Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

En trådløs, toveis grensesnitt for In Vivo -opptak og stimulering av nevrale aktivitet i fritt oppfører seg rotter

doi: 10.3791/56299 Published: November 7, 2017

Summary

En trådløs, toveis system for flerkanals nevrale innspillinger og stimulering i fritt oppfører seg rotter er innført. Systemet er lett og kompakt, dermed har minimal innvirkning på animal´s opptreden repertoaret. Videre gir toveis systemet et avansert verktøy for å vurdere årsaksforhold mellom hjernen aktivisering mønstre og atferd.

Abstract

I vivo elektrofysiologi er en kraftfull teknikk å undersøke forholdet mellom hjerneaktivitet og atferd på et millisekund og mikrometer skala. Men dagens metoder stole meste på bundet kabel opptak eller bare bruke enveis systemer, slik at opptaket eller stimulering av nevrale aktivitet, men ikke på samme tid eller samme mål. Her en ny trådløs, toveis enheten samtidig flerkanals innspillingen og stimulering av nevrale aktivitet i fritt oppfører seg rotter er beskrevet. Systemet opererer gjennom et enkelt bærbar hodet stadium som både overfører innspilte aktivitet og kan være målrettet i sanntid for hjernen stimulering bruke en telemetri-basert flerkanals programvare. Hodet scenen er utstyrt med en forforsterker og et oppladbart batteri, slik at stabil langvarige opptak eller stimulering for opptil 1 h. viktigere, hodet scenen er kompakt, veier 12 g (inkludert batteri) og dermed har minimal innvirkning på animal´s atferdsmessige repertoar, gjør metoden gjelder for et bredt spekter av atferdsmessige oppgaver. Videre har metoden den store fordelen at effekten av hjernen stimulering på neural aktivitet og oppførsel kan måles samtidig gi et verktøy for å vurdere årsaksforhold mellom spesifikke hjernens aktivisering mønstre og atferd. Denne funksjonen gjør metoden spesielt verdifull for feltet i dyp hjernestimulasjon, slik at presis vurdering, overvåking og justering av stimulering parametere under langsiktige atferdsmessige eksperimenter. Anvendelse av systemet er validert med dårligere colliculus som en modellen struktur.

Introduction

Et grunnleggende spørsmål i nevrovitenskap er hvordan elektrisk aktivitet i definerte nevrale kretser genererer visse former for atferd. I vivo elektrofysiologi er en kraftfull teknikk for å løse dette spørsmålet, gir et verktøy for å registrere eller stimulere elektrisk aktivitet i hjernen mens dyr utfører visse atferdsmessige oppgaver. Men stole nåværende systemer ofte på bundet kabel opptak1,2, sannsynligvis begrense mobilitet og hindre hele uttrykket av animal´s opptreden repertoaret. Videre brukes mest enveis systemer, slik at enten inn3,4,5 eller stimulering6,7 nevrale aktivitet, men ikke på samme tid eller samme målet, gjør det vanskelig å greie årsaksforhold mellom spesifikke hjernens aktivisering mønstre og atferd. Bare noen få trådløs, toveis systemer for i vivo forberedelser er tilgjengelig. Men de er vanligvis tungt (40-50 g) og består av to separate bærbare enheter, dvs en hodet scene og tilkoblede ryggsekk for batteri-baserte power supply8,9,10, gjør dem mindre fleksibel og øke risikoen for kabel frakobling f.eks under selv-Stell atferd. Ingen av de nevnte trådløse systemene tilbyr implanterbare microelectrode enheter for å erverve en fullstendig integrert konseptet nevrale aktiviteten under ethologically gyldig virkemåten med høy reproduserbarhet av eksperimentelle forhold.

Her, er en ny trådløs, toveis enheten i vivo opptak og stimulering av nevrale aktivitet i fritt oppfører seg rotter innført. Thomas trådløst System (TWS) opererer gjennom et enkelt flyttbare hodet stadium som kan overføre flerkanals aktivitet med opptil fire uavhengig opptakskanaler og kan være målrettet for elektriske hjernen stimulering i sanntid. I tillegg ble en kronisk implanterbare microelectrode enhet som er kompatibel med TWS utviklet som gjør at både nevrale stimulering og opptak. En TWS programvare grafisk bruker grenseflate, for opptak og stimulering er også presentert. Denne studien beskriver validering og i vivo gjennomføringen av hele enheten.

For å validere TWS systemet ble de underlegne colliculus valgt som en mål nevrale struktur fordi et utilslørt atferdsdata svar brakt frem av sin elektrisk stimulering. Det er kjent at elektrisk stimulering av de dårligere colliculus utløser unconditioned "frykt-like" atferdsdata svar i rotter, som årvåkenhet, sidelengs positurer, arkitekten av baksiden, frysing og flukt (flight) atferd. Denne reaksjonsmønster etterligner reaksjoner på frykt vakte av miljøutfordringer, oppfattet skadelige hendelse, angrep eller trussel mot overlevelse11,12,13. Det ble antatt at kunne lokke fram slik klare og utvetydige oppførsel ville gi en virkelig utfordring å TWS.

Protocol

alle protokoller og eksperimenter var de gjeldende europeiske retningslinjer (2010/63/EU) og godkjent av regionale myndigheter (Regierungspräsidium Gießen, MR 20/35 Nr.25/2015).

1. dyr

  1. huset voksen Wistar hannrotter (200-250 g) i grupper på 3-4 under standard laboratorieforhold i minst en uke før operasjonen tillate Akklimatisering.
  2. To dager etter operasjonen huset rotter parvis. Dekk enkelt bur med høy akryl lokk. Unngå konvensjonelle lokk laget av metall rutenettet siden implantater kan sette seg fast, øke risikoen som de blir skadet og/eller ufrankert over tid.

2. Stereotactic kirurgi

  1. før du starter operasjonen, organisere og forberede følgende utstyr og materialer:
    1. motta sterilt kirurgisk utstyr bestående av sterile saks, Butt-end tang, spatler, kirurgisk avklipt, tannlege bore og bomull knopper.
    2. få narkotika og kjemikalier inkludert isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride, dexpantenol øye salve, 3% hydrogenperoksid, povidon jod og 70% etanol.
    3. Få fiksering materiale inkludert rustfritt stål skruer, akryl harpiks, ultrafiolett lim og cap protector.
    4. Få en microelectrode enhet, bestående av (i) en innspilling enkelt elektronen (kvarts glass isolert platina tungsten microelectrode, med konisk form, ytre diameter: 80 µm, koniske spissen, impedans på 1 kHz: 500 kOhm) eller en sperrende (kvarts glass isolert platinum/tungsten 4 kjerner microelectrode, ytre diameter: 100 µm, koniske spissen, impedans på 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) en stimulering elektrode (platina/iridium wire (90% platinum, 10% iridium), core diameter 125 µm, ytre diameter 150 µm, impedans < 10 kOhm) koblet til en kontakt plate og (iii) en platina wire referanse elektrode (aksel diameter, 100 µm; figur 1A).
    5. Hent elektrodeholderen limt med vannløselige lim til microelectrode enhet og testet for funksjonalitet minst 2 h på forhånd ( figur 1B).
    6. Få en tradisjonell bundet system består av en differensiell forforsterker, en viktigste forsterker og en Båndpassdesign filter forsterker opptak.
    7. Få mer materiale, for eksempel hansker, oppvarming pad, sprøyter og fysiologiske saline.
    8. Få hjem bur (L x b x H: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
  2. Prosedyren
    Merk: elektrode implantasjon utføres under en konvensjonell stereotactic kirurgi under isoflurane anestesi.
    1. Sikre at eksperimentator bruker hansker, kirurgiske maske og Laboratoriefrakk.
    2. Starte anestesi plassere dyret i en induksjon kammer (isoflurane 4-5%, oksygen 1 L/min, varighet ~ 5 min).
    3. Test for tap av reflekser (hale og tå reflekser) med tang for å bekrefte dyp anestesi.
    4. Plasserer leder av dyre i en bedøvelse maske løst rundt øvre helikopteret bar stereotactic rammen og justere anestesi (isoflurane 2-3%, oksygen flyt 0,7 til 0,8 L/min).
    5. Fikse og vannrett justerer dyret ' s leder i stereotactic apparatet bruker øret barer og øvre helikopteret Språklinje
    6. Barbere kirurgiske feltet kirurgisk avklipt eller en saks og sterilisere med povidon jod.
    7. Plassere dyret på en varmeputen å hindre nedkjøling og behandle øyne med dexpantenol øye salve å hindre at de tørker.
    8. Injisere xylocaine (0,3-0,4 mL, subcutaneously, SC) i midten av feltet kirurgisk.
    9. Test for tap av reflekser igjen.
    10. Lag et lite innsnitt (1,5 cm) med en skalpell i midten av kirurgiske feltet å avsløre skallen. Skille huden forsiktig og fjern gjenværende tissue tang, saks og spatel.
    11. Rengjør skallen med hydrogenperoksid-belagt bomull knopper.
    12. Bore 4-5 små hull (4,7 mm) i skallen for fiksering av rustfritt stål skruer.
    13. Den microelectrode enhet/elektrodeholderen tilkobles på forforsterker og legge til den stereotactic micromanipulator ( figur 1B og 1 C).
    14. Bore hull (ca. 7 mm) i skallen over målområdet bruker sideordner fra en hjerne atlas etter dyret brukes. Studien, og plasser elektroden tips rettet mot de underlegne colliculus med følgende koordinater, med bregma som referanse: fremre/bakre, − 8,8 mm; mediale/lateral, 1,5 mm; og dorsal/ventrale, 3,5 14.
    15. Absorberer noe blod med bomull knopper.
    16. Loddrett introdusere microelectrode enheten til elektroden tips kommer målområdet.
    17. Plasser grunnen kabelen langs rustfritt stål skruene og under huden.
    18. Monitor pigge aktivitet og nøye justere elektrode posisjon med micromanipulator fram en sone av aktive nerveceller i målet strukturen og oppdage nevrale aktivitet med signal-til-støy forholdet egnet for spike sortering.
    19. Fastsette microelectrode enheten til skallen med ultrafiolett lim og dekke kontakt plate og skruene med akryl harpiks.
    20. Injisere fysiologiske saline (1 mL IP) og tramadol (25 mg/kg, SC) for å hindre dehydrering og postoperativ analgesi, henholdsvis.
    21. Koble microelectrode enheten fra elektrodeholderen med en pensel dynket i vann.
    22. Stopp anestesi, forsiktig fjerne rotten fra stereotactic rammen. Koble forforsterker fra microelectrode enheten
    23. Koble cap beskyttelse på microelectrode enhet implantert til og fra det bare under eksperimentelle prosedyrene.
    24. Holde dyr i par i hjem-bur fra den andre dagen etter operasjonen.
    25. Monitor dyr daglig for mulig sår infeksjon, kroppsvekt, helsetilstand, og generell virkemåten for 7 dager etter operasjonen. Etter denne utvinning perioden, utføre i vivo electrophysiology og atferdsmessige eksperimenter.
      Merk: Den kirurgiske prosedyren varer mellom 60-90 min. Under kirurgi, hale flick reflekser må være kontinuerlig overvåket og anestesi justert, eventuelt.

3. I Vivo Elektrofysiologi

  1. utstyr og prosedyren
    Merk: elektrofysiologiske opptak og stimulering utføres ved hjelp av TWS.
    1. Innhente en hodet scene med en integrert forforsterker og tilkoblede batteri (fire opptakskanaler, analog innspilling inndataområdet: 0-12 mV pk-pk; stimulering utdata: ±625 µA; L x b x H: 24 mm x 22 mm x 12 mm; vekt: 6 g uten batteri, 12 g med batteri; batteriet løper tiden opptil 1 time). Dette hodet stadiet er egnet skal kobles direkte til implantert microelectrode enheten via en miniatyr flerpolete kontakt ( figur 2).
    2. Motta et batteri (lithium ion Akkumulator, 3,7-4,2 V DC, 230 mAh, 27 mm x 20 mm x 6 mm, 1t operasjonstid) montert på toppen av hodet scenen ( figur 2C). Om nødvendig bruker erstatning oppladbart batteri med kapasitet på 450 mA for ca 2,5 t operasjonstid. Kontroller at et grønt lys kommer i hodet scenen mens batteriet er koblet til det.
    3. Motta en transceiver (receiver-transmitter) koblet til en PC via standard USB-port og gir trådløs operasjon opp til 5 meter ( figur 2E).
    4. Få en personlig datamaskin med TWS programvare for elektrisk stimulering og opptak av nevrale aktivitet ( Figur 3 og Figur 4 < / strong>).
    5. Få en bundet forforsterker og en data oppkjøpet systemet brukes under operasjonen (se elementet 2.1.5) for innspillinger, og en stimulans generator for stimulering, for å sammenligne efficaciousness av TWS i våken rotter en uke etter operasjonen.
      Merk: Elektrisk stimulering er gitt og ekstracellulære aktivitet fra enkelt neurons registreres fra samme implantert microelectrode enhet med begge systemene. Parameterne stimulering (gjeldende intensitet, puls og frekvens) skal justeres til hvert dyr etter hjernen regionen målrettet. Studien, en 150-250 µA, 2500 Hz gjeldende ble brukt til å stimulere den underlegne colliculus.
  2. Behavioral søk
    Merk: når ingen metall barriere er innført mellom mottakeren og dyr hodet scenen, i TWS gjelder for et bredt spekter av atferdsmessige oppgaver. Som eksemplarisk atferdsmessige tester, ble den brukt i feltet åpen for måling generelle atferdsmessige aktivitet og forhøyet pluss labyrint, en standardkontroll å vurdere angst-lignende oppførsel i gnagere 15. Et videokamera var plassert sentralt over åpen og forhøyet pluss labyrint atferdsmessige opptak.
    1. Før atferdsmessige testing, håndtere hvert dyr på tre påfølgende dager (5 min hver dag). Før hver behandling periode koble hodet scenen med batteri til microelectrode enheten tidligere implantert. Ikke Utfør noen opptak eller stimulering under håndtering.
    2. Åpne feltet
      1. Sett rotta i midten av feltet åpen (40 cm x 40 cm x 40 cm, rødt lys ~ 30 Lux) og la dem utforske apparatet i minst 5 minutter under nevrale opptak.
      2. Bestemmer escape terskelen - minimum gjeldende intensitet produsere kjører eller hoppe. Studien, levere en høyfrekvent 2500 Hz stimulering (pulse width: 100 µs; puls intervall: 100 µs) til dårligere colliculus i 1 minutt intervaller øke gjeldende av 20-50 µA trinnene til rotter viste unnslippe atferd.
      3. Tilbake rotta til buret sitt hjem, ren feltet åpen (0,1% eddiksyre løsning) og tørr den.
        Merk: For å sammenligne stimulering effekten av TWS med tradisjonelle bundet systemet prosedyren beskrevet ovenfor ble utført med begge systemene.
    3. Forhøyet pluss labyrint
      Merk: plus-labyrinten i disse eksperimentene ble gjort av grå akryl og besto av to åpne armer (50 cm lange x 10 cm bred) og to lukket armene (50 cm lange x 10 cm bred, med 40 cm høye vegger) som går ut fra en sentral pla tform opphøyet 50 cm over gulvet 16.
      1. Sett rotta i sentrum av plus-labyrint vender mot en åpen arm og la den Utforsk apparatet under fortsatte innspillingen under 5 min.
      2. Registrere antall oppføringer i, og tiden tilbrakte i åpne og lukkede armene over en 5 min periode.
      3. Returnere rotta å buret sitt hjem, ren (0,1% eddiksyre løsning) og tørr labyrinten før hver test
    4. Perfusjon og histology
      1. bedøve rotte med xylazine/ketamin (150 mg/kg og 100 mg/kg, henholdsvis; IP).
      2. Koble implantert elektrode stimulering kabelen og bruke elektrisk stimulering (gjeldende intensitet 50 µA, pulsbredde: 100 µs; puls intervall: 100 µs) under 90 s for å produsere en liten leksjonen rundt elektrode spissen.
      3. Trekk kabelen til stimulering og perfuse dyr gjennom venstre ventrikkel med fysiologiske saltvann etterfulgt av 200 mL 4% paraformaldehyde inne 0.1 M natrium fosfatbuffer, pH 7.3 (se referanse for en detaljert beskrivelse 17 ).
      4. Fjerne hjernen og Dynk kjeden 4 h i frisk bindemiddel på 4 ° C.
      5. Kontroller temperaturen på viktigste kryostatkammeret er på -20 ° C.
      6. Frys hjernen på tørris og skjær dem i 50 µm føljetong framskaffet ved hjelp av en kryostaten.
      7. Stain delene med cresylviolet for å finne plasseringen av elektroden tips, ifølge atlas av Paxinos og Watson 14.

Representative Results

TWS tekniske data

Trådløse systemet tilbyr 4 uavhengig opptakskanaler og 1 stimulering kanal. Ekstracellulære aktivitet ble plukket opp av opptak enkelt kjernen elektroden og videre til høye impedans Signalinngang trådløse systemet. Innspilte signalet var pre forsterket (x200) av en AC-kombinert, differensial input forforsterker og Båndpassdesign filtrert (fast signal båndbredde, 500 Hz... 5 kHz) å spille inn bare multi-unit aktivitet, fordi studien hovedinteresse var å registrere enheten aktivitet og ikke lokale feltet potensialer. Integrert programmerbare gevinst main-forsterkeren tilbyr programvare-justerbare gevinst for fire opptakskanaler (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). Komplett signal kjeden av trådløse systemet tilbys samlede forsterkningen x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 og x12800. Etter forsterkning og filtrering, var det analoge signalet digitalisert av en analog til digital omformer, modulated på en høyfrekvent operatør og overføres av en radio-mottaker med 2,4-2.5 GHz ISM-båndet. Den samme mottakertype ble brukt på den andre siden av overføringsbane. Denne andre transceiver var koblet til en datamaskin via en USB-port. Overføringsbane ble brukt for toveis dataoverføring sende ekstracellulære registrert signalene fra dyret til datamaskinen og omvendt kontrollparameterne signalforsterkning og stimulering fra datamaskinen til dyret.

Bruker TWS, var det mulig å registrere multi-unit hjerneaktivitet og endre dyrets virkemåten ved å stimulere den underlegne colliculus mens rotta var beveger seg fritt i åpne-feltet. Mottakeren ble satt opp i 5 m fra dyret og var koblet til datamaskinen via en USB-port (se figur 2). En sammenligning av de innspilte signal kvalitetene gitt med den bundet og trådløse systemet er vist i figur 5. TWS poster multi-unit aktiviteten med en lignende signalkvalitet som kablet opptak system. Mikro-stimulator er en sann trådløse stimulator som oppdaterer stimulering parametere i sanntid, dvs stimulering signalet, hvis parametere er definert med TWS programvaren sendes til stimulering elektroden koblet til hodet scenen i noen millisekunder etter at knappen stimulering. Derfor var det mulig å endre stimulasjonsparameteret uten å ta dyret ut av buret. Denne funksjonen har fordelen at en kan minimere tiden for stimulering eksperimenter.

En TWS programvare ble utviklet for å gi kontroll over alle funksjonene i trådløse systemet (opptak og stimulering) via en grafisk bruker grenseflate (Figur 3 og Figur 4). For mikro-stimulering, et stimulering signal ble brukt som ble utviklet ved hjelp av det grafiske brukergrensesnittet TWS programvaren. Stimulator av TWS ble brukt i en gratis balansert konstant gjeldende stimulering modus. Stimulering mønsteret ble sendt trådløst til konstant gjeldende stimulator integrert i hodet scenen trådløse enheten. Stimulering gjeldende ble brukt mellom en arbeider microelectrode plassert i mål av interesse (for eksempel de underlegne colliculus studien) og en større fjernt counter elektrode som fungerte som bakken eller referanse elektroden av TWS. Avhengig av stimulering elektrode impedans og spenning overholdelse av konstant gjeldende stimulator er det mulig å bruke en maksimal stimulering dagens utvalg av ±625 µA, men en mye lavere gjeldende terskel var påkrevd i stede eksperimenter. Her bifasisk kostnad balansert konstant gjeldende stimulering ble brukt med peak strøm opp til 300 µA. Ved bifasisk stimulering, første pulsen til å lokke fram den fysiologiske effekten og andre pulsen reverserer vanligvis elektrokjemiske prosessene som oppstår under stimulering puls18. TWS hodet scenen leverer sanntid stimulering mønstre satt via det grafiske bruker grenseflate av TWS programvaren (se Figur 4).

TWS programvaren er delt inn i tre hoveddeler: (i) hovedvinduet med kontroller for opptak og stimulering, et (ii) stimulans generator vindu med alle innstillingsmuligheter for parameterne stimulering signal og en (iii) replayer vinduet for avspilling av innspilte datafiler. Hovedvinduet tillater brukeren å vise registrert signalene opptil 4 opptak kanaler, angi forsterkningen for alle kanaler og start/stopp innspilling vises signaler. Signal dataene lagres i en fil på datamaskinen harddisken. Filbanen angis i konfigurasjonsmenyen. Resten av opptaket parameterne innrømmer hovedvinduet å starte og stoppe stimulering prosessen. Konstant stimulering gjeldende som overføres via stimulering elektroden i dyr hjernen vises i sanntid på skjermbildet hovedvinduet. Parameterne for stimulering signalet er pre justert i vinduet stimulans parameter innstillinger. Det er mulig å definere mono- eller bifasisk stimulering puls tog og for å sette alle brukte stimulering puls parametere som for eksempel puls bredde, puls amplitude, tid mellom pulser, etc. (for detaljer se Figur 4). Stimulering puls funksjonen som forhåndsvalgt parameterverdiene vises i en grafisk visning i vinduet stimulering generator.

TWS programvaren er utviklet etter brukervennlighet aspekter. Brukbarheten av programvaren er en viktig faktor å garantere glatt kjører av trådløse stimulering/opptak eksperimentet og et trygt og komfortabelt arbeidsmiljø. Det hjelper også for å forbedre reproduserbarhet av eksperimentet.

Enheter datainnspilling og elektrisk stimulering

Ekstracellulære multi-unit aktivitet ble suksessivt innspilt i de underlegne colliculus fra samme implantert elektroden i TWS og en tradisjonell bundet innspillingssystem. Figur 5 viser representant rådata registrert bruker begge systemer mens dyret var fritt bevegelige i et åpent felt. Direkte sammenligning av signaler antyder lignende spike bølgeformer og støy (figur 5A og 5B). En demonstrasjon av skjemaet pigg er avbildet i A 'og B'.

Siden rotter ikke forsøkte å fjerne TWS hodet scenen etter operasjonen og under påfølgende dager, var det antatt at det ikke betydelig forstyrre deres bevegelser og ikke forårsake ubehag. Dermed bruker TWS, var et vanlig problem i bundet opptak av rotter unngås som fjerning og chewing av kontakter og kabler. Rotter med TWS hodet scenen var faktisk kunne utforske åpne-feltet og pluss labyrinten (sEE film 1) stiller normal overskæringer, Stell og grooming atferd.

I tillegg stimulering parameterne som brukes med TWS eller konvensjonelle bundet systemet utløste samme atferdsmessige utfallet, unnslippe her atferd. Fra 100 µA, ble stimulering gjeldende amplituden økt trinnvis til flukt terskelen - minimum gjeldende intensitet produsere kjører eller hoppe - ble nådd og flukt virkemåten var elicited. Individuelle escape grensene av 4 rotter var like ved begge systemene (figur 5C).

Figure 1
Figur 1: TWS microelectrode enhet (1) registrering enkelt elektrode/sperrende, (2) stimulering elektrode, (3) elektroden fiber tilkobling styret, (4) fleksibel tilkoblingskabler, (5) jording, (6) kontakt styret, (7) mann eller kvinne kontakt for TWS system (A); TWS microelectrode enhet koblet til forforsterker (8) og holder (9); (B) klar til å være knyttet til en stereotaxic ramme (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Ovenfra TWS hodet scenen montert modul (A) uten akkumulator strømforsyning. Totale dimensjoner: høyde 12,5 m, dybde 24 mm (19,3 mm + 4.7 mm), bredde 22,1 mm, vekt: 5.96 g. nedenfra (B) viser elektrode enhet kontakt; akkumulator makt levere, høyde 9 mm, dyp 26 mm bredde 20 mm, vekt 6 g (C); en oversikt over TWS komponentene som brukes for denne testen: (1) hodet scenen enhet med akkumulator montert på animal´s skallen, (2) sender enheten koblet til datamaskinen USB-port, (3) TWS programvare (D); bilde av rotte fritt flytte og viser TWS hodet scenen koblet til microelectrode enheten tidligere implantert (E) og TWS programvare viser eksemplarisk innspilte signaler (F). TWS hodet scenen leverer sanntid stimulering mønstre satt via grafisk bruker grenseflate av TWS programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: TWS programvare grafisk bruker grenseflate, innspillingen skjermen. Innspillingen ytelsen til TWS med en enkelt bipolar opptak elektrode, implantert i de underlegne colliculus, er avbildet på skjermen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: TWS programvaregrensesnittet. stimulering skjermen (A) og stimulering parameteren spesifikasjoner (B). Stimulering signal parametere (C) som pulsbredde (PxW), puls amplitude (PxA), inter puls forsinkelse (IPD), mellom pulser (TBP), puls per tog (PPT) og mellom tog (TBT) justeres via TWS programvare grafisk bruker grenseflate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Kvalitativ sammenligning mellom et multi-unit signal registrert extracellularly med TWS (A) og en kablet opptak oppsett (B). Begge opptakene ble Hentet fra samme TWS microelectrode enhet (impedans 0.5MOhm) implantert i dårligere colliculus. Akseavstand mellom to opptak elektrode kontaktene var ca 400 µm. Opptak båndbredde kablet systemet og TWS var identiske (500 Hz... 5 kHz), signaler ble valgt med 40 kHz (kabel system) og 32 kHz (TWS). Begge systemene registrert multi-unit aktivitet med en lignende signalkvalitet. Det er ingen klar forskjell i avfyring priser mellom TWS og kablet innspillinger. Handlingen potensial bølgeform av Nevron fra begge opptakene vises i A 'og B'. Lignende stimulering parametre var nødvendig for 4 rotter å nå flykte terskelen bruker bundet system (TS) eller TWS (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie
Film 1: En eksemplarisk rotten viser utforskende normalt under pluss labyrint test TWS gir dyret til å angi åpen og lukket armene uten ledninger å bli tangled opp i den teste apparatet, men det er små og lette nok slik at det bare minimal griper inn i selve. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Her, ble en allment tilgjengelige trådløse opptak og stimulering system for elektrofysiologiske og atferdsmessige studier i fritt flytte dyr presentert. TWS har blitt validert i atferdsdata analyser med dårligere colliculus som en modellen struktur. TWS tilnærmingen har flere fordeler sammenlignet med eksisterende. Først systemet bruker en enkelt bærbar TWS hodet-scenen en forforsterker og et oppladbart batteri, gir stabil langvarige opptak opptil 1t med samme batteri og trådløs operasjoner avstand for opptil 5 m. andre, TWS hodet scenen lett og kompakt, veier 12 g inkludert batteri, og ble utviklet for å hindre rotta fra fjerne hodet scenen og tygge ledningene. Det ble godt tolerert av dyrene siden ingen innvirkning på animal´s opptreden repertoaret med og uten TWS hodet scenen ble observert, gjør systemet gjelder for et bredt spekter av atferdsmessige oppgaver. For det tredje, sender systemet i sanntid. Fjerde gjennom samtidige toveis opptak og stimulering av nevrale aktivitet gir systemet et avansert verktøy for å vurdere årsaksforhold mellom spesifikke hjernens aktivisering mønstre og atferd, dermed overvinne manglene enveis systemer. Denne funksjonen gjør metoden spesielt verdifull for feltet i dyp hjernestimulasjon, som vanligvis krever nøyaktig vurdering, overvåking og justering av stimulering parametere under langsiktige atferdsmessige eksperimenter. Til slutt, en kronisk implanterbare microelectrode enhet ble utviklet med integrert opptak, stimulering og referanse elektrode som lett kan bli implantert i en konvensjonell stereotaxic kirurgi. Fra dette synspunkt er TWS et integrert trådløst system som øker reproduserbarhet stimulering og opptak eksperimenter. Innspillingskvaliteten er av TWS viste seg å være lik innspillingskvaliteten er gitt med en kommersielt tilgjengelig kablet innspillingssystem (se figur 5).

Det er allment kjent at elektrisk stimulering av de dårligere colliculus i rotte utløser klart escape atferd preget av kjører eller hopping, som etterligner reaksjoner på frykt fremkalte av miljøutfordringer11,12, 13. Dette ble indusert studien ved å stimulere den underlegne colliculus TWS eller tradisjonell bundet systemet. For å teste stimulering effekten av TWS, ble flukt tersklene-minimum gjeldende intensitet produsere kjører eller hoppe-sammenlignet med begge systemene. Rotter med TWS hodet scenen kan kjøre raskt, hoppe og klatre ut av feltet åpen, viser dvs typisk escape atferden, med større bevegelsesfrihet. Viktigere, var rømme grensene lik sammenlignet med tradisjonelle bundet system. Sammen, ble en ganske utfordrende paradigme brukt til å teste elastisitet av TWS, som det mestret på en problemfri måte.

TWS er også egnet for kronisk elektrisk stimulering eksperimenter siden microelectrode enheten implantert tillater kronisk bruk. TWS kan justere parameterne stimulering gjeldende meget presist på en måte å nøyaktig oppdage hyppighet og mengde stimulering gjeldende som er effektive for å lokke fram en behavioral respons. I tillegg det samme dyr ble stimulert med samme gjeldende terskelen 3 dager senere og det samme ønskede opptreden svaret var elicited. Dette tyder på at vevet rundt stimulering elektrode spissen ikke ble skadet av stimulering gjeldende som vanligvis krever økt stimulering gjeldende amplituder med gjentatte stimulations for å lokke fram de samme atferdsmessige respons.

Videre er det mulig å redusere eksperimentelle tiden fordi TWS mikro-stimulator oppdaterer stimulering parametere i sanntid når eksperimentator endres dem i det grafiske brukergrensesnittet. Andre elektro stimulators19 brukt i preklinisk forskning trenger for å omprogrammeres stimulans parameteren oppdateringen. I disse tilfellene, er enheten programmert av tethering dyret via kabel til en programmeringsenhet. Dette er ikke nødvendig når du bruker TWS.

Til slutt, batteriet er festet til toppen av TWS hodet scenen og elektrisk koblet til hodet scenen via en to-pins magnet-kontakt for enkel utveksling av batteriet. Fordelen er at under eksperimentet er det mulig å endre batteriet uten å koble TWS hodet scenen fra implantert elektrode enheten, som er mye mer behagelig til dyret. Under studien brukte vi et batteri som operasjonen er bare 1 h. I tilfelle eksperimentet tar lengre tid enn 1t, anbefales det å ha et ekstra batteri. TWS kan kobles til oppladbare batterier med kapasitet på (i) 230 mA for 1t operasjonstid eller (ii) 450 mA for ca 2,5 t operasjonstid. Begge typer batterier kan lades fullt i 15 minutter.

Oppsummert beskriver studien driften av TWS designet for nevrale stimulering og opptak fra fritt oppfører seg liten dyrene. En fullstendig integrert sett av implanterbare microelectrode enhet, hodet scenen, mottaker og presenteres også. Kvaliteten på trådløse opptak og stimulering er lik at av de bundet innspilling system med fordelen av å være mer komfortabel, lett og trygt å dyret. Derfor kan TWS brukes til å erstatte bundet systemet siden det begrenser ikke dyrets mobilitet og gir en fleksibel metode for å kontrollere stimulering og nevrale opptak under omstendigheter hvor andre tilnærminger ville være vanskelig eller umulig. TWS kan derfor være et viktig verktøy for å undersøke hvordan elektrisk aktivitet i definerte nevrale kretser genererer visse former for atferd, et grunnleggende spørsmål i nevrovitenskap.

Disclosures

Medforfattere Uwe Thomas og Sascha Thomas er eiere av "Thomas opptak GmbH", som er å utvikle produkter brukt i denne studien og relatert til generell forskning emnet beskrevet i dette dokumentet. I tillegg mottar medforfatter Dirk Hoehl inntekter fra "Thomas opptak GmbH". De kan ha nytte økonomisk fra dette forholdet hvis selskapet lykkes i å markedsføre sine produkter som er knyttet til denne forskningen. "Thomas registrering" utstyret brukes i denne studien var dedikert til Institutt for biologisk psykologi, Experimental og biologisk psykologi - Philipps Universität Marburg uten kostnad.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning forskning fra tysk føderasjonen av industriell forskning foreninger (AiF, gi nummer: KF2780403JL3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 Thomas RECORDING GmbH AN001165 The Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 is a portable multichannel telemetry system with laptop computer, a preinstalled Microsoft Windows operating system and TWS control software. The TWS includes: low noise 4 channel pre– and programmable main amplifier with fixed bandwidth, single channel constant–current stimulator for application of biphasic current pulses, software programmable micro stimulator, implantable connector system and a basic head stage unit for mounting to an animal. The system is delivered with a transceiver with USB port connection for laptops or desktop personal computers, the control software running under Microsoft operating system Windows. The TWS system can be used for extracellular neural stimulation and recording in freely behaving small animals (e.g. rats, guinea pigs). This system can be adapted to be used in larger animals (e.g. primates) as well.
Software for Thomas Wireless System (TWS) Thomas RECORDING GmbH inlcuded in AN001165 The software for the Thomas wireless system is running under Microsoft Windows operating system and provides the graphical user interface (GUI) for the Thomas Wireless System (TWS). The TWS GUI offers complete control of the TWS functions 4 channel recording and 1 channel stimulation.
Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001132 Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording tetrode specifications: tetrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, tetrode fiber outer diameter: 100µm, tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance: 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm, dimensions of the electrode can be specified by the end user
Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) Thomas RECORDING GmbH AN001118 Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS).
Recording electrode specifications: electrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, electrode fiber outer diameter: 80µm/250µm (please specify), tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance. 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm
Holder for electrode implantation Thomas RECORDING GmbH AN000838 Special bent metal rod for microelectrode implantation for standard electrode holders. The rod is used to hold an implantable electrode. The implantable electrode is fixed to the rod with special Thomas RECORDING water soluable glue (AN001080). (Electrode holder is not included)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/230mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001208 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 230mA for approximately 1h operation time. (size: 27mm x 20mm x 6mm, weight app. 6g)
Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/450mAh) Thomas RECORDING GmbH AN001209 Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 450mA for more than 1h operation time. (size: 48mm x 30mm x 4mm, weight app. 11g)
Accumulator charger for Thomas Wireless System (TWS) rechargable accumulator Thomas RECORDING GmbH AN001207 Mains powered charger for the Thomas Wirless System (TWS) rechargable accumulators (AN001209 and AN001209)
Water soluble glue Thomas RECORDING GmbH AN001080 Thomas RECORDING water soluble electrode glue is a specially selected product for use with implantable microelectrodes in neuroscientific research. Its unique properties ensure a rigid connection between electrode and mounting device although it is easily removable with warm water. The Thomas RECORDING water soluble electrode glue can be used out-of-the-box, without any time consuming preparation. Thomas RECORDING water soluble electrode glue is not harmful to humans, animals or the environment. Quantity: 1 box of 10 gramms
Miniature differential preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000329 The Miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2 is a 2-channel, differential input preamplifier that is designed for low noise recordings from excitable tissue. It is intended for extracellular recording in conjunction with the implantation of implantable microelectrodes for freely moving animal appliactions with the Thomas Wireless System (TWS). The 2-Channel Miniature Differential Preamplifier (MDPA-2) is connected to the implantable microelectrodes for providing the initial tenfold amplification stage. Ideally Thomas RECORDING quartz glass insulated platinum/tungsten electrodes are used to yield optimal recording results with high signal amplitudes and low noise levels. The MDPA-2 has additional common ground and reference electrode inputs.
Connection cable Thomas RECORDING GmbH AN000330 Connection cable to connect the Thomas Miniature differential preamplifier (MDPA-2) to a main amplifier and an accumulator power supply.
Rechargeable power supply for the miniature preamplifier Thomas RECORDING GmbH AN000328 Rechargeable accumulator power supply for the Miniature differential preamplifier (MDPA-2).
Accumulator charger (US) Thomas RECORDING GmbH AN000167 Accumulator charger for the power supply AN000328 (US mains power outlet conenctor)
Accumulator charger (EU) Thomas RECORDING GmbH AN000168 Accumulator charger for the power supply AN000328 (EU mains power outlet connector)
Differential preamplifier/main amplifier/bandpass filter Thomas RECORDING GmbH AN000677 TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) is a single-channel, differential main amplifier for neurophysiological applications (e.g. extracellular recording with microelectrodes). This Instrument is designed to work with the miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2. The single channel of the LabAmp-03 contains a high-gain, low-noise differential amplifier stage followed by low frequency and high-frequency filters. The amplifier has two different filter amplifiers, a single unit activity (SUA) filter –amplifier and a local field potential (LFP) filter amplifier, both are connected parallel in the signal path. Record Mode offers two levels of signal gain (x10, x100) in a first stage and 4 additional levels (x5, x10, x25 and x50) in a final amplifier stage. Each amplifier has different bandpass characteristics for single unit activity (SUA) 500Hz…20kHz and local field potentials (LFP) 0,1Hz…140Hz. An audio monitor and a window discriminator is integrated in the device. The LabAmp-03 has an integrated audio monitor with loudspeaker. This unit provides audio reproduction of electrophysiological signals. The unit combines an audio amplifier in a compact, rugged package. This is especially suited to monitoring neural firing and muscle contractions. The audio monitor input is internally connected to the SUA-Filter amplifier output. The LabAmp-03 is delivered with external power supply for a mains power operation voltage range of 100-240V AC/50-60Hz.
USB Oscilloscope Thomas RECORDING GmbH AN001096 USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. This 2-channel PC oscilloscope is perfect suitable for mobile use on a laptop and permanent installation in control cabinets, industrial equipment and many other applications where a small, lightweight and powerful oscilloscope is required. This oscilloscope is connected to the signal output of the main amplifier is for display of recorded extracellular activity during the implanation of the implantable microelectrodes for the Thomas Wireless System (TWS). The user can acquire the measurement data over the several data-interfaces directly on the PC with includes PC software.
Stimulus generator Multichannel Systems STG3008-FA Stimulus Generator for Current (STG) and Voltage Driven Stimulation fulfill three functions: current driven stimulation, voltage driven stimulation, controlling and timing. The STG is available with 2, 4 or 8 independet output channels. Featuring integrated isolation units for each output channel, the STG is able to provide any arbitrary waveform.
Cap protector for the electrode Thomas RECORDING GmbH AN001193 Protective cap for implantable electrode unit for the Thomas Wireless System
Surgical equipment Scissors, blunt-end forceps, spatulas, surgical clippers, dental drill, and cotton buds
Drugs and chemicals Isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), dexpantenol eye salve (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% hydrogen peroxide, povidone-Iodine (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) and 70% ethanol;
Fixation material including Stainless steel screws (BN650 M1.2x5; 4.7 mm ), acrylic resin (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), ultraviolet glue (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germany) and cap protector (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany);
Additional material Gloves, heating pad, syringes, and physiological saline.
Small Animal Stereotaxic Instrument (SASI) Thomas RECORDING GmbH AN000287 The model should be chosen according to the animal (rat, guinea pig, monkeys, etc) used in the study
Video camera EverFocus EverFocus, model: EQ150
Open field Made of transparent or gray acrylic, having round shape measuring 40x40x40cm
Elevated plus maze Made of gray acrylic and consisted of two open arms (50 cm long x 10 cm wide) and two closed arms (50 cm long x 10 cm wide, with 40 cm high walls) that extended from a central platform elevated 50 cm above the floor.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, R. P., Mielke, F., Bobrov, E., Brecht, M. Vocalization-whisking coordination and multisensory integration of social signals in rat auditory cortex. Elife. 3, e03185 (2014).
  2. Tseng, W. T., Yen, C. T., Tsai, M. L. A bundled microwire array for long-term chronic single-unit recording in deep brain regions of behaving rats. J. Neurosci. Methods. 201, (2), 368-376 (2011).
  3. Ball, D., et al. Rodent scope: a user-configurable digital wireless telemetry system for freely behaving animals. PLoS One. 9, (2), e89949 (2014).
  4. Chien, C. N., Jaw, F. S. Miniature telemetry system for the recording of action and field potentials. J. Neurosci. Methods. 147, (1), 68-73 (2005).
  5. Hawley, E. S., Hargreaves, E. L., Kubie, J. L., Rivard, B., Muller, R. U. Telemetry system for reliable recording of action potentials from freely moving rats. Hippocampus. 12, (4), 505-513 (2002).
  6. Alam, M., Chen, X., Fernandez, E. A low-cost multichannel wireless neural stimulation system for freely roaming animals. J. Neural. Eng. 10, (6), 066010 (2013).
  7. Xu, S., Talwar, S. K., Hawley, E. S., Li, L., Chapin, J. K. A multi-channel telemetry system for brain microstimulation in freely roaming animals. J. Neurosci Methods. 133, (1-2), 57-63 (2004).
  8. Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals. Sci. Rep. 4, 5963 (2014).
  9. Ativanichayaphong, T., He, J. W., Hagains, C. E., Peng, Y. B., Chiao, J. C. A combined wireless neural stimulating and recording system for study of pain processing. J. Neurosci. Methods. 170, (1), 25-34 (2007).
  10. Ye, X., et al. A portable telemetry system for brain stimulation and neuronal activity recording in freely behaving small animals. J. Neurosci. Methods. 174, (2), 186-193 (2008).
  11. Brandão, M. L., Tomaz, C., Leão-Borges, P. C., Coimbra, N. C., Bagri, A. Defense reaction induced by microinjections of bicuculline into the inferior colliculus. Physiol Behav. 44, 361-365 (1988).
  12. Brandão, M. L., Melo, L. L., Cardoso, S. H. Mechanisms of defense in the inferior colliculus. Behav Brain Res. 58, 49-55 (1993).
  13. Melo, L. L., Cardoso, S. H., Brandão, M. L. Antiaversive action of benzodiazepines on escape behavior induced by electrical stimulation of the inferior colliculus. Physiol Behav. 51, 557-562 (1992).
  14. Paxinos, G., Watson, P. The rat brain in stereotaxic coordinates. 3rd ed, Academic Press. San Diego, CA. (2007).
  15. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2, (2), 322-328 (2007).
  16. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 14, 149-167 (1985).
  17. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  18. Merrill, D. R., Bikson, M., Jefferys, J. G. Electrical stimulation of excitable tissue: design of efficacious and safe protocols. J Neurosci Methods. 141, 171-198 (2005).
  19. Ewing, S. G., Porr, B., Riddell, J., Winter, C., Grace, A. A. SaBer DBS: A fully programmable, rechargeable, bilateral, charge-balanced preclinical microstimulator for long-term neural stimulation. J Neurosci Methods. 213, 228-235 (2013).
En trådløs, toveis grensesnitt for <em>In Vivo</em> -opptak og stimulering av nevrale aktivitet i fritt oppfører seg rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melo-Thomas, L., Engelhardt, K. A., Thomas, U., Hoehl, D., Thomas, S., Wöhr, M., Werner, B., Bremmer, F., Schwarting, R. K. W. A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (129), e56299, doi:10.3791/56299 (2017).More

Melo-Thomas, L., Engelhardt, K. A., Thomas, U., Hoehl, D., Thomas, S., Wöhr, M., Werner, B., Bremmer, F., Schwarting, R. K. W. A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats. J. Vis. Exp. (129), e56299, doi:10.3791/56299 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter