Summary
양국 주 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 신경 활동을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경에서 vivo에서를 사용 하 여.
Abstract
포유류 두뇌는 화살 비행기에 걸쳐 표시 된 대칭을 전시 한다. 그러나, 성인 포유류 동물에 대칭 뇌 영역에서 신경 역학에 대 한 자세한 설명을 애매 남아 있습니다. 본이 연구에서는 양자 기본 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 칼슘 역학을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경을 사용 하 여. 이 메서드는 머리말을 붙인 기간 비보에대 한 동일한 실험에서 한 번에 녹음 및 양자 마우스 뇌 영역 하나에에서 신경 활동의 quantifications을 수 있습니다. 한 시간 안에 완료 될 수 있는이 방법의 주요 측면 듀얼 광 창과 2 P 이미징의 사용을 만들기 위한 최소 침 습 수술 절차를 포함 합니다. 우리만 S1 영역에서 기술 설명, 비록 메서드를 촉진 하는 뇌 신경망의 구조와 기능 복잡 한 설명 살아있는 두뇌의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.
Introduction
칼슘 및 그것의 규칙 여러 생리 적 프로세스를 중재에 필수적입니다. 칼슘 역학을 모니터링 하는 것은 뇌 질환 1,2,3,,45,6의 병 적인 조건 뿐만 아니라 정상적인 뇌 기능을 이해 하는 데 유용 ,,78. GCaMP6s 형광 이미징 스파이크 번호, 타이밍, 측정을 위한 강력한 도구 이며 시 냅 스의 수준 뿐만 아니라 주파수, 생체 외에서 그리고 vivo에서 9,,1011을 입력 합니다.
포유류 두뇌는 화살 비행기에 걸쳐 표시 된 대칭을 전시 한다. 최근 신경 연구는 대뇌 피 질의 개장에 빛을 발산 하 고 신경 활동에 의해 발생 외상 성 두뇌 또는 척수 부상 6,7을 역할의 그 본래 조직 대칭으로 해당 지역 재생 복구에 여전히 모호한 있습니다.
이 연구에서 우리가 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 양측 대칭 광학 윈도 만드는 실험 절차를 설명 합니다. 이러한 광학 창을 사용 하 여, 우리 설명 기본 somatosensory 외피가 (S1)에서 칼슘 역학을 측정 하는 GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 P 현미경을 사용 하 여. 결과 섹션에서 우리는 또한 EGFP 유전자 변형 쥐 2 P 이미지를 사용 하 여 S1 영역에서 다른 시간 지점에서 vivo에서 수지상 형태를 보여줍니다. 양자 S1 영역에 네트워크 역동성에 관한 관찰 메서드는 초기 예 하지만 어떻게 듀얼 오픈 두개골 창의 정상에 포유류 두뇌의 처리 지역 및 대칭 정보를 신경 도움이 될 것입니다. 조건 또는 다른 질병에서 vivo모델.
Protocol
모든 수술 및 동물 취급 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 연구 위원회)의 인디애나 대학 학교의 약 기관 동물 관리 및 사용 지침에 대 한 가이드 아래 승인으로 수행한 위원회입니다. 2 광자 영상 설치의 도식 적인 그림은 그림 1에 표시 됩니다.
1. 영상에 대 한 동물을 준비합니다.
- 수술 영역 (표 1)에 멸 균 거 즈, 면봉, 고 압력가 수술 도구를 배치 합니다. 수술 도구 intersurgery 살 균을 위한 마이크로 비드 소독 기를 켭니다.
- 케 타 민 (17.2 mg/mL), xylazine (0.475 mg/mL) 및 acepromazine (0.238 mg/mL) (6 µ L/g 몸 무게)의 혼합물의 복 주사 (i.p.) 마우스 (남성 또는 여성, 1.5-2.5 개월, 20-25 g)을 anesthetize. 동물 발가락 꼬집어 자극에 응답 하 고 없이 각 막 반사 마 취의 적절 한 깊이 도달할 때까지 기다립니다. 수술 동안 주고 부스터 복용량 1/3의 마 취약으로 칵테일의 원래 복용량 원래 마 취 상태를 유지 하는 데 필요한.
- Buprenorphine를 피하 주사 (사우스 캐롤라이나, 0.05-0.10 mg/kg) 수술 전 진통 대리인으로. 각 막 건조, 백 내장 형성을 방지 하기 위해 동물의 눈을 보호 연 고를 적용 합니다.
- 저체온증을 방지 하기 위해 커버 메 마른 외과 용 드 레이프와 난방 패드에 GCaMP6s 유전자 변형 마우스를 놓습니다. 생쥐 머리 들고 어댑터와 동물의 머리를 고정 시켜야 합니다.
- 대부분의 두 번에 지 면도날으로 두 피에 머리를 면도. Povidone-요오드 솔루션 다음 살 균 알코올 준비 패드와 함께 외과 영역을 청소.
2. 만성 두개골 창 준비
- 두 피 (2 m m x 3 m m)의 직사각형 잘라 한쪽 (오른쪽)의 두개골에가 위를 확인 합니다. 노출 영역을 만들려면 면봉으로 옆으로 피부를 밀어 > 3 m m 직경 (그림 3A). 부드럽게 무딘 microsurgical 블레이드 (메스 블레이드 #10;와 두개골 된다고 하 여 두개골에 연결 하는 결합 조직 제거 그림 3C)입니다.
- 부드럽게 원을 그려 S1 영역 표시 (3 m m 직경, 센터 조정:는 bregma와는 중간에서 2.5 m m-1.5 m m)는 치과 사용 하 여 두개골에 드릴 (그림 2B).
- 왼쪽된 두개골 (그림 2B)에 동일한 절차를 수행 합니다.
- 치과 시멘트 응용 프로그램에 대 한 기초를 제공 하기 위해 뼈에 Cyanoacrylate 슈퍼 접착제의 얇은 층을 적용 됩니다.
- 해 현미경 원형 홈 고속 microdrill (그림 3D)를 사용 하 여 S1 주변 두개골에 아래로 얇은. 목적은 그것에 광학 창의 배치에 대 한 부드러운 가장자리를 만드는 것입니다.
- 반복 시추 촉진 하 여 열을 방산 숱이 과정 정기적으로 두개골 인공 척수 (실제, 실 온) 적용 됩니다. 간헐적으로 마찰 유도 과열 방지를 위해 드릴링을 수행 합니다. 집 진공 라인 또는 진공 펌프와 뼈 파편 떨어져 빨 아.
- 뼈의 약 2/3 깊이 뚫고 후 천천히 그리고 신중 하 게 얇은 나머지 1/3 뼈까지 (뼈 플랩) 두개골의 원형 조각 주변의 두개골에서 완전히 무료입니다.
- 천천히, 그리고 신중 하 게 # 5/45 집게의 쌍으로 원형 뼈 플랩을 제거 하 고 경질 (그림 2C; 노출 그림 3E)입니다.
- 노출 된 뇌 영역 실제 (그림 3E)와 촉촉한 유지. 이후 출혈 뇌 혈액 흐름을 변경, 붓기, 뇌를 가속 되며 심각 하 게 이미지 품질이 저하 pial 배에 어떤 손상을 하지 마십시오.
- 두개골 (contralateral) 왼쪽에 동일한 절차를 수행 합니다.
- 광 창 조립, 광학 접착제 접착제 및 사이 coverglass 레이어 하나 한 번에 치료를 사용 합니다. 필요한 경우, 따뜻한 접착성 접합을 강화 하는 인큐베이터에 광 창 (50 ° C 12 h에 대 한). 2 부분을 포함 하는 광학 창: 윗부분 5 m m의 직경을 가진 단일 라운드 커버 유리를 포함 하 고 하단 부분 직경 3 mm (그림 2D)와 1-3 라운드 커버 안경 포함.
- 광 창 에탄올 (70%, vol/vol)에 저장 하 고 사용 하기 전에 멸 균 식 염 수로 그것을 씻어. 광 창 설치 하기 전에 결함, 아래는 stereoscope 광학 접착제 또는 부정확 한 정렬의 잘못 된 금액을 포함 하 여 광학 창을 확인 합니다.
- 광 창 craniotomy 지역 (그림 2D) 설치. 광학 창 윗부분은 두개골에 달려있다 고 광학 창의 아래쪽 부분 craniotomized 오프닝에서 맞는 CSF (2D 그림, E)의 경질에 달려있다.
- 광 창 가장자리 (그림 2F; Cyanoacrylate 슈퍼 접착제로 두개골의 윗부분을 밀봉 그림 3 층)입니다.
- Cyanoacrylate 슈퍼 접착제 건조, 검은 치과 시멘트 (Dentsply) 커버 유리 가장자리에 적용 됩니다. 모든 노출 된 두개골을 치과 시멘트를 적용 하 고 여백을 빛 (그림 2G-H; 차단 상처 그림 3B)입니다.
- 왼쪽에 동일한 절차를 수행 합니다.
- 난방 패드에 복구 하 고 적절 한 모니터링에서 복구에 대 한 그것의 가정 케이지를 동물을 반환을 동물 허용. 젖은 음식을 씹는 및 수 화를 제공 합니다. 통증을 줄이기 위해, 관리 buprenorphine 사우스 캐롤라이나 (0.05-2.0 mg/kg) 2 일 동안 매 8-12 h postinjury. 마우스를 복구할 수 있도록 영상 전에 추가 7-10 일.
3. 2-광자 이미징
- 실험 당일, 동물 마 취 제와 xylazine (복용량 및 위에서 설명한 대로 마 취의 유지 보수) anesthetize. 75% (vol/vol) 에탄올과 두개골 창을 청소.
- 2 P 현미경와 머리 잡고 어댑터, 귀 바 마우스 머리 소유자에 연결 된 통해 움직일 머리와 생리대에 휴식의 구성 된 영상 설정에서 마우스를 놓습니다.
- 이미지의 한 번에 광학 창 한쪽. 광학 착오를 최소화 하기 위해 광학 창 및 오른쪽 두개골 현미경의 광 축에 수직으로 지향된은 있는지 확인 합니다.
- 높은 배율 2 P angiographies (그림 4A1) 등록에 대 한 참조 맵으로 4 배 확대에 밝은 필드 조명 두개골 윈도우의 초기 그림을 가져가 라.
- 10 배 확대 (그림 4A2)를 사용 하 여 관심 영역을 확대 합니다.
- S1 영역에 대 한 관심의 영역에서에서 선택 대뇌 피 질의 레이어 I 또는 II (pial 표면 아래 150 µ m)까지 합니다. 높은 확대를 원하는 경우 20 X 목표를 사용 합니다.
- 여러 개의 신경 세포와 보기의 필드에 대 한 검색. 2 P 현미경 (그림 4B)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 노출 시간 및 여기 광 레벨 (≈910 nm)는 깊이에 따라 및 GCaMP6s, 더 긴 노출 시간을 요구 하는 약한 신호 및 concordantly 시간 분해능 덜 식 수준 결정 합니다. 우리는 일반적으로 픽셀 노출 시간 당 ~ 4 µ s를 사용합니다. 512 × 512 픽셀의 해상도에서 3-5 Hz의 프레임 속도로 이미지를 취득 합니다.
- 시계열을 기록 하기 시작 합니다. 낮은 확대 이미지에 관심 (ROI) 표준 포인트 또는 혈관 패턴 기준으로 모든 영역의 좌표를 저장 합니다. 시간이 지남에 따라 같은 투자 수익을 이미지. S1 영역 왼쪽된 반구에의 칼슘 역학을 관찰 하는 동일한 절차를 수행 합니다. 각 투자 수익에서 형광에 변화를 계산 합니다.
- 개별적으로 또는 시간 경과 영화 (그림 4C1-C3, D, E)로 이미지를 획득.
- 이미징 형광 dextran 염료 2 P 현미경으로 설치류의 꼬리 정 맥에 주입 하 여 대뇌 피 질의 혈액 흐름 역학에서 vivo에서 공부 합니다. 랜드마크로 서 vasculatures를 사용 하 여 인식 하 고 이미지를 오랜 기간 동안 세션을 이미징에 동일한 투자 수익.
4입니다. 데이터 처리
- ImageJ 및 출처를 사용 하 여 이미지 분석을 위한. ImageJ (그림 5A-B)와 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 개별 이미지 (또는 t-시리즈 영화)에 대 한 군데 신경 및 2 배경 측정 (그림 5C) 지역 근처 별도 ROI를 선택 합니다. 투자 수익 관리자 (그림 5C) 총 강도 취득 합니다.
참고: 그림 6 은 대표적인 칼슘 이미지를 보여 줍니다. 칼슘 과도 (녹색)과 혈관 (적색) 표시 다른 시간 지점에서 초 (그림 6A-D) 7 d 마우스에서 초기 윈도우 설치 후. 빨간색과 녹색 채널 (그림 6E) 또는 녹색 채널 (그림 6 층)에 대 일 분 녹화 기간 z 투영 표시 됩니다. Z-프로젝션은 러프와 원 경계 (모든 프레임에 대 한 관심의 개체 신경 포괄) 수동으로 선택 배경 영역 ( 근처 독립 2의 선택 뿐만 아니라 영화에 모든 이미지의 압축 된 이미지를 표시 그림 6G). - 각 투자 수익에서 계산 평균 형광 배경, FB FB (FB1 + f b 2) = 2, 형광의 그리고 변화 소마 (F)로 표시 / δ/F, δ/F = (F-FB) / FB.
- ImageJ 기준선 보정, 피크 찾기/결정, 피크 통합, 피크, 피팅 또는 Time-Saving 피크 분석 기능 등의 기능을 사용 하 여 단계적으로 피크 분석을 수행 합니다.
Representative Results
2 별도 실험에서 결과 얻은 양자 광학 창을 사용 하 여, 우리. 첫 번째 실험 EGFP 표현 쥐 이미지 수지상 varicosities 하 고용. 그림 4C 1-3 광 창 이식 후 다른 시간 지점에서 촬영 된 이미지의 예를 보여줍니다. Note 수와 수지상 가지와 쪽이의 위치는 현저 하 게 안정 2 보기 (그림 4D, Ez-프로젝션) 사이.
두 번째 실험 Thy1-GCaMP6s 유전자 변형 생쥐 과도, 따라서 어떻게 칼슘 생리는 하나의 신경에 vivo에서 (그림 6) 내에서 측정 될 수 있다 설명 세포내 칼슘 측정 고용. 이 기술은 기록 하 고 깊은 있는 레이어 V 피라미드 뉴런의 인구에서 자발적인 활동을 계량 사용할 수 있습니다으로 > pia 아래 500 µ m. (각 시간 지점에서 평균 응답으로 계산) 동안 평균 자발적인 응답 수많은 실험을 통해 계산할 수 있습니다. 2 P 기술 multielectrode 기록에 비해 뇌에 작은 기계적인 소요 연장된 기간 동안 대규모 또는 분산 된 신경 인구에서 동시에 활동을 감지의 이점이 있다.
허용 평균 측정을 생성 하기 위해 5-10 재판은 것이 좋습니다. 횟수가 자발적인 응답 또는 특정 자극에 대 한 응답의 내재 변동성에 종속 됩니다. 모든 단계를 엄격 하 게, 위에서 설명한 대로 따를 경우 연구원 두 박 형 두개골 두개골 창 기술에서 훈련 하 고 2 P 칼슘 이미징 vivo에서 하루 1-2 동물에서 양쪽에 100-200의 녹음을 얻을 수 있어야 합니다.
피크 분석 후 컬렉션 피크, 실제 진폭, 지역 및 각 피크에 대 한 반 최대 (FWHM)에 전체 폭의 실제 위치와 같은 결과 얻을 수 있습니다.
그림 1 : 2-광자 (2 P) 이미징 두개골 광 창의 구성 요소의 회로도 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 회로도 그림 두개골 창 준비 하기 위한 주요 단계. (A) 해 현미경 외과 영역인 수술가 위를 사용 하 여 피부를 제거. (B) 사용 뼈까지 S1 영역 두개골에 원형 홈 (직경 3 m m)를 생산 하는 고속 microdrill 홈 내 흔들고 주변 뼈에서 분리 된다. (C) 기본 dura 노출 뼈 플랩 천천히 제거. (D) 조립 2 다른 직경을 가진 coverglasses와 광학 창 위 coverglass 더 큰 직경 (5mm) 있으며 낮은 coverglasses (보통 1-3)는 더 작은 직경 (3mm). 설치 될 coverglasses의 두께 두개골의 두께에 의존 될 것입니다. (E) 장소 두개골의 원형 개통에 coverglass 광학 창을 만들 수 있습니다. coverglasses의 더 낮은 부분 두개골 오프닝 안에 적합 해야 한다. coverglasses의 하단 부드럽게 두 라를 문의 하십시오. (F) 인감 창 cyanoacrylate 접착제로 두개골에 가장자리. (G)는 cyanoacrylate 마른 접착제 벽에 검은 치과 시멘트 측면을 적용. (H) ddH2O와 두개골 창와 물 침수 목표를 사용 하 여 이미지에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 두개골에 양자 창의 창조. (A) A 사진 이미지 쇼 2 두개골 광학 창 S1 영역 overlying 두개골의 각 측면에. (B) 높은 확대 이미지 (A)의 박스형 영역의 양자 광학 윈도 기본 경질과 혈관 노출 보여주는. 눈금 막대 = 680 µ m. (C) 노출 된 두개골. (D)는 중앙 뼈 플랩 볼 원형 홈 만들기 눈금 막대 = 900 µ m. (E)는 뼈의 제거, 후 두개골 오프닝 인공 척수 (실제)으로 채워졌다. 눈금 막대 = 720 µ m. (F) 두개골 열고 슈퍼 접착제 창의 가장자리 바다 표범 어업 동안 광학 창 설치. 경질 및 혈관 광학 창을 통해 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 600 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 칼슘과 수지상 이미징. (A1) Thy1에 랜드마크로 서 혈관 (BV)를 사용 하 여 관심 영역 식별-GCaMP6s 쥐. (A2) 같은 랜드마크 및 레코드를 사용 하 여 시간이 지남에 따라 동일한 레이블이 셀 (빨간색 화살표)을 식별 합니다. (B) 칼슘의 대표 Z 프로젝션 뉴런 (빨간색 화살표)의 기본 somatosensory 피 질 (S1)에서 신호. 눈금 막대 = 10 µ m. (C1-3) 모 수석 (녹색) 및 b 6에 (빨간색) 혈관의 시각화. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/레이어 광학 창 설치 후 1 일에서 S1 영역 II에에서 다른 깊이에서 J. (D) Z-1 일에 같은 지역에서 여러 개의 이미지의 투 상 (E) Z-광 창 설치 후 7 일 이내에 같은 지역에서 여러 개의 이미지의 투 상 수의 놀라운 안정성과 성인 등뼈와 1 일 및 광학 창 설치 후 7 일 사이 수지상 분기의 위치를 note. 눈금 막대 = C-E 5 µ m (C-E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 칼슘 신호 추적. (A, B) 가져온된 t-시리즈 영화 ImageJ 2 신경의 데이터 분석에 대 한의 예 (1 신경 및 신경 2, 각각). (C) A 스프레드시트 관심 영역에서 조명 강도에 데이터 표시 (ROI; 신경 및 2 지역 근처 별도 내로 조치 배경). 피크의 (D) 계산: Δ/F = (F-FB) / 일박 삼 식 제, FB = (FB1 + f b 2) / (평균 형광 배경 [FB], 형광의 그리고 변화 δ/F로 소마 [F]) 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 대표 칼슘 이미지. (A-D) 칼슘 과도 (녹색)과 혈관 (빨간색) 7 일에는 마우스에 초에 다른 시간 지점에서 광학 창 설치 후 노란색 화살표: 상대적으로 덜 활성화 신경. 흰색 화살표: 스파이크 신경. (E, F) 빨간색 (혈관) 및 녹색 (칼슘) 채널 (E)과 녹색 채널 전용 (F)에 대 일 분 녹화 기간 Z 프로젝션 (G) 선택한 신경 및 그들의 인접 한 배경 영역이 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
두 광자 영상 뇌 표면 아래 약 800 µ m까지에 적당 한 해상도에 많은 세포의 활동의 동시 측정을 수 있습니다. 우리 통합 듀얼 광 창 기술과 2 P 있는 레이어 V 신경 somata의 인구에 있는 칼슘 역학 관찰 하 유전자 인코딩된 GCaMP6s > pia 아래 500 µ m. 두개골의 각 측면에 오픈 광학 창, 메서드 신경 활동의 연장과 안정적인 칼슘에 생체 내이미징에 대 한 대칭 포유류 두뇌 지역에 걸쳐 수 있습니다. 이 방법의 주요 측면 대칭 S1 영역에 듀얼 오픈 두개골 광학 창에 최소 침 습 수술 및 신경 활동의 2 P 이미지를 포함 합니다.
양자 S1 지역에서 네트워크 활동 조사 어떻게 듀얼 두개골 윈도우의 예 조사 지역 및 대칭 정보 성인 두뇌 vivo에서 처리를 사용할 수입니다. 이 메서드는 또한 신경 활동 (예: Thy1-GCaMP6s 마우스를 사용 하 여) 대뇌 피 질의 소성 b 6 공부 하 고 사용할 수 있습니다. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/deafferentation 일방적인 CNS 부상으로 인해 후 복구에서 해당 대칭 영역의 그대로 조직에서 J. 메서드는 optogenetic, 전기 또는 화학 stimulations 등 주변 자극 전략에 대 한 응답에서 대뇌 피 질의 활동을 검토 하 사용할 수 있습니다. 비록만 S1 영역에서 기술 시연,이 방법은 기본 모터 피 질 (M1)의 레이어 V 신경 세포 등 살아있는 두뇌의 다른 대칭 영역에서 활동을 조사 하 채택 될 수 있습니다. 뇌 영역의 개편에 대 한 관찰 postinjury 복구 기능에 중요 한 역할 적응 모터 동작에 대 한 신경 기질을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 머리 고정 마우스에 동작 동안 유전으로 확인 된 세포의 대칭 활동의 만성 측정에 대 한 수 있습니다.
기술적으로, 조사 품질 및 듀얼 두개골 윈도우의 일관성에 주의 기울여야 한다. 박 형 두개골 두개골 창 기술 12 이 좋습니다 초보자를 위한 연습. 이 그들의 형태학과 지방 유입 및 압출 메커니즘 칼슘 구획 사용 됩니다. 이 연구에서 우리는 b 6를 사용합니다. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/J 쥐 수지상 척추 역학에서 vivo에서 (그림 4) 설명 하기 위해 예를 들어. 오픈-두개골 유리 창 설치는 수술 12후 높은 척추 회전율 및 반응성 glial 응답을 발생할 수 있습니다. 반면, 박 형 두개골 창 기술 쪽이 및 모 수석 수 잘 보존.
치수의 선택과 광 창의 두께 원하는 시야, 두개골 곡률, 두개골 두께, 및 이미징 13의 종류에 의존 될 것입니다. 경질에 광학 coverglasses의 부족 압력 두껍게 자라나는 두개골의 경질의 발생할 수 있습니다 그리고 증가 두뇌 모션. 반면, 광 coverglasses의 과도 한 압력 대뇌 피 질의 혈액 흐름을 방해 수 있습니다.
광 창 어셈블리, 접착제 및 광학 접착제와 긴 파장 UV 빛 한 번에 하나의 coverglasses의 추가 레이어를 치료. 접착성 접합을 강화 하기 위해, 따뜻한 인큐베이터에서 조작된 창 (50 ° C 12 h에 대 한). 70% (vol/vol) 에탄올에 광학 창 coverglass를 저장 하 고, 수술을 하기 전에 멸 균 식 염 수와 린스. 광 창 오류 방지 하려면 사용 하기 전에 stereoscope 아래 결점 (같은 광학 접착제 또는 부정확 한 정렬에 대 한 잘못 된 양의)에 대 한 검사를 해야 합니다. 광학 접착제 너무 얇은 경우에, 공기 공간 수 있습니다 수 주름 잡은, 광학 착오 또는 커버 유리 분리 이식에서 발생할 수 있습니다. 반면, 너무 많은 광학 접착제 두개골 창 가장자리 과거 오버플로 일으킬 수 있습니다.
요약 하자면, 여기 우리가 칼슘 역학 또는 2 대칭 기본 somatosensory 외피 지구에서 Thy1에 두개골 창을 통해 수지상 형태학을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 및 Thy1-YFP 유전자 변형 쥐, 각각 2 P 현미경을 사용 하 여. 이 기술은 크게 신경 네트워크의 복잡 한 구조 및 기능적 관계를 해 부 촉진 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지도 대 한 Wenbiao Gan (Skirball 연구소, 학과의 생리학 및 신경 과학, 뉴욕 대학 의과대학, 미국)와 패티 Raley, 의료 편집기 (신경 외과, 인디애나에 매우 감사 대학의 학부), 원고 편집에 대 한. Jinhui 첸 박사 (스 탁 신경 과학 연구소, 인디애나 대학의과 대학, 미국)는 b 6을 제공 하는 감사 합니다. Cg-Tg (Thy1-YFP) HJrs/J 쥐. 이 작품 감독 지난 군사 지역 중 PLA 2016ZD03의 종합 병원의 기초에 의해 부분적으로 지원 되었다 (XJL), 및 NIH NS059622, NS073636, 국방부 CDMRP W81XWH-12-1-0562, 장점을 검토 상 I01 BX002356 노 병의 미국 학과에서 업무, 크레이그 H Neilsen 재단 296749, 인디애나 척수와 뇌 손상 연구 재단, Mari Hulman 조지 기부금 펀드 (XMX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J | Jackson | 24275 | Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex. |
| B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ. | Jackson | 7919 | Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. |
| Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | Can be any brand of choice. |
| Dumont no. 5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Can be any brand of choice. |
| Micro Bead Sterilizer | Southern Labware | B1201 | Can be any brand of choice. |
| Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor | Tritech Research | SG-4N | Can be any brand of choice. |
| Ideal Micro-Drill Complete Kit | Harvard Apparatus | 72-6065 | Can be any brand of choice. |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 3 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0720 | Can be any brand of choice. |
| Round cover glass, 5 mm | Harvard Biosciences | W4 64-0700 | Can be any brand of choice. |
| Norland optical adhesive | Norland Products | 7106 | Can be any brand of choice. |
| Loctite liquid super glue | WB Mason | LOC1647358 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio). |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | Can be any brand of choice. |
| Artificial cerebrospinal fluid (ASF) | - | - | The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment. |
References
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- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. Functional specialization of mouse higher visual cortical areas. Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).
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