ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタ フェース

Summary

ワイヤレス、マルチ チャンネル記録と自由行動下ラットにおける刺激の双方向システムを導入します。システムは軽量でコンパクトなこのように animal´s の行動レパートリーに最小限の影響を持ちます。さらに、この双方向システムは、脳の活性化パターンと動作の因果関係を評価する洗練されたツールを提供します。

Abstract

体内電気生理学はミリ秒からマイクロ メートル スケールの動作と脳の活動の関係を調査するための強力な手法です。ただし、現在の方法はつなぎ縄でつながれたケーブル録音にほとんど依存またはのみ、記録または同じ時間や同じターゲットではなく神経活動の刺激のいずれか一方向システムを使用します。ここでは、新しいワイヤレス マルチ チャンネルの同時の録音そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向デバイスが説明です。両方の記録されたアクティビティを送信との対象にすることができます単一のポータブル ヘッド ステージを通じて、システム動作脳刺激テレメトリ ベースのマルチ チャンネル ソフトウェアを使用してリアルタイム。ヘッド ステージはプリアンプと充電式電池は、重要な安定した長期的な録音や最大 1 h. のための刺激を許可する装備、ヘッド ステージはコンパクト 12 g (バッテリーを含む) の重量を量る、従って最小限の影響で、animal´s は、行動のレパートリーでは、メソッドを広範な行動のタスクに適用すること。また、メソッドは、ある神経活動と行動に及ぼす脳刺激が同時測定可能、特定の脳活性パターンと動作の因果関係を評価するためのツールを提供する主要な利点を持っています。この機能は、正確な評価、監視、および長期的な行動実験中刺激パラメーターの調整をできるように、脳深部刺激療法の分野の特に貴重なメソッドをなります。モデル構造として下の丘を使用してシステムの有効性が検証されました。

Introduction

神経科学における基本的な質問は定義された神経回路でどのように電気的活動の動作の特定のフォームを生成します。体内電気生理学は記録または動物は行動の特定のタスクを実行している間に、脳の電気的活動を刺激するためのツールを提供する、この問題に対処するための強力な手法です。ただし、現在のシステムが頻繁につなぎ縄でつながれたケーブル録音^1、2、可能性があります移動を制限して、animal´s の行動レパートリーの完全な表現を防止する使用します。ほとんどの単方向システムの使用また、^3,4,5または刺激^6、7の神経活動を記録、ない同じ時間、同じターゲットでそれを作るのいずれかを許可します。特定の脳活性パターンと動作の因果関係を解きほぐすことは難しい。いくつか無線のみ体内の準備のための双方向システムが現在利用可能です。しかし、彼らは通常重い (40-50 g) から成っている 2 つ独立したポータブル ユニット、すなわちヘッド ステージとバッテリ ベースの電力供給^8,9,10、以下のレンダリングに接続されているバックパックと柔軟なセルフ グルーミングの動作中に、例えばケーブル断線の危険性を高める。前述の無線システムのどれもは、実験条件の再現性の高い完全 ethologically 有効な動作の中に神経の活動の完全な統合の概念を取得する埋込型電極ユニットを提供しています。

ここでは、新しいワイヤレス、生体内での録音そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向デバイスが登場です。単一リムーバブル ヘッド段階で最大 4 つの独立した記録するチャネルを使用してマルチ チャネルの活動を送信できます、ターゲットすることができますリアルタイムでの脳の電気的刺激のためにトーマス ・ ワイヤレス システム (TWS) が運営しています。また、トーキョーワンダー サイトと互換性のある慢性埋込型電極ユニットは神経刺激と記録の両方できるよう開発されました。また録音および刺激のトーキョーワンダー サイト ソフトウェアのグラフィカル ユーザー インターフェイスが表示されます。本研究では、デバイス全体の生体内および検証の実装について説明します。

トーキョーワンダー サイト システムを検証するためにあからさまな行動応答することができますその電気刺激によって誘発されるので、下丘はターゲットの神経構造として選ばれました。下丘の電気刺激が覚醒、横向き姿勢、背中のアーチ、凍結 (飛行) 避難行動などのラットの無条件の恐怖のような行動応答を引き出すことを広く知られています。この応答パターン模倣知覚された有害事象、攻撃または生存^11,12,13への脅威などの環境課題によって誘発恐怖に反応しています。このような明確かつ明確な動作を引き出すことがトーキョーワンダー サイトに本当の挑戦を提供することとしました。

Protocol

すべてのプロトコルおよび実験された現在のヨーロッパの指針に従って (2010/63/EU) と地方当局の承認を (Regierungspräsidium ギーセン、氏 20/35 Nr.25/2015).

1 です動物

1. 家の男性大人 Wistar ラット (200-250 g) 順化するために手術の前に、少なくとも 1 週間の標準的な実験室の条件の下で 3-4 つのグループにします。
。
2. 手術後 2 日間ペアの家ネズミ。高いアクリル蓋 1 つケージをカバーします。破損したおよび/または上不安定な時間なるリスクも増大して金属グリッド製インプラントが動けなくことができますので従来の蓋を避ける
。

2。定位脳手術

1. 手術を始める前に整理し、次の装置および材料の準備: 滅菌はさみ、鈍端鉗子、手術用のへらから成る
   1. 取得無菌手術装置バリカン、歯科用ドリル、綿の芽
   2. 薬物やイソフルラン、キシロカイン、トラマドール塩酸塩、dexpantenol 眼軟膏、3% 過酸化水素、ポビドン ヨード、70% エタノールなど化学物質を取得します。
   。
   3. ステンレス鋼製ネジ、アクリル樹脂、紫外線接着剤キャップ プロテクターなど固定材を取得します
   。
   4. は、(i) 記録の単一電極から成る、電極ユニットを入手 (石英ガラス絶縁プラチナ タングステン電極、円錐形の先端形状、外径: 80 μ m があり、円錐形の先端、1 kHz: 500 k ω のインピー ダンス) または熱 (石英ガラスプラチナ/タングステン 4 コア電極、外径を絶縁: 100 μ m があり、円錐形の先端、インピー ダンスで 1 kHz: 500-800 k ω);(ii) 刺激電極 (プラチナ/イリジウム線 (プラチナ 90%、イリジウム 10%)、コア径 125µm、外径 150 μ m、インピー ダンス < 10 k ω) 白金線電極 (軸径、100 接触板、(iii) に接続されています。μ m; 図 1 a).
   5. 取得電極ホルダー電極ユニットに水溶性の接着剤で接着し、機能の少なくとも 2 時間を事前にテスト ( 図 1 b).
   6. 差動プリアンプから成る従来の係留システムを取得、主なアンプと、バンドパス フィルター録音アンプ
   。
   7. 手袋、パッド、注射器と生理食塩水を加熱などの追加素材を入手します
   。
   8. ホーム ケージを取得 (L h: 42 cm x W x 26 cm × 38 cm x).
2. プロシージャ
   注: イソフルラン麻酔下で従来の定位脳手術中に電極の注入を実行します。
   1. 実験者が手袋、サージカル マスク、白衣を着ていることを確認します
   。
   2. 誘導の部屋に動物を配置する麻酔を開始 (イソフルラン 4-5%、酸素の流れ 1 L/分、期間 ~ 5 分) です
   。
   3. 鉗子で反射 (尾と足反射) の損失のための深い麻酔を確認するテストします
   。
   4. 定位脳手術フレームの上顎切歯の棒に固定麻酔マスクに動物の頭を置き、麻酔を調整 (イソフルラン 2-3%、酸素流量 0.7 0.8 L/min).
   5. 修正動物を水平方向に配置、' イヤバーと上顎切歯バーを用いた定位放射線装置で頭
   6. 手術用バリカンやはさみを使用して手術野を剃るし、ポビドン ヨードで消毒します
   。
   7. 加熱パッド低体温を防止し、乾燥を防ぐために dexpantenol 眼軟膏で眼の治療に動物を配置します
   。
   8. キシロカインを注入 (0.3 0.4 mL、皮下、サウスカロライナ) 手術野の中心部にします
   。
   9. 再び反射の損失をテストします
   。
   10. は、頭蓋骨を公開する手術のフィールドの真ん中にメスで小切開 (1.5 cm) を作る。優しく皮膚を分離し、鉗子、はさみ、ヘラを使用して残存組織を削除します
   。
   11. 慎重に過酸化水素コーティングの綿棒を使用して頭蓋骨をきれいします
   。
   12. 4-5 小さな穴 (4.7 mm) ステンレス鋼製ネジの固定のため頭蓋骨をドリルします
   。
   13. 電極ユニット/電極ホルダーをプリアンプに接続し、定位マイクロマニピュレーターを付ける ( 図 1B と 1 C).
   14. は、使用される動物によると脳アトラスから座標を使用してターゲット領域の上の頭蓋骨の穴 (約 7 mm) を開けます。本研究では、参考資料として提供する前に次の座標を使用して下の丘を目指した電極先端の位置: 前方/後方、− 8.8 mm;内側/外側、1.5 mm;背/腹、3.5 mm ¹⁴
   。
   15. 綿棒に血を吸収です
   。
   16. 電極先端標的部位に到達するまで垂直方向に電極ユニットを紹介します
   。
   17. ステンレス鋼製ネジに沿って、皮膚の下のアース ケーブルを配置します
   。
   18. モニター活動のスパイクし慎重にターゲット構造のアクティブなニューロンのゾーンに到達するまでマイクロマニピュレーターに電極位置を調整し、スパイクの並べ替えに適した信号対雑音比と神経活動を検出します
   。
   19. 紫外線接着剤で頭蓋骨に電極ユニットを固定し、接触板、アクリル樹脂がネジをカバーします
   。
   20. 生理食塩水 1 mL (i. p.) とトラマドール (25 mg/kg、サウスカロライナ) 脱水症状を防ぐ、術後鎮痛をそれぞれを確認し注入します
   。
   21. ブラシを使用して電極ホルダーから電極ユニットは、水に浸した切断します
   。
   22. ストップ麻酔は、定位脳手術フレームからラットを慎重に取り外します。電極からプリアンプを切断ユニット
   23. 注入電極ユニットのキャップ保護を接続し、実験の手順の中にのみ切断します
   。
   24. 手術後 2 日目からホーム ケージでペアで動物を維持します
   。 手術後 7 日間の期間の
   25. モニター動物の可能な創傷感染、体重、健康状態、日常生活や一般的な動作です。この回復期間後 体内 電気生理学および行動実験を実行します
       。 注: 手術は 60-90 分間続きます。手術中尾フリック反射を継続的に監視する必要がありますが、麻酔は、必要に応じて調整します
   。

3。生体内で電気生理学

1. 機器と手順
   注: 電気生理学的記録と刺激はトーキョーワンダー サイトを使用して実行されます。
   1. 取得プリアンプ内蔵型と接続されているバッテリ ヘッド ステージ (4 つの録音チャンネル; アナログ入力範囲を記録: 0-12 mV pk pk; 刺激出力: ±625 μ A;L x 幅 22 mm × 12 mm × h: 24 ×体重: 6 g バッテリー、12 グラムで、バッテリ; なしバッテリ時間 1 h まで)。このヘッド ステージは小型多極コネクタ ( 図 2) を介して注入電極ユニットに直接接続するのに適しています
   。
   2. 取得 (リチウム イオン蓄積装置、3.7 4.2 V DC、27 mm × 20 mm × 6 mm、1 h 操作時間 230 mAh) バッテリー ヘッド ステージ ( 図 2) の上にマウントされています。必要に応じて能力 450 の交換用充電式バッテリーを使用して約 2.5 h 操作時間の mA。くると確認する緑色の光頭の段階でバッテリーがそれに接続されている
   3. トランシーバー (機) 標準の USB ポート経由でパソコンに接続でき、( 図 2 e) 5 m までの無線操作を取得します
   。
   4. 取得電気刺激の神経活動の記録 TWS ソフトウェアとパーソナル コンピューター ( 図 3 と 図 4 ).
   5. テザーのプリアンプと手術中に使用するデータ集録システムを取得 (参照項目 2.1.5) 録音、および刺激の刺激発生器は、トーキョーワンダー サイトでの efficaciousness を比較するために目がさめているラットの手術後 1 週間
      。 注: 電気刺激が提供され、両方のシステムを使用して同じ注入電極ユニットから単一ニューロンの細胞活動が記録されます。刺激パラメーター (電流、パルス、周波数) は、脳の領域をターゲットによるとそれぞれの動物に調整必要があります。現在の研究では、150-250 μ A 2500 Hz 電流は下丘を刺激するために使用されたします
   。
2. 試金の行動
   注: トランシーバーと動物の頭の段階の間導入される金属の壁はない、TWS は広範な行動のタスクに適用されます。模範的な行動テストとしてそれは測定行動の一般的な活動と高架プラス迷路、齧歯動物 ¹⁵ の不安様行動を評価するため標準的なテストのためのオープン フィールドで使用されました。ビデオカメラはオープン フィールド上中央に配置され、高架式十字迷路行動の記録。
   1. , 行動実験前に連続 3 日間 (各日 5 分) 各動物を扱います。各処理期間前に以前注入電極ユニットにバッテリーとヘッドのステージを接続します。録音または処理中の刺激を実行しないでください
   。
   2. オープン フィールド
      1. オープン フィールドの中心にラットを配置 (40 cm × 40 cm × 40 cm; ~ 30 ルクスの光赤)、神経細胞記録の下で、少なくとも 5 分の装置を探索すること
      。
      2. は、エスケープの閾値 - ランニングまたはジャンプを作り出す現在の最低の強度を決定します。本研究では高周波 2500 Hz 刺激を提供 (パルス幅: 100 μ s; パルス間隔: 100 μ s) ラット示したまで、手順 20 50 μ A の電流の強さの増 1 分間隔で下丘に逃避行
      。
      3. ラットをホーム檻に戻り、オープン フィールド (0.1% 酢酸溶液) をきれいに、それを乾燥
         注: 上記の手順で説明した従来の係留システムと TWS の刺激効果を比較するために行った両方のシステムを使用しています
      。
   3. 高架式十字迷路
      注: これらの実験で使用されるプラス迷路だったグレーのアクリル製し、から成っていた 2 つの開いた腕 (50 cm × 10 cm くらい) 2 つの閉じた腕と (50 cm 長さ 10 cm、幅 40 cm 高い壁 x) 中央 pla からtform の上昇床 ¹⁶ 上 50 cm。
      1. 腕が開いて向きプラス迷路の中心にラットを置き 5 分間に継続的な記録の下で装置を自由に探索すること
      2. に、エントリの数を記録し、5 分にわたって時間オープンとクローズの腕の中です
      。
      3. その家のケージ、クリーン (0.1% 酢酸溶液) ラットを返し各試験前に迷路を乾燥
   4. 血流と組織学
      1. キシラジン/ケタミンを用いたラットの麻酔 (150 mg/kg と 100 mg/kg、それぞれ i. p.).
      2. 刺激ケーブルに注入電極ユニットを接続して電気刺激を適用 (現在強度 50 μ A、パルス幅: 100 μ s; パルス間隔: 100 μ s) 90 の中に電極先端近傍の小病変を生成するために s
      。
      3. 刺激ケーブルを外し、左心室を通して動物を灌流と 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝、pH 7.3 で 4% パラホルムアルデヒドの 200 mL に続いて生理食塩水 (詳細な説明は、リファレンスを参照してください ^17。).
      4. 脳を取り外して 4 で新鮮な固定液で 4 時間にそれを浸す ° C
      5. メイン クリオスタットチャンバーの温度が-20 に確認 ° C
      6. ドライアイスに頭脳を凍結し、50 μ m シリアル コロナ セクション クライオスタットを使用にそれらをカットします
      。
      7. Paxinos とワトソン ¹⁴ でアトラスによると電極先端の位置を特定するために cresylviolet のセクションを染色します
      。