivningsblok og returnere dyret til sit hjem bur til inddrivelse under passende overvågning. Give anti-afholdsmand næring for at lette tygge og hydrering. For at mindske smerter, administrere buprenorphin s.c. (0,05-2,0 mg/kg) hver 8-12 h postinjury for 2 dage. Tillad musen til at inddrive for yderligere 7 – 10 dage før billeddannelse.

3. to-foton billedbehandling

1. På dagen for eksperimentet, bedøver dyr med ketamin og xylazin (doser og vedligeholdelse af anæstesi som beskrevet ovenfor). Rengøre vinduet kranie med 75% (vol/vol) ethanol.
2. Placer musen under en billeddannelse set-up bestående af 2P mikroskop og hoved holder adapter, hvilende på en varmepude med hovedet immobiliseret gennem øret barer fastgjort til musen hovedet indehaver.
3. Image en side af den optiske vindue ad gangen. For at minimere optiske aberrationer, Sørg for at den optiske vindue og højre kranium er orienteret vinkelret på den optiske akse af mikroskopet.
4. Tage en indledende billede af vinduet kranie med lysfelt belysning på 4 x forstørrelse som et reference kort for registrering med højere forstørrelse 2P angiographies (figur 4A1).
5. Zoome ind på området af interesse ved hjælp af 10 x forstørrelse (figur 4A2).
6. Vælg et område af interesse i området S1 i kortikale lag I eller II (op til 150 µm under pial overfladen). Hvis højere forstørrelse ønskes, skal du bruge en 20 X mål.
7. Søgning efter et synsfelt med flere neuroner. Erhverve billeder ved hjælp af en 2P mikroskop (figur 4B). Bestemme eksponeringstid og excitation lysniveau (≈910 nm) baseret på dybden og udtryk niveau af GCaMP6s, med svage signaler kræver længere eksponeringstider og konkurrenceloven mindre tidsopløsning. Vi bruger typisk ~ 4 µs pr. pixel eksponering gange. Erhverve billeder på billedhastigheder på 3 – 5 Hz med en opløsning på 512 × 512 pixel.
8. Begynde at optage tidsserierne. Gemme koordinaterne for hver region af interesse (ROI) i forhold til de vaskulære mønster eller fiducial punkter i lav forstørrelse billeder. Billede af samme ROI over tid. Udføre den samme procedure for at observere calcium dynamikken i S1 område på venstre hjernehalvdel. Beregne ændringerne i fluorescens fra hver ROI.
9. Erhverve billeder, enten individuelt eller som en time-lapse film (figur 4 c1-C3, D, E).
10. Undersøgelse kortikale blood flow dynamics i vivo af imaging fluorescerende dextran farvestoffer indsprøjtes halen vene af gnavere med 2 P mikroskopi. Brug vasculatures som vartegn til at genkende og billed den samme ROI i imaging sessioner over lange perioder.

4. databehandling

1. Bruge ImageJ og oprindelse billedanalyse. Importere billedsekvenser med ImageJ (figur 5A-B). For enkelte billeder (eller t-serien film), Vælg en ROI inden for en afbildet neuron og 2 separate i nærheden regioner for baggrunden måling (figur 5 c). Erhverve samlede intensitet med en ROI manager (figur 5C).
   Bemærk: Figur 6 viser repræsentative calcium billeder. Calcium forbigående (grøn) og blodkar (rød) viser på forskellige tidspunkter i sekunder (figur 6A-D) i en mus på 7 d efter den indledende vindue installation. Z-projektion af en 3 min optagelse periode for røde og grønne kanaler (figur 6E) eller grøn kanal (figur 6F) er også vist. En z-fremskrivning viser et komprimeret billede af alle billeder i filmen som en ru og cirkel grænse (omfatter objekt neuron interesse for alle rammer) vælges manuelt samt valg af 2 uafhængige i nærheden baggrund regioner ( Figur 6 g).
2. Hver ROI, beregnes den gennemsnitlige fluorescens baggrund FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 og fluorescens ændringer af soma (F) udtrykt som ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Udføre peak analyse trinvist ved hjælp af funktioner af ImageJ herunder Baseline korrektion, Peak konstatering/bestemmelse, Peak Integration, Peak montering og Time-Saving Peak analysefunktioner.

Representative Results

Ved hjælp af bilaterale optisk vinduet, opnåede vi resultater fra 2 separate eksperimenter. Det første eksperiment ansat EGFP-udtrykker mus til billede dendritiske varicosities. Figur 4 c 1-3 viser eksempler på billeder taget på forskellige tidspunkter efter optiske vindue implantation. Bemærk, at antallet og placeringen af dendritiske grene og pigge er bemærkelsesværdigt stabilt mellem de 2 visninger (figur 4D, E, z-projektion).

Det andet eksperiment ansat Thy1 -GCaMP6s Transgene mus til at måle den intracellulære calcium forbigående, hvilket illustrerer hvordan calcium fysiologi kan måles inden for en enkelt neuron i vivo (figur 6). Denne teknik kan bruges til at registrere og kvantificere spontane aktivitet i populationer af lag V pyramideformet neuroner beliggende på så dybt som > 500 µm nedenfor pia. Gennemsnitlige spontane svar over tid (beregnet som de gennemsnitlige svar på hvert tidspunkt) kan beregnes på tværs af mange forsøg. 2P teknik har fordelen, at afsløre aktivitet samtidigt i store eller spredte neuronal befolkninger over en længere periode med lille mekanisk forstyrrelse på hjernen i forhold til multielectrode optagelser.

For at generere et acceptabelt gennemsnitlig måling, anbefales 5 – 10 forsøg. Antallet af forsøg vil være afhængig af spontane reaktioner eller iboende variation af reaktionerne på en bestemt stimulation. Hvis alle trin følges strengt, som beskrevet ovenfor, en forsker uddannet i både tyndet kraniet kraniel vindue teknik og i vivo 2 P calcium imaging bør kunne få optagelser af 100 – 200 neuroner på begge sider fra 1 – 2 dyr pr. dag.

Efter peak analyse, kan en samling af resultaterne som den rigtige placering af peak, den virkelige amplitude, område og den fulde bredde på halv maksimum (FWHM) for hver top opnås.

Figur 1 : Skematisk illustration af komponenterne i et kranie optiske vindue for 2-foton (2P) billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Skematiske tegning viser vigtige trin til at forberede en kraniel vindue. (A) Under et dissekere mikroskop, fjerne huden over den kirurgisk område ved hjælp af et par kirurgisk saks. (B) Brug et højhastigheds microdrill at producere en cirkulær groove (3 mm i diameter) på kraniet over området S1 indtil knoglen flap i rillen bliver løsrevet fra den omkringliggende knogle. (C) langsomt fjerne knogle klap for at afdække de underliggende dura. (D) Saml den optiske vindue med coverglasses med 2 forskellige diametre. Den øverste daekglas har en større diameter (5 mm) og de lavere coverglasses (normalt 1-3) har en mindre diameter (3 mm). Tykkelsen af coverglasses er installeret vil være afhængig af tykkelsen af kraniet. (E) sted daekglas på rund åbning i kraniet til at oprette en optisk vindue. Den nederste del af coverglasses skal passe i den kranielle åbning. Bunden af coverglasses skal forsigtigt kontakte dura. (F) Seal vinduet kanter til kraniet med ren lim.. (G) når ren tørrer, anvende sort dental cement lateral til lim væg. (H) udfylde vinduet kranie med ddH₂O og bruge vand-fordybelse mål for billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 . Oprettelse af bilaterale windows på kraniet. (A) A fotografisk billede viser 2 kranie optiske vinduer på hver side af kraniet overliggende området S1. (B) høj forstørrelse af billedet (A) boxed regionen viser bilaterale optisk windows udsætter den underliggende dura og blodkar. Skalalinjen = 680 µm. (C) eksponerede kraniet. (D) oprettelsen af en cirkulær groove, inden for hvilken en central knogle klap er set. Skalalinjen = 900 µm. (E) efter fjernelse af knogle flap, kraniel åbningen var fyldt med kunstige cerebrospinalvæske (ACSF). Skalalinjen = 720 µm. (F) Installation af den optiske vindue over den kranielle åbning og lukning kanten af vinduet med superlim. Dura og blodkar, der er synlige gennem det optiske vindue. Skalalinjen = 600 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Calcium og dendritiske imaging. (A1) Identificere regioner af interesse ved hjælp af blodkar (BV) som vartegn i Thy1-GCaMP6s mus. (A2) Identificere de samme mærkede celler (røde pile) over tid ved hjælp af samme vartegn og post. (B) repræsentant Z-projektion af calciumsignaler i neuroner (røde pile) af den primære somatosensoriske cortex (S1). Skalalinjen = 10 µm. (C1-3) visualisering af dendritter (grøn) og en (rød) i B6 blodkar. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J på forskellige dybder i layer II i regionen S1 på 1 dag efter optiske vindue installation. (D) Z-projektion af flere billeder på samme region på 1 dag. (E) Z-projektion af flere billeder på samme region 7 dage efter den optiske vindue installation. Bemærk den bemærkelsesværdige stabilitet i antallet og placeringen af voksen pigge og dendritiske grene mellem 1 dag og 7 dage efter optiske vindue installation. Skalalinjen = C-E 5 µm (C-E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Calcium signal sporing. (A, B) Eksempler på importerede t-serien film med ImageJ til dataanalyse af 2 neuroner (neuron 1 og neuron 2, henholdsvis). (C) en regneark viser data på belysning intensitet fra region af interesse (ROI; inden for neuron og 2 separate i nærheden regioner som baggrund foranstaltninger). (D) beregning af peak: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (den gennemsnitlige fluorescens baggrund [FB] og fluorescens ændringer af soma [F] udtrykt ΔF/F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 . Repræsentative calcium billeder. (A-D) Calcium forbigående (grøn) og blodkar (røde) på forskellige tidspunkter i sekunder i en mus på 7 dage efter den optiske vindue installation. Gul pil: en relativt mindre aktive neuron. Hvid pil: en spiking neuron. (E, F) Z-projektion af en 3 min optagelse periode for den røde (blodkar) og grønne (calcium) kanaler (E) og grønne kanal kun (F). (G) markerede neuroner og deres tilstødende baggrund områder er markeret. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

To-foton imaging giver samtidig måling af aktiviteten af mange celler med en rimelig opløsning på op til ca. 800 µm under hjernen overflade. Vi integreret 2P og en dobbelt optisk vindue teknik med genetisk kodet GCaMP6s at observere calcium dynamics i populationer af lag V neuronal somata beliggende > 500 µm nedenfor pia. Med et åbent optiske vindue på hver side af kraniet kan metoden optagelser af neurale aktivitet på tværs af symmetrisk pattedyr hjerneregioner for længerevarende og stabil calcium imaging in vivo. Vigtige aspekter af denne metode omfatter udførelsen af minimalt invasiv kirurgi til at oprette dual åbne kraniet optiske vinduer og 2P billeddannelse af neuronal aktivitet i symmetriske S1 regioner.

Undersøge netværksaktivitet i bilaterale S1 regioner er et eksempel på hvordan dual kraniel windows kan bruges til at probe lokale og symmetrisk informationsbehandling i den voksne hjerne in vivo. Denne metode kan også bruges til at studere neuronal aktivitet (f.eks. ved hjælp af Thy1 -GCaMP6s mus) og cortical plasticitet B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J fra intakt væv af de tilsvarende symmetrisk regioner i bedring efter deafferentation på grund af en ensidig CNS skade. Metoden kan også bruges til at undersøge kortikale aktivitet som svar på perifer stimulation strategier såsom optogenetic, elektriske eller kemiske stimulering. Selv om vi kun viser teknikken i området S1, kunne denne tilgang anvendes til at undersøge aktiviteter i andre symmetrisk områder i den levende hjerne som lag V neuroner i den primære motor cortex (M1). Bemærkninger om omlægning af områder af hjernen kan fastsætte en neurale substrat adaptive motor adfærd, som spiller en afgørende rolle i postinjury inddrivelse af funktion. Det giver også mulighed for kronisk måling af genetisk identificerede cellerne symmetriske aktivitet under opførsel i hoved-fast mus.

Teknisk, efterforskere bør betale opmærksomhed til kvalitet og konsistens af dobbelt kraniel windows. Tyndet kraniet kraniel vindue teknik ¹² er stærkt anbefales til begyndere til praksis. Pigge er calcium rum på grund af deres morfologi og lokale tilstrømning og ekstrudering mekanismer. I denne undersøgelse brugte vi B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J mus som et eksempel for at vise dendritiske rygsøjlen dynamics i vivo (figur 4). En åben-kraniet glas vindue installation kan forårsage høj ryg omsætning og reaktive glial svar efter kirurgi ¹². Derimod med tyndet kraniet vindue teknik, kan pigge og dendrites blive godt bevaret.

Valg af dimensioner og tykkelser af optiske windows vil være afhængig af den ønskede synsfelt, kraniet krumning, skull tykkelse og type af imaging ¹³. Utilstrækkelig pres af den optiske coverglasses på dura kan forårsage fortykkelse af dura, genvækst af kraniet, og øget hjerne bevægelse. I modsætning, kan overdreven pres af den optiske coverglasses hæmme kortikale blodgennemstrømning.

For optiske vindue forsamling, lim og helbrede yderligere lag af coverglasses, en ad gangen med optiske limen og lang bølgelængde UV-lys. For at bidrage til at styrke klæbende limning, varm vinduet fabrikerede (50 ° C til 12 h) i en inkubator. Gemme optiske vindue daekglas i 70% (vol/vol) ethanol, og før operationen, skyl det med sterilt saltvand. Vinduet optisk behov skal undersøges for mangler (såsom en forkert mængde af optiske klæbende eller unøjagtige justering) under en Stereoskopet før brugen for at undgå fiasko. Hvis den optiske limen er for tynd, kan luft rum være krøllet, hvilket kan forårsage optiske aberrationer eller cover glas udstationering på implantation. Derimod kan for meget optiske limen forårsage overløb forbi kanten af vinduet kranie.

I sammendrag, her beskriver vi en eksperimentel procedure til måling af calcium dynamics eller dendritiske morfologi gennem kraniel vinduer fra 2 symmetriske primære somatosensoriske kortikale regioner i Thy1-GCaMP6s og Thy1- YFP Transgene mus, henholdsvis, ved hjælp af 2P mikroskopi. Denne teknik kan i høj grad lette dissekere det komplekse strukturelle og funktionelle forhold af neurale netværk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.