Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

Summary

Мы описываем экспериментальной процедуры для измерения активности нейронов через двойной Оптические окна выше двусторонних первичной соматосенсорные corticies (S1) в Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей с использованием 2-Фотон (2 P) микроскопии в естественных условиях.

Abstract

Мозг млекопитающих экспонатов отмеченные симметрии в сагиттальной плоскости. Тем не менее подробное описание динамики нейронной в симметричных мозга у взрослых млекопитающих животных остается труднодостижимой. В этом исследовании, мы описываем экспериментальной процедуры для измерения динамики кальция через двойной Оптические окна выше двусторонних первичной соматосенсорные corticies (S1) в Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей с помощью микроскопии (2 P) 2-Фотон. Этот метод позволяет записи и количественной нейронной активности в регионах мозга двусторонних мыши один в то время в том же эксперимент для длительного периода в естественных условиях. Ключевые аспекты этого метода, который может быть завершен в течение часа, включают процедуры минимально инвазивной хирургии для создания двойной оптический windows и использования изображений 2P. Хотя мы только продемонстрировать технику в районе S1, метод может применяться в других регионах мозга жизни, содействия прояснению структурной и функциональной сложности мозга нейронных сетей.

Introduction

Кальция и его регулирования имеют важное значение в урегулировании нескольких физиологических процессов. Мониторинг динамики кальция полезно для понимания функции нормального мозга, а также патологические состояния мозга расстройств ^{1,2,3,4,5,6 ,,78}. Imaging флуоресценции GCaMP6s является мощным инструментом для количественной оценки Спайк чисел, времени, и частоту, а также уровень синаптического ввода как in vitro и in vivo ^9,10,11.

Мозг млекопитающих экспонатов отмеченные симметрии в сагиттальной плоскости. Несмотря на последних исследованиях неврологических пролить свет на корковых ремоделирования и активности нейронов вызвано травматического головного или спинного мозга травмы ^6,7, роли, неповрежденной ткани симметрично соответствующих регионов играть в восстановления являются по-прежнему неясными.

В этом исследовании мы описываем экспериментальной процедуры для создания двусторонних симметричных оптических windows для изображений в естественных условиях . С помощью этих оптических окон, мы описываем измерения динамики кальция из первичного соматосенсорные коре (S1) в GCaMP6s трансгенных мышей с использованием 2P микроскопии. В разделе результаты мы также показывают в vivo дендритных морфология в разное время точек в регионе S1 EGFP трансгенных мышей с использованием 2 P визуализации. Метод наблюдения относительно сети динамика в области двусторонних S1 является лишь первоначальный пример как двойной открытых окон, черепной поможет неврологи зонда местных и симметричной обработки информации в взрослого мозга млекопитающих в нормальных условия или в различных заболеваний моделей в естественных условиях.

Protocol

Все хирургические и животных обработки процедуры выполнялись, утвержденных согласно руководству для ухода и использования лабораторных животных (Национальный исследовательский совет) и руководящих принципах Индиана университета Школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитета. Схематическая Иллюстрация изображения установки 2-Фотон показан на рисунке 1.

1. Подготовка животного для изображений

1. Стерильные марлевые место, ватные тампоны и автоклавного хирургические инструменты в области хирургии (Таблица 1). Включите микро шарик стерилизатор для intersurgery стерилизации хирургических инструментов.
2. Анестезировать мыши (мужского или женского пола, 1,5 – 2,5 месяца, 20 – 25 g) внутрибрюшинной инъекции (и.п.) смеси кетамин (17,2 мг/мл), Ксилазина (0.475 мг/мл) и acepromazine (0,238 мг/мл) (6 мкл/г веса тела). Подождите, пока надлежащего глубины анестезии достигается, когда животное перестает реагировать на мыс щепотку стимулом и имеет не роговицы рефлекс. Во время операции, дать бустерной дозы 1/3 первоначальная доза коктейль как цистит необходимо поддерживать исходное состояние анестезии.
3. Подкожно вводить бупренорфин (s.c.; 0,05-0,10 мг/кг) как болеутоляющее агента до операции. Применять защитные мази в глаза животного, чтобы не образовывались роговицы сушки и катаракты.
4. Место GCaMP6s трансгенные мыши на грелку для предотвращения переохлаждения и накрыть стерильные хирургические пелерина. Стабилизируйте голова животного с главой холдинга адаптер для мышей.
5. Бритье головы над большей частью волосистой части головы с лезвием бритвы двойной края. Очистите зоне хирургические стерильные спиртом салфеткой подготовки, следуют повидон йод раствор.

2. хронический черепной окно подготовки

1. Сделайте прямоугольный разрез кожи головы (2 x 3 мм) с ножницами на одной стороне (справа) черепа. Нажмите сторону кожи ватным тампоном для создания экспозиции области > 3 мм в диаметре (рис. 3A). Удалите в соединительной ткани, прилагается к черепу нежно соскабливания черепа с тупым микрохирургическое лезвием (скальпель лезвие #10; Рисунок 3 c).
2. Марк области S1, нежно Рисование круга (3 мм в диаметре, центр координации: -1,5 мм от bregma и 2,5 мм от средней линии) на черепа с помощью Стоматологическая сверла (рис. 2B).
3. Выполните ту же процедуру на левой черепа (рис. 2B).
4. Нанесите тонкий слой Цианакрилатный клей супер кости для обеспечения основы для стоматологического цемента приложения.
5. Под микроскопом рассечения тонкие вниз круговой паз в черепа вокруг области S1, используя высокоскоростной microdrill (рис. 3D). Цель заключается в том, чтобы создать гладкие края для размещения оптического окна на него.
6. Неоднократно применять искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО, комнатной температуры) к черепу периодически во время процесса прореживания для облегчения бурения и рассеивать тепло. Выполните бурение периодически, чтобы избежать трения индуцированной перегрева. Сосать вне мусора кости с дом разрежением или вакуумного насоса.
7. После приблизительно 2/3 глубины кости сверлится, медленно и осторожно тонкие кости оставшиеся 1/3 до тех пор, пока круговой часть черепа (костного лоскута) является полностью свободным от окружающих черепа.
8. Медленно и осторожно удалите круговой кости лоскут с парой # 5/45 щипцов и разоблачить Дура (рис. 2 c; Рисунок 3E).
9. Держите подвергаются мозга регионе влажным с Фаго (Рисунок 3E). Избегайте повреждений сетчаточных судам, поскольку кровоизлияния изменения мозгового кровотока, ускорит отек мозга и серьезно ухудшить качество изображения.
10. Выполните ту же процедуру на левой стороне (контралатеральной) черепа.
11. Для монтажа оптического окна, используйте оптический клей клей и лечения между coverglass слоями один на один раз. При необходимости, теплый Оптические окна (50 ° C за 12 ч) в инкубаторе для повышения клеевое соединение. Оптическое окно содержит 2 части: Верхняя часть содержит один раунд крышки стекла с диаметром 5 мм и в нижней части содержит 1-3 круглая крышка очки с диаметром 3 мм (рис. 2D).
12. Хранить оптическое окно в этаноле (70%, vol/vol) и промойте его с стерильного физиологического раствора перед использованием. Перед установкой оптических окон проверьте оптическое окно на недостатки, включая неправильное количество оптических выравнивание клей или неточной под стереоскоп.
13. Установите оптический окно над районом Краниотомия (Рисунок 2D). В верхней части окна оптических лежит на черепе и в нижней части окна оптических вписывается в craniotomized открытия и опирается на Дура присутствии CSF (Рисунок 2D, E).
14. Печать в верхней части край оптического окна черепа с Цианакрилатный клей супер, (Рисунок 2F; Рисунок 3F).
15. Когда Цианакрилатный клей супер высохнет, применять черный стоматологического цемента (Dentsply) для покрытия края стекла. Применить стоматологического цемента для всех выставленных черепа и ранение поля блокировать свет (Рисунок 2 g-H; Рисунок 3B).
16. Выполните ту же процедуру с левой стороны.
17. Разрешить животное, чтобы восстановить на грелку и вернуть его домой клетку для восстановления при необходимости мониторинга животного. Предоставлять мокрый продовольствие для облегчения жевания и гидратации. Чтобы уменьшить боль, администрировать бупренорфин s.c. (0,05 – 2,0 мг/кг) каждые 8-12 h посттравматические за 2 дня. Позволяет мыши, чтобы восстановить еще 7-10 дней до изображений.

3. два фотонных изображений

1. В день эксперимента анестезировать животное с кетамином и ксилазина (дозы и поддержание анестезии, как описано выше). Очистите окно черепа с 75% (vol/vol) этанола.
2. Поместите курсор мыши под изображений установка, состоящая из 2P микроскоп и холдинг адаптер голову, опираясь на грелку с его головкой, иммобилизованные через ухо баров, придает мыши держатель.
3. Одна сторона изображения Оптические окна одновременно. Чтобы свести к минимуму оптических аберраций, убедитесь, что оптические окна и правой черепа, ориентированные перпендикулярно оптической оси микроскопа.
4. Сфотографировать первоначального окна черепа с яркой области освещения при 4-кратном как Справочная карта для регистрации с выше увеличение 2P ангиографий (1рис. 4A).
5. Увеличение области интересов, используя 10 крат (2рис. 4A).
6. Выберите область интереса в области S1 в кортикального слоя I или II (до 150 мкм ниже поверхности сетчаточных). Если увеличение, используйте объектив с 20 X.
7. Поиск поля зрения с несколькими нейронами. Получение изображений с помощью микроскопа 2P (рис. 4В). Определите время экспозиции и уровень света возбуждения (≈910 Нм), основанный на глубину и уровень экспрессии GCaMP6s, с более слабых сигналов, требующих длительного времени экспозиции и согласно меньше времени резолюции. Мы обычно используем ~ 4 микросекунды на пиксель выдержек. Получение изображений с частотой кадров 3 – 5 Гц с разрешением в 512 × 512 пикселей.
8. Начните запись временных рядов. Хранить координаты каждого региона интерес (ROI) относительно сосудистого рисунка или координатных точек в малое увеличение изображения. Образ же рентабельность инвестиций с течением времени. Выполните ту же процедуру наблюдать динамику кальция области S1 на левом полушарии. Рассчитайте изменения в флуоресцировании от каждого ROI.
9. Получать изображения, либо индивидуально, либо как промежуток времени фильм (Рисунок 4 c1-C3, D, E).
10. Исследования коры головного мозга крови поток динамика в vivo изображения Краски флуоресцентные декстрана вводят в Вену хвост грызунов с 2 P микроскопии. Используйте vasculatures в качестве достопримечательности признать и изображения же ROI в imaging сессий в течение длительного периода времени.

4. обработка данных

1. Используйте для анализа изображений ImageJ и происхождения. Импорта последовательностей изображений с ImageJ (Рисунок 5A-B). Для отдельных изображений (или t серия фильмов) выберите ROI в образ нейрон и 2 отдельных соседних регионов для фона измерения (рис. 5 c). Приобрести общая интенсивность с диспетчером ROI (рис. 5C).
   Примечание: На рисунке 6 показан представитель кальция изображений. Кальция переходные (зеленый) и сосудов (красный) Показать в разное время точки в секундах (рис. 6A-D) в мыши на 7 d после первоначального окна установки. Показано также z проекция периода 3 мин записи для каналов Красный и зеленый (рис. 6E) или зеленый канал (рис. 6F). Z проекция отображает сжатый образ всех изображений в фильм, из которого грубой и круг границы (включая объект нейрон интерес во всех кадрах) выбран вручную а также выбор независимых близлежащие регионы фон ( 2 Рисунок 6 g).
2. От каждого ROI, рассчитать среднее флуоресценции фон FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 и изменения флюоресценции Сома (F) в виде ΔF/Ф, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Выполните анализ пик, шаг за шагом с помощью функций ImageJ, включая коррекция базовой линии, пик вывод/определение, интеграции пик, пик фитинг или функции анализа пик Time-Saving.

Representative Results

С помощью окна двусторонним оптическим, мы получили результаты из 2 отдельных экспериментов. Первый эксперимент занятых EGFP-выражая мышей, чтобы изображение дендритных варикоз. Рисунок 4 c 1-3 приводятся примеры изображений, полученных в разное время точках после имплантации оптическое окно. Обратите внимание, что количество и расположение дендритных филиалов и колючки удивительно стабильной, между 2 видами (рис. 4 d, E, z проекция).

Второй эксперимент работало Thy1 -GCaMP6s трансгенных мышей для измерения внутриклеточного кальция, переходные, таким образом, иллюстрирующие, как кальций физиологии могут быть измерены в пределах одного нейрона в vivo (рис. 6). Этот метод может использоваться для записи и количественно спонтанной активности в популяций пирамидных нейронов слоя V расположен в так глубоко как > 500 мкм ниже pia. Средняя спонтанной реакции со временем (рассчитывается как средняя ответы в каждый момент времени) может быть рассчитана через многочисленные испытания. 2P метод имеет преимущество выявления деятельности одновременно в больших или рассредоточенных нейрональных популяций в течение продолжительного периода с мало механического нарушения головного мозга по сравнению с многоэлектродный записей.

Для создания приемлемого среднего измерения, рекомендуются 5 – 10 испытаний. Количество судебных процессов будет зависеть спонтанной реакции или присущих изменчивости ответов на конкретной стимуляции. Если все шаги выполняются строго, как описано выше, исследователь подготовку в обоих разбавлять череп черепа окно технике и в естественных условиях 2 P кальция изображения должны быть в состоянии получить записи 100 – 200 нейронов с обеих сторон от 1 – 2 животных в день.

После анализа пик можно получить коллекцию результатов как реальное местоположение пик, реальный амплитуды, области и полную ширину на половину максимального (FWHM) для каждого пика.

Рисунок 1 : Схематическая иллюстрация компонентов черепной Оптические окна для визуализации 2-Фотон (2P). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Схематический чертеж показывает основные шаги для подготовки окно черепной. (A) под микроскопом рассечения, снять кожу над районом хирургические, используя хирургические ножницы. (B) использования высокоскоростной microdrill производить круговой паз (диаметр 3 мм) на черепе над районом S1 до мозга костей заслонки внутри канавки становится отделены от окружающих кость. (C) медленно удалить кости заслонки для предоставления базовой Дура. (D) Соберите оптическое окно с coverglasses с 2 разных диаметров. Верхняя coverglass имеет больший диаметр (5 мм) и Нижняя coverglasses (обычно 1-3) имеют меньший диаметр (3 мм). Толщина coverglasses для установки будет зависеть от толщины черепа. Место coverglass на круглое отверстие черепа (E) для создания оптических окно. В нижней части coverglasses должны умещаться в черепной открытия. В нижней части coverglasses осторожно следует связаться Дура. (F) Печать окна края череп с Цианакрилатный клей. (.G) когда Цианакрилатный высохнет, применять сбоку черный стоматологического цемента стену клеем. (H) заполнить окна черепа с ddH₂O и использовать цели погружения в воду для воображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . Создание двусторонних окон на черепе. (A) A фотографическое изображение показывает 2 черепных Оптические окна на каждой стороне черепа, обволакивающие области S1. (B) высокое увеличение в штучной упаковке региона изображения (A) показаны двусторонних Оптические окна, подвергая базовых Дура и кровеносных сосудов. Шкалы бар = 680 мкм. (C) подвергаются черепа. (D) Создание круговой паз, в рамках которой рассматривается откидной Центральный кости. Шкалы бар = 900 мкм. (E) после удаления костного лоскута, черепной открытия был заполнен с искусственным спинномозговой жидкости (ФАГО). Шкалы бар = 720 мкм. (F) Установка оптического окна над черепной открытия и уплотнение края окна с супер клей. Дура и кровеносные сосуды видны через оптическое окно. Шкалы бар = 600 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Кальция и дендритных томографии. (А1) Определить регионы интереса, используя кровеносных сосудов (BV) в качестве ориентиров в Thy1-GCaMP6s мышей. (А2) Определите те же надписью клетки (красные стрелки) со временем, используя те же достопримечательности и запись. (B) представитель Z-проекция кальция сигналов нейронов (красные стрелки) первичной соматосенсорной коры (S1). Шкалы бар = 10 мкм. (C1-3) визуализация дендритов (зеленый) и кровеносный сосуд (красный) в B6. CG-Tg (Thy1- рекламы ЯФП) HJrs/J на разных глубинах в слое II S1 региона на 1 день после установки оптического окна. (D) Z-проекция нескольких изображений в одном регионе на 1 день. (E) Z-проекция нескольких изображений на того же региона в 7 дней после установки оптического окна. Обратите внимание, замечательную стабильность число и местоположение Взрослый колючки и дендритных ветви между 1 день и 7 дней после установки оптического окна. Шкалы бар = C-E 5 мкм (C-E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Кальция сигнала трассировки. (A, B) Примеры импортированных t серии фильмов с ImageJ для анализа данных 2 нейронов (нейрон 1 и нейрон 2, соответственно). (C) A таблицы показывает данные по интенсивности освещения от региона интерес (ROI; в нейрон и 2 отдельных близлежащие регионы как фон меры). (D) расчет пик: ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (средняя флуоресценции фон [FB] и изменения флюоресценции Сома [F], выраженный в виде ΔF/F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 . Представитель кальция изображений. (A-D) Кальция переходные (зеленый) и кровеносных сосудов (красный) в разное время точки в секундах в мышь в 7 дней после установки оптического окна. Желтая стрелка: относительно менее активным нейрона. Белая стрелка: пики нейрона. (E, F) Z-проекция периода записи 3 мин для красного (кровеносных сосудов) и зеленый (кальций) каналов (E) и зеленый канал только (F). (G) выбранные помечены нейронов и их смежных фоновых районах. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Двух фотонных изображений позволяет одновременное измерение активности многих клеток на разумной резолюции на до приблизительно 800 мкм ниже поверхности мозга. Мы интегрировали 2P и двойное оптическое окно техника с генетически закодированный GCaMP6s соблюдать кальция динамика популяций нейронов somata слой V расположен > 500 мкм ниже pia. С открытым оптическим окном на каждой стороне черепа метод позволяет записи нейронной активности регионов симметричный млекопитающих мозга для продолжительного и стабильной кальция, изображений в vivo. Ключевые аспекты этого метода включают в себя производительность минимально инвазивной хирургии для создания оптических окон двойной открытой черепа и 2P изображений нейронной активности регионов симметрично S1.

Анализ сетевой активности в двусторонних S1 регионах является пример того как двойной черепной windows могут быть использованы для зонда местных и симметричной обработки информации в взрослого мозга в vivo. Этот метод также может использоваться для изучения активности нейронов (например с помощью Thy1 -GCaMP6s мышей) и пластичность коры головного мозга B6. CG-Tg (Thy1- рекламы ЯФП) HJrs/J от неповрежденной ткани соответствующего симметричного регионов в восстановлении после деафферентация из-за односторонних травмы ЦНС. Этот метод может также использоваться для изучения корковой активности в ответ на периферийных стимуляции стратегии, такие как optogenetic, электрические или химические стимуляцию. Хотя мы только продемонстрировать технику в районе S1, этот подход можно было бы использовать для расследования деятельности в других областях симметричного в живой мозг таких нейронов слоя V первичной моторной коры (M1). Замечания по реорганизации мозга может предоставить нейронных субстрат для адаптивной мотор, который играет решающую роль в посттравматические восстановления функции. Она также позволяет для хронических измерение симметричных активности клеток генетически выявленных во время поведение в голову Исправлена мышей.

Технически следователи следует уделять пристальное внимание к качеству и согласованности двойной черепной windows. Разбавлять череп черепа окна технику ¹² настоятельно рекомендуется для начинающих на практике. Колючки являются отсеков кальция из-за их морфологии и местные механизмы приток и экструзии. В этом исследовании мы использовали B6. CG-Tg (Thy1- рекламы ЯФП) мышах HJrs/J в качестве примера для демонстрации дендритных позвоночника динамика в vivo (рис. 4). Открыть череп стекла окна Установка может привести к высокой позвоночника оборот и реактивной глиальных ответы после хирургии ¹². В отличие от этого с техникой окно разбавлять череп, колючки и дендритов могут быть хорошо сохранились.

Выбор размеров и толщины оптических окон будет зависеть желаемого поля зрения, кривизны черепа, черепа толщина и тип изображений ¹³. Недостаточное давление оптических coverglasses на дура может вызвать утолщение Дура, отрастания черепа и увеличение мозга движения. В отличие от избыточного давления оптического coverglasses могут препятствовать корковых кровотока.

Оптические окна Ассамблеи клей и вылечить дополнительные слои coverglasses, один за один раз с оптическим клей и длинноволновых ультрафиолетового света. Чтобы помочь укреплению клеевое соединение, теплые окна изготовлены (50 ° C за 12 ч) в инкубаторе. Хранить coverglass оптическое окно в этанол 70% (vol/vol) и до операции, промойте его с стерильного физиологического раствора. Оптические окна необходимо изучить на недостатки (например, неправильное количество оптических выравнивание клей или неточной) под стереоскоп перед использованием, чтобы избежать неудачи. Если оптический клей слишком тонкий, воздушные пространства может быть увеличилась, могут вызвать оптических аберраций или Стекло покровное отряд в имплантации. Напротив слишком много оптических клей может вызвать переполнение прошлое края окна черепной.

Таким образом, здесь мы опишем экспериментальной процедуры для измерения динамики кальция или дендритных морфологии черепа окон от 2 симметричный первичной соматосенсорной коры регионов в Thy1-GCaMP6s и Thy1- рекламы ЯФП трансгенных мышей, соответственно с помощью микроскопии 2P. Этот метод может значительно облегчить, пройдя сложные структурные и функциональные отношения нейронных сетей.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.