Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

Summary

Nous décrivons une procédure expérimentale pour mesurer l’activité neuronale à travers les fenêtres optiques doubles au-dessus corticies somatosensoriel primaire bilatérale (S1) en Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques à l’aide de 2 photons (2p) microscopie in vivo.

Abstract

Le cerveau des mammifères pièces marquées de symétrie dans le plan sagittal. Toutefois, la description détaillée de la dynamique de neurones dans des régions de cerveau symétrique animaux mammifères adultes reste insaisissable. Dans cette étude, nous décrivons une procédure expérimentale pour mesurer la dynamique du calcium à travers les fenêtres optiques doubles au-dessus corticies somatosensoriel primaire bilatérale (S1) en Thy1-GCaMP6s de souris transgéniques au microscope (2p) 2 photons. Cette méthode permet aux enregistrements et analyses quantitatives de l’activité neuronale dans les régions du cerveau de souris bilatéral un à la fois dans la même expérience pour une longue période en vivo. Principaux aspects de cette méthode, qui peut être complétée en une heure, prévoient des procédures de chirurgie mini-invasive pour créer des fenêtres optiques doubles et l’utilisation de l’imagerie de 2p. Bien que nous ne démontrons que la technique dans le domaine de S1, la méthode peut être appliquée à d’autres régions du cerveau vivant facilitant l’élucidation de complexité structurale et fonctionnelle des réseaux de neurones cérébraux.

Introduction

Calcium et son règlement sont essentiels dans la médiation de plusieurs processus physiologiques. Contrôle dynamique du calcium est utile pour comprendre le fonctionnement normal du cerveau ainsi que certaines pathologies du cerveau troubles ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. Imagerie de fluorescence GCaMP6s est un outil puissant pour quantifier le nombre de spike, chronométrage, et fréquence, ainsi que des niveaux de synaptique d’entrée aussi bien in vitro et in vivo ^9,10,11.

Le cerveau des mammifères pièces marquées de symétrie dans le plan sagittal. Bien que la recherche neurologique récente a mis en lumière sur le remodelage cortical et l’activité neuronale déclenchée par traumatique cerveau ou la moelle épinière lésions ^6,7, les rôles que le tissu intact de symétriquement régions correspondantes jouer en recouvrement sont encore obscures.

Dans cette étude, nous décrivons les procédures expérimentales pour créer bilatérales symétriques fenêtres optiques pour l’imagerie in vivo . À l’aide de ces fenêtres optiques, nous décrivons la mesure de la dynamique du calcium des cortex somatosensoriel primaire (S1) en GCaMP6s des souris transgéniques à l’aide de la microscopie 2p. Dans la section résultats, nous montrons également in vivo la morphologie dendritique à des moments différents dans la région de S1 chez les souris transgéniques EGFP 2p imagerie. La méthode d’observation au sujet de la dynamique de réseau dans les zones de S1 bilatérales est qu’un premier exemple de comment double fenêtre crânienne ouverte aidera neuroscientifiques pour sonder d’information locale et symétrique dans le cerveau des mammifères adultes dans des conditions normales conditions ou dans la maladie de différente modèles in vivo.

Protocol

Toutes les procédures de traitement chirurgical et animaux ont été effectuées tel qu’approuvé en vertu du Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals (National Research Council) et les lignes directrices de l’Indiana University School of Medicine institutionnels Animal Care et l’utilisation Comité. L’illustration schématique de l’installation d’imagerie 2 photons est illustrée à la Figure 1.

1. préparation de l’Animal pour l’imagerie

1. Placez une gaze stérile, cotons-tiges et des instruments chirurgicaux stérilisés à l’autoclave dans le domaine de la chirurgie (tableau 1). Allumez une Micro perle stérilisateur pour intersurgery stérilisation des instruments chirurgicaux.
2. Anesthésier la souris (mâle ou femelle, 1,5 à 2,5 mois, 20 à 25 g) par injection intrapéritonéale (i.p.) d’un mélange de kétamine (17,2 mg/mL), de xylazine (0,475 mg/mL) et d’acépromazine (0,238 mg/mL) (6 µL/g de poids corporel). Attendez que la profondeur de l’anesthésie est atteint lorsque l’animal cesse de répondre à un stimulus de pincée d’orteil et n’a aucun réflexe cornéen. Au cours de la chirurgie, donner une dose de rappel du 1/3 la dose initiale de l’anesthésique cocktail comme nécessaire pour maintenir l’état anesthésique original.
3. Injecter la buprénorphine par voie sous-cutanée (s.c. ; 0,05 à 0,10 mg/kg) comme agent analgésique avant la chirurgie. Pommade protectrice aux yeux de l’animal pour empêcher la formation de séchage et de cataracte cornée.
4. Placez une souris transgénique GCaMP6s sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie et le recouvrir d’un drap stérile chirurgical. Stabiliser la tête de l’animal avec un adaptateur de Holding de tête de souris.
5. Se raser la tête dans la majeure partie du cuir chevelu avec un grattoir à lame double. Nettoyer la zone chirurgicale avec un tampon de préparation d’alcool stérile suivi de solution de povidone-iode.

2. chronique fenêtre crânienne préparation

1. Faites une coupe rectangulaire du cuir chevelu (2 x 3 mm) avec une paire de ciseaux sur un côté (à droite) du crâne. Pousser la peau côté avec un coton-tige pour créer un espace d’exposition de > 3 mm de diamètre (Figure 3 a). Retirez le tissu conjonctif attaché au crâne en grattant doucement le crâne avec une lame émoussée microchirurgicale (lame de bistouri Swann-Morton n ° 10 ; La figure 3).
2. Délimiter la zone de S1 en appuyant doucement sur un cercle (3 mm de diamètre, centre de coordination :-1,50 mm le bregma et 2,5 mm de la ligne médiane) sur le crâne à l’aide d’un dentaire percer (Figure 2 b).
3. Effectuez la même procédure sur le crâne de gauche (Figure 2 b).
4. Appliquer une fine couche de colle Super cyano à l’OS pour fournir une base pour l’application de ciment dentaire.
5. Sous un microscope à dissection, diluer une rainure circulaire dans le crâne autour de la zone de S1 à l’aide d’un microforages à grande vitesse (Figure 3D). Le but est de créer un bord lisse pour le placement d’une fenêtre optique dessus.
6. S’applique à plusieurs reprises artificiel liquide céphalo-rachidien (ACSF, température ambiante) au crâne périodiquement pendant le processus d’amincissement pour permettre de semer et de dissiper la chaleur. Effectuer le forage par intermittence pour éviter toute friction induite par la surchauffe. Sucez loin les débris osseux avec une ligne vide de la maison ou une pompe à vide.
7. Après avoir une profondeur d’environ 2/3 de l’OS est percée, lentement et soigneusement mince l’OS 1/3 restant jusqu'à ce qu’une pièce circulaire du crâne (lambeau osseux) est offert gratuitement sur le crâne environnant.
8. Lentement et soigneusement retirer le lambeau osseux circulaire avec une paire de pinces # 5/45 et exposer la dure-mère (Figure 2; Figure 3E).
9. La région du cerveau exposé garder humide avec ACSF (Figure 3E). Éviter d’endommager les vaisseaux pial, puisque l’hémorragie sera modifie le flux sanguin cérébral, accélérer le gonflement de cerveau et gravement dégrader la qualité de l’imagerie.
10. Effectuez la même procédure sur le côté gauche (controlatéral) du crâne.
11. Pour assembler la fenêtre optique, utiliser l’adhésif optique à colle et cure entre couches de lamelle un à la fois. Si nécessaire, réchauffez la fenêtre optique (50 ° C pendant 12 h) dans un incubateur pour renforcer le collage. La fenêtre optique comprend 2 parties : la partie supérieure contient un seul verre couvercle rond d’un diamètre de 5 mm et la partie inférieure contient 1 – 3 verres de couverture rondes avec un diamètre de 3 mm (Figure 2D).
12. Stocker la fenêtre optique dans l’éthanol (70 % vol/vol) et le rincer avec du sérum physiologique stérile avant utilisation. Avant l’installation de fenêtre optique, vérifiez la fenêtre optique par rapport aux défauts, y compris un montant erroné d’alignement optique d’adhésif ou inexact dans un stéréoscope.
13. Installer la fenêtre optique au-dessus de la région de craniotomie (Figure 2D). La partie supérieure de la fenêtre optique repose sur le crâne et la partie inférieure de la fenêtre optique s’inscrit dans l’ouverture de craniotomized et repose sur la dure-mère en présence de CSF (Figure 2D, E).
14. Sceller la partie supérieure de la bordure de fenêtre optique pour le crâne avec le Cyanoacrylate Super Glue (Figure 2F; Figure 3F).
15. Lorsque le Cyanoacrylate Super colle est sèche, appliquer le ciment dentaire noir (Dentsply) pour couvrir le bord du verre. Appliquer le ciment dentaire sur tout le crâne exposé et blesser les marges pour bloquer la lumière (Figure 2-H; Figure 3 b).
16. Effectuez la même procédure sur le côté gauche.
17. Permettre à l’animal de récupérer sur le coussin chauffant et regagner sa cage maison pour récupération sous une surveillance appropriée de l’animal. Fournir de la nourriture humide pour faciliter la mastication et l’hydratation. Pour réduire la douleur, administrer la buprénorphine l.c. (0,05 – 2,0 mg/kg) chaque postinjury de 8 à 12 h pendant 2 jours. Permettre à la souris pour récupérer les 7 à 10 jours avant l’imagerie.

3. deux photons d’imagerie

1. Le jour de l’expérience, anesthésier l’animal avec la kétamine et de xylazine (doses et l’entretien de l’anesthésie, comme décrit ci-dessus). Nettoyer la fenêtre crânienne avec éthanol 75 % (vol/vol).
2. Placez votre souris sous un système d’imagerie consistant en un microscope 2p et l’adaptateur de tenir tête, reposant sur un coussin chauffant avec sa tête immobilisée par le biais de barres d’oreilles attachés à un support de tête de souris.
3. Un côté de la fenêtre optique d’image à la fois. Pour minimiser les aberrations optiques, assurez-vous que la fenêtre optique et le crâne de droite sont orientés perpendiculairement à l’axe optique du microscope.
4. Prendre une photo initiale de la fenêtre crânienne avec illumination du champ lumineux à un grossissement de x 4 comme une carte de référence d’enregistrement avec coronarographie de 2p grossissement plus élevé (Figure 4 a1).
5. Zoomez sur la zone d’intérêt en utilisant un grossissement de x 10 (Figure 4 a2).
6. Sélectionnez un domaine d’intérêt dans la zone S1 en couches corticales I ou II (jusqu'à 150 µm au-dessous de la surface pial). Si un grossissement supérieur est souhaité, utilisez un objectif 20 X.
7. Vous recherchez un champ de vision avec plusieurs neurones. Acquisition d’images à l’aide d’un microscope de P 2 (Figure 4 b). Déterminer la durée d’exposition et le niveau d’excitation lumineuse (≈910 nm) basé sur la profondeur et le niveau d’expression de GCaMP6s, avec des signaux plus faibles nécessitant des temps d’exposition et aujourd'hui moins de résolution temporelle. Nous utilisons généralement ~ 4 µs par temps d’exposition de pixel. Acquérir des images à une vitesse de 3 à 5 Hz avec une résolution de 512 × 512 pixels.
8. Commencer à enregistrer les séries temporelles. Stocker les coordonnées de toutes les régions d’intérêt (ROI) par rapport au modèle vasculaire ou aux points de repères dans des images de faible grossissement. Image du ROI même au fil du temps. Effectuez la même procédure pour observer la dynamique du calcium de la zone de S1 sur l’hémisphère gauche. Calculer les changements de fluorescence de chaque ROI.
9. Acquérir des images à titre individuel ou comme un film time-lapse (Figure 4,1-C3, D, E).
10. Étudier sanguin cortical flux dynamique in vivo par imagerie colorants fluorescents dextran injectés dans la veine caudale des rongeurs avec la microscopie 2p. Utiliser vasculatures comme repères pour reconnaître et le retour sur investissement même dans l’imagerie des séances durant de longues périodes d’image.

4. traitement des données

1. Utilisez ImageJ et origine pour l’analyse de l’image. Importez des séquences d’images avec ImageJ (Figure 5 a-B). Pour les images individuelles (ou des films de la série t), sélectionnez un retour sur investissement dans un neurone imagé et 2 distincts à proximité de régions pour la mesure de fond (Figure 5). Acquérir une intensité totale avec un gestionnaire de ROI (Figure 5C).
   Remarque : La Figure 6 montre des images représentatives de calcium. Transitoires de calcium (vert) et des vaisseaux sanguins (rouge) montrent à des moments différents en secondes (Figure 6 a-D) chez une souris au 7D après l’installation initiale de la fenêtre. La z-projection d’une période d’enregistrement de 3 min pour les canaux rouge et verts (Figure 6E) ou le canal vert (Figure 6F) est également montrée. Une projection z affiche une image compressée de toutes les images dans le film, d'où une limite rugueux et cercle (englobant le neurone objet d’intérêt dans tous les cadres) est sélectionnée manuellement ainsi que la sélection des 2 indépendantes dans les régions de fond ( voisines Figure 6).
2. De chaque ROI, calculer le fond moyenne de fluorescence FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 et les changements de fluorescence du soma (F) exprimée en ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Effectuer l’analyse de pointe, étape par étape en utilisant les fonctions d’ImageJ, y compris la Correction de la ligne de base, Peak conclusion/détermination, intégration Peak, Peak Fitting ou Time-Saving fonctions d’analyse de pointe.

Representative Results

À l’aide de la fenêtre optique bilatérale, nous avons obtenu des résultats de 2 expériences distinctes. La première expérience employé exprimant EGFP souris pour varicosités dendritiques image. Figure 4 1-3 donne des exemples d’images prises à des moments différents après l’implantation de la fenêtre optique. Notez que le nombre et la localisation des ramifications dendritiques et épines sont remarquablement stables entre les 2 vues (Figure 4, E, z-projection).

La seconde expérience employé Thy1 -GCaMP6s des souris transgéniques pour mesurer le calcium intracellulaire transitoire, ce qui illustre comment la physiologie du calcium peut être mesurée au sein d’un seul neurone en vivo (Figure 6). Cette technique permet d’enregistrer et de quantifier l’activité spontanée dans les populations de neurones pyramidaux de la couche V situés à aussi profond que > 500 µm au-dessous de l’assembly pia. Les réponses spontanées moyennes au fil du temps (calculé selon les réponses moyens à chaque point dans le temps) peuvent être calculées à travers de nombreux essais. La technique de 2p a l’avantage de détecter l’activité simultanément dans des populations de neurones dispersées ou grandes sur une longue période avec peu de perturbations mécaniques au cerveau par rapport aux enregistrements multi-électrodes.

Pour générer une mesure moyenne acceptable, 5 à 10 essais sont recommandés. Le nombre de procès dépendra des réponses spontanées ou variabilité inhérente des réponses à une stimulation particulière. Si toutes les étapes sont suivies strictement, comme décrit ci-dessus, un chercheur formé dans les deux technique de fenêtre crânienne éclaircis-crâne et in vivo l’imagerie calcique 2p devrait être en mesure d’obtenir les enregistrements de 100 – 200 neurones des deux côtés de 1 à 2 animaux par jour.

Après l’analyse de pointe, une collection de résultats tels que l’emplacement réel de la crête, l’amplitude réelle, la région et la largeur à mi-hauteur (FWHM) pour chaque pic peut être obtenue.

Figure 1 : Illustration schématique des composants d’une fenêtre crânienne optique pour l’imagerie 2 photons (2p). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dessin schématique montre les étapes clés pour préparer une fenêtre crânienne. (A) sous un microscope à dissection, enlever la peau sur la région chirurgicale à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux. (B) Utilisez un microforages haute vitesse pour produire une rainure circulaire (diamètre 3 mm) sur le crâne au-dessus de la zone S1 jusqu'à l’OS rabat dans la rainure se détache de l’OS environnant. (C) retirer lentement le lambeau osseux pour exposer la dure-mère sous-jacente. (D) monter la fenêtre optique avec lamelles couvre-objets avec 2 diamètres différents. La lamelle supérieure a un diamètre plus grand (5 mm) et les bas lamelles couvre-objets (habituellement 1-3) ont un diamètre plus petit (3 mm). L’épaisseur de la lamelles couvre-objets à installer sera tributaire de l’épaisseur du crâne. (E) Place le couvre-objet sur l’ouverture circulaire du crâne pour créer une fenêtre optique. La partie inférieure de la lamelles couvre-objets doit s’insérer dans l’ouverture crânienne. La partie inférieure de la lamelles couvre-objets doit contacter doucement la dure-mère. Sceau (F) la fenêtre bords sur le crâne avec de la colle cyanoacrylate. (G) lorsque le cyanoacrylate sèche, appliquer noir ciment dentaire latérale sur le mur de colle. (H) remplir la fenêtre crânienne avec FD₂O et objectifs immersion dans l’eau utilisation pour l’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 . Création de fenêtres bilatérales sur le crâne. (A) A image photographique montre 2 crâniennes fenêtres optiques de chaque côté du crâne recouvrant la zone S1. (B) fort grossissement de la région en boîte de l’image (A) montrant les fenêtres optiques bilatéraux exposant la dure-mère sous-jacente et les vaisseaux sanguins. Echelle = 680 µm. (C), le crâne exposé. (D) la création d’une rainure circulaire dans lequel on voit un lambeau de l’OS central. Echelle = 900 µm. (E) après l’enlèvement du lambeau osseux, l’ouverture crânienne était rempli de liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA). Echelle = 720 µm. (F) Installation de la fenêtre optique sur l’ouverture crânienne et le bord de la fenêtre avec la super colle d’étanchéité. La dure-mère et les vaisseaux sanguins sont visibles à travers la fenêtre optique. Echelle = 600 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Calcium et imagerie dendritique. (A1) Identifier les zones d’intérêt à l’aide de vaisseaux sanguins (BV) comme points de repère en Thy1-GCaMP6s souris. (A2) Identifier les cellules marquées mêmes (flèches rouges) au fil du temps en utilisant les mêmes points de repère et enregistrement. (B) représentant Z-projection des signaux de calcium dans les neurones du cortex somatosensoriel primaire (S1) (flèches rouges). Echelle = 10 µm. (C1-3) visualisation des dendrites (verts) et d’un vaisseau sanguin (rouge) en B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J à différentes profondeurs dans la couche II de la région de S1 à 1 jour après l’installation de fenêtre optique. (D) Z-projection de plusieurs images à la même région à 1 jour. (E) Z-projection de plusieurs images à la même région à 7 jours après l’installation de fenêtre optique. Noter la remarquable stabilité du nombre et l’emplacement des épines adultes et ramifications dendritiques entre 1 jour et 7 jours après l’installation de fenêtre optique. Echelle = C-E 5 µm (C-E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Suivi de signal calcium. (A, B) Exemples de films de série t importées avec ImageJ pour l’analyse de données de 2 neurones (1 et 2, respectivement). (C), une feuille de calcul montre des données sur l’intensité de l’éclairage de la région d’intérêt (ROI ; dans le neurone et 2 distincts dans les régions voisines, comme mesures de fond). (D) calcul du pic : ΔF/F = (F-FB) / FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 (le fond moyenne de fluorescence [FB] et les changements de fluorescence du soma [F] exprimée en ΔF/F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 . Images de calcium représentatif. (A-D) Transitoire de calcium (vert) et les vaisseaux sanguins (rouges) à des moments différents en quelques secondes dans une souris à 7 jours après l’installation de fenêtre optique. Flèche jaune : un neurone relativement moins actif. Flèche blanche : un neurone de fortification. (E, F) Z-projection d’une période d’enregistrement de 3 min pour les rouges (vaisseaux sanguins) et les canaux de vert (calcium) (E) et les couche verte seulement (F). (G) sélectionnés sont marqués les neurones et leurs zones d’arrière-plan adjacent. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Deux photons imagerie permet la mesure simultanée de l’activité de plusieurs cellules à une résolution raisonnable jusqu'à environ 800 µm sous la surface du cerveau. Nous avons intégré 2p et une technique de double fenêtre optique avec GCaMP6s génétiquement encodée d’observer la dynamique du calcium chez des populations de corps cellulaires neuronaux de couche V situés > 500 µm au-dessous de l’assembly pia. En ouvrant une fenêtre optique de chaque côté du crâne, la méthode permet aux enregistrements de l’activité neurale dans toutes les régions du cerveau des mammifères symétrique pour le calcium stable et prolongée d’imagerie in vivo. Principaux aspects de cette méthode incluent 2p imagerie de l’activité neuronale et de la performance de la chirurgie mini-invasive pour créer des fenêtres optiques double crâne ouvert dans les régions de S1 symétriques.

Examen de l’activité du réseau dans les régions de S1 bilatérales est qu'un exemple de comment dual windows crâniennes pourrait servir à sonde de traitement dans le cerveau adulte in vivode l’information locale et symétrique. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier l’activité neuronale (par exemple en utilisant des souris Thy1 -GCaMP6s) et la plasticité corticale B6. CG-Tg (Thy1- YFP) HJrs/J de tissus intacts des régions symétriques correspondantes dans la récupération après la désafférentiation due à une lésion unilatérale de la CNS. La méthode peut aussi servir à examiner l’activité corticale en réponse à des stratégies de stimulation périphérique tels qu’optogenetic, les stimulations électriques ou chimiques. Bien que nous ne démontrons que la technique dans le domaine de la S1, cette approche pouvait être employée pour enquêter sur des activités dans d’autres domaines symétriques dans le cerveau vivant comme les neurones de la couche V du cortex moteur primaire (M1). Observations sur la réorganisation des régions du cerveau peuvent fournir un substrat neuronal pour comportement moteur adaptatif, qui joue un rôle essentiel dans la postinjury rétablissement de la fonction. Il permet aussi de mesure chronique de l’activité symétrique des cellules génétiquement identifiés lors de comportement chez les souris à tête fixe.

Techniquement, les enquêteurs devraient payer une attention particulière à la qualité et la cohérence de doubles fenêtres crâniennes. Aminci-crâne fenêtre crânienne technique ¹² est hautement recommandé pour les débutants à la pratique. Épines sont des compartiments de calcium à cause de leur morphologie et leur mécanismes locaux d’influx et d’extrusion. Dans cette étude, nous avons utilisé la B6. Souris de HJrs/J CG-Tg (Thy1- YFP) à titre d’exemple pour démontrer une épine dendritique dynamics in vivo (Figure 4). Une installation de fenêtre de verre ouvert-crâne peut provoquer le chiffre d’affaires élevé de colonne vertébrale et réponses gliales réactives après chirurgie ¹². En revanche, avec la technique de la fenêtre d’éclaircis-crâne, épines et les dendrites peuvent être bien conservés.

Choix des dimensions et épaisseurs des fenêtres optiques sera dépendantes sur le champ de vision souhaité, la courbure du crâne, l’épaisseur de crâne et le type d’imagerie ¹³. Une pression insuffisante de l’optique lamelles couvre-objets sur la dure-mère peut provoquer un épaississement de la dure-mère, repousse du crâne et a augmenté le mouvement de cerveau. En revanche, une pression excessive de l’optique lamelles couvre-objets susceptibles d’entraver le débit sanguin cortical.

Pour bloc optique fenêtre, coller et guérir des couches supplémentaires de lamelles couvre-objets, un à la fois avec adhésif optique et la lumière UV de longueur d’onde. Afin de renforcer le collage, réchauffer la fenêtre fabriquée (50 ° C pendant 12 h) dans un incubateur. Stocker la lamelle de fenêtre optique dans l’éthanol à 70 % (vol/vol) et, avant la chirurgie, le rincer avec du sérum physiologique stérile. La fenêtre optique doit être examinée par rapport aux défauts (par exemple un montant erroné d’alignement optique d’adhésif ou inexact) sous un stéréoscope avant utilisation pour éviter les pannes. Si la colle optique est trop mince, des espaces d’air peut être plissés, le qui peut provoquer des aberrations optiques ou détachement de la lamelle couvre-objet à l’implantation. En revanche, trop adhésif optique peut provoquer de débordement au-delà des bords de la fenêtre crânienne.

En résumé, nous décrivons ici une procédure expérimentale pour mesurer la dynamique du calcium ou morphologie dendritique à travers les fenêtres crâniennes de 2 symétriques primaires somatosensorielles régions corticales dans Thy1-souris transgéniques YFP - GCaMP6s et Thy1, respectivement, à l’aide de la microscopie 2p. Cette technique peut grandement faciliter la complexe relation structurale et fonctionnelle des réseaux neuronaux de dissection.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain.
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	-	-	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.