Summary
En trådløs, tovejs system for multi-kanal neurale optagelser og stimulation i frit opfører rotter er indført. Systemet er let og kompakt, således at have minimal indflydelse på animal´s adfærdsmæssige repertoire. Desuden, denne tovejs system giver et sofistikeret værktøj til at vurdere årsagssammenhænge mellem hjernen aktivisering mønstre og adfærd.
Abstract
In vivo Elektrofysiologi er en kraftfuld teknik til at undersøge forholdet mellem hjerneaktivitet og adfærd på et millisekund og mikrometer skala. Men nuværende metoder for det meste stole på tøjret kabel optagelser eller kun bruge envejs systemer, så enten optagelse eller stimulation af neurale aktivitet, men ikke på samme tid eller samme mål. Her, en ny trådløs tovejs enhed for samtidige multikanals optagelse og stimulering af neurale aktivitet i frit opfører rotter er beskrevet. Systemet fungerer ved hjælp af en enkelt bærbar hoved fase, der både sender registrerede aktivitet og kan være målrettet i realtid for brain stimulation ved hjælp af en telemetri-baserede multikanals software. Hoved scenen er udstyret med en forforstærker og et genopladeligt batteri, så stabil langsigtet optagelser eller stimulation for op til 1 h. vigtigere, hoved scenen er kompakt, vejer 12 g (inkl. batteri) og dermed har minimal indvirkning på animal´s adfærdsmæssige repertoire, hvilket gør metoden anvendes til en bred vifte af adfærdsmæssige opgaver. Metoden har endvidere den store fordel, at effekten af brain stimulation på neurale aktivitet og adfærd kan måles samtidigt, giver et værktøj til at vurdere årsagssammenhænge mellem specifikke hjernen aktivisering mønstre og adfærd. Denne funktion gør metoden særligt værdifulde for feltet af dyb brain stimulation, giver mulighed for præcis vurdering, overvågning og tilpasning af stimulation parametre under langsigtede adfærdsmæssige eksperimenter. Anvendeligheden af systemet er valideret ved hjælp af den ringere colliculus som en modelstruktur.
Introduction
Et grundlæggende spørgsmål i neurovidenskab er hvordan elektriske aktivitet i definerede neurale kredsløb genererer visse former for adfærd. In vivo Elektrofysiologi er en kraftfuld teknik til at behandle dette spørgsmål, giver et værktøj til at optage eller stimulere elektriske aktivitet i hjernen, mens dyr klarer sig visse adfærdsmæssige opgaver. Men, nuværende systemer ofte stole på tøjret kabel optagelser1,2, sandsynligvis begrænse mobiliteten og forhindrer fuld udtryk for animal´s adfærdsmæssige repertoire. Desuden er overvejende envejs systemer brugt, tillade enten optagelse3,4,5 eller stimulation6,7 af neurale aktivitet, men ikke på samme tid eller samme mål, gør det vanskeligt at udrede årsagssammenhænge mellem specifikke hjernen aktivisering mønstre og adfærd. Kun et par trådløse, tovejs systemer for i vivo præparater er i øjeblikket tilgængelige. Men de er normalt tunge (40-50 g) og består af to separate bærbare enheder, dvs en hoved fase og en tilsluttet rygsæk til batteri-baserede power supply8,9,10, gør dem mindre fleksibel og øger risikoen for kabel frakobling fx under selvstændige grooming adfærd. Ingen af de ovennævnte trådløse systemer tilbyder implantable mikroelektrode enheder for at erhverve en komplet integreret begrebet den neurale aktivitet under fuld ethologically gyldig adfærd med høj reproducerbarhed af de eksperimentelle betingelser.
Her, er en ny trådløs, tovejs enhed i vivo optagelser og stimulering af neurale aktivitet i frit opfører rotter indført. Thomas trådløse System (TWS) opererer gennem en enkelt flytbare hoved fase, som kan overføre multikanals aktivitet ved hjælp af op til fire uafhængige optagelse kanaler og kan være målrettet for elektriske hjernestimulation i realtid. Derudover blev en kronisk implantable mikroelektrode enhed kompatibel med TWS udviklet at tillader både neurale stimulation og optagelse. En TWS software anskuelighed brugergrænseflade, for optagelse og stimulation er også præsenteret. Denne undersøgelse beskriver en validering og i vivo gennemførelse af hele enheden.
For at validere TWS system blev den ringere colliculus valgt som en neurale målstrukturen, fordi en åbenlys adfærdsmæssige reaktion kan være fremkaldt af dens elektrisk stimulation. Det er almindeligt kendt, at den elektriske stimulation af den ringere colliculus fremkalder ubetingede "frygt-lignende" adfærdsmæssige reaktioner hos rotter, som årvågenhed, sidelæns arbejdsstillinger, magnetisek af ryggen, frysning og flugt (fly) adfærd. Dette svar mønster efterligner reaktioner at frygte evoked af miljømæssige udfordringer, såsom opfattede skadevoldende begivenhed, angreb eller trussel mod overlevelse11,12,13. Det blev antaget, at være i stand til at fremkalde sådan en klar og utvetydig adfærd ville give en reel udfordring til TWS.
Protocol
alle protokoller og eksperimenter var i overensstemmelse med de nuværende europæiske retningslinjer (2010/63/EU) og godkendt af de regionale myndigheder (Regierungspräsidium Gießen, hr. 20/35 Nr.25/2015).
1. dyr
- hus mandlige voksne Wistar rotter (200-250 g) i grupper af 3-4 under standard laboratorieforhold for mindst en uge før operation for at tillade akklimatisering.
- To dage efter operationen, hus rotter parvis. Dække enkelt bure med høj akryl låg. Undgå konventionelle låg lavet af metal gitter, da implantater kan sidde fast, øger den risiko, at de bliver beskadiget og/eller ustabil over tid.
2. Stereotactic kirurgi
- før du starter operationen, organisere og forberede den følgende udstyr og materialer:
- Hent steril kirurgiske udstyr består af steril saks, blunt-ende pincet, spatler, kirurgisk negleklipper, dental analyser og bomuld knopper.
- få narkotika og kemikalier, herunder isofluran, xylocaine, tramadol hydrochlorid, dexpantenol øjet salve, 3% brintoverilte, povidon jod og 70% ethanol.
- Få fiksering materiale herunder rustfrit stål skruer, akryl harpiks, ultraviolet lim og cap protector.
- Få en mikroelektrode enhed, bestående af (i) en optagelse enkelt elektrode (kvartsglas isoleret platin wolfram mikroelektrode, med koniske tip form, ydre diameter: 80 µm, koniske tip, impedans på 1 kHz: 500 kOhm) eller en triode (kvartsglas isolerede platinum/wolfram 4 kerner mikroelektrode, ydre diameter: 100 µm, koniske tip, impedans ved 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) en stimulation elektrode (platinum/iridium wire (90% platinum, 10% iridium), kerne diameter 125µm, ydre diameter 150 µm, impedans < 10 kOhm) tilsluttet en kontakt plade og (iii) en platin wire referenceelektrode (aksel diameter, 100 µm; figur 1A).
- Hent elektrode indehaveren Limes med vandopløselig lim til mikroelektrode enhed og testet for funktionalitet mindst 2 h på forhånd ( figur 1B).
- Få en konventionel tøjret system bestående af en differentieret forforstærker, en vigtigste forstærker og en bandpass filter forstærker til optagelser.
- Få yderligere materiale såsom handsker, varme pad, sprøjter og fysiologisk kogsaltopløsning.
- Få hjem bure (L x b x H: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
- Procedure
Bemærk: elektrode implantation er udført i løbet af en konventionel stereotactic kirurgi under isofluran anæstesi.- Sikrer at eksperimentatoren iført handsker, kirurgisk maske og laboratoriekittel.
- Indlede anæstesi placere dyret i en induktion kammer (isofluran 4-5%, ilt flow 1 L/min, varighed ~ 5 min.).
- Test for tab af reflekser (hale og tå reflekser) med pincet til at bekræfte dyb anæstesi.
- Hovedet af dyret i en anæstesi maske fast omkring den øverste chopper bar af stereotactic rammen og justere anæstesi (isofluran 2-3%, ilt flow 0,7-0,8 L/min.).
- Fix og vandret Juster dyret ' s hoved i stereotactic apparatet ved hjælp af øret barer og øvre chopper bar
- Barbere kirurgisk feltet kirurgisk neglesaks eller en saks og sterilisere med povidon-jod.
- Placere dyret på en varmepude til at forhindre hypotermi og behandle øjne med dexpantenol øjet salve til at forebygge dem fra tørring.
- Indsprøjtes xylocaine (0,3-0,4 mL, subkutant, s.c.) i midten af feltet kirurgisk.
- Test for tab af reflekser igen.
- Gør et lille snit (1,5 cm) med en skalpel i midten af feltet kirurgisk at eksponere kraniet. Adskille huden blidt og fjerne resterende væv pincet, saks og spatel.
- Grundigt rense kraniet ved hjælp af hydrogenperoxid-belagt vatpinde.
- Bore 4-5 små huller (4,7 mm) i kraniet til fiksering af rustfrit stål skruer.
- Tilsluttes forforstærker mikroelektrode enhed/elektrode indehaveren og tillægger de stereotactic micromanipulator ( figur 1B og 1 C).
- Bore et hul (ca. 7 mm) i kraniet ovenfor målområdet ved hjælp af koordinater fra en hjerne atlas ifølge dyret anvendes. I den foreliggende undersøgelse, placere de elektrode tips rettet mod den ringere colliculus ved hjælp af følgende koordinater med den bregma, der tjener som reference: forreste/bageste, − 8,8 mm; mediale/laterale, 1,5 mm; og dorsale/ventrale, 3,5 mm 14.
- Absorbere enhver blod med vatpinde.
- Lodret indføre mikroelektrode enhed indtil elektrode tips når målområdet.
- Placer jorden kabel langs rustfrit stål skruer og under huden.
- Skærm spike aktivitet og nøje justere elektrode placering med micromanipulator indtil nå en zone aktiv neuroner i målstrukturen og opdage neurale aktivitet med et signal / støj forholdet velegnet til spike sortering.
- Fix mikroelektrode enhed til kraniet med ultraviolet lim og dække kontakt plade og skruer med akryl harpiks.
- Indsprøjtes fysiologisk kogsaltopløsning (1 mL i.p.) og tramadol (25 mg/kg, s.c.) at forhindre dehydrering og sikre postoperativ analgesi, hhv.
- Afbryd mikroelektrode enhed fra elektrode indehaveren ved hjælp af en pensel dyppet i vand.
- Stop anæstesi, forsigtigt fjerne rotte fra den stereotactic ramme. Afbryde forforstærker fra mikroelektrode unit.
- Cap beskyttelsen på mikroelektrode enhed implanteret og frakoble det kun under de eksperimentelle procedurer.
- Holde dyrene parvis i hjem-bur fra den anden dag efter kirurgi.
- Skærm dyr daglige for mulige sårinfektion, kropsvægt, helbredstilstand og generelle opførsel for en periode på 7 dage efter operationen. Efter denne hvileperiode, udføre i vivo Elektrofysiologi og adfærdsmæssige eksperimenter.
Bemærk: Den kirurgiske procedure varer mellem 60-90 min. Under operationen, hale flick reflekser skal være løbende overvåges og anæstesi, om nødvendigt justeret.
3. In Vivo Elektrofysiologi
- udstyr og proceduren
Bemærk: elektrofysiologiske optagelser og stimulation udføres ved hjælp af TWS.- Få en hovedet fase med en integreret forforstærker og tilsluttet batteri (fire optagelse kanaler; analog optagelse inputområdet: 0-12 mV pk-pk; stimulation output: ±625 µA; L x b x H: 24 mm x 22 mm x 12 mm; vægt: 6 g uden batteri, 12 g med batteri; batteri kører tid op til 1 time). Dette hoved Stadium er egnet til at være direkte tilsluttet den indopererede mikroelektrode enhed via en miniature multipol stik ( figur 2).
- Hent et batteri (lithium ion akkumulator, 3,7-4,2 V DC, 230 mAh, 27 mm x 20 mm x 6 mm, 1 h drift tid) monteret på toppen af hovedet scenen ( figur 2 c). Hvis det er nødvendigt bruge genopladelige batteri med kapacitet på 450 mA for ca 2,5 h operationstid. Sørg for, at et grønt lys kommer i hovedet scenen mens batteriet er tilsluttet til den.
- Hent en transceiver (receiver-transmitter) forbundet til en pc via standard USB porten og giver trådløs drift op til 5 m ( figur 2E).
- Få en personlig computer med TWS software til elektrisk stimulation og optagelse af neurale aktivitet ( figur 3 og figur 4 < / stærk>).
- Få en tøjret forforstærker og en dataoptegningssystem, anvendes under operation (se punkt 2.1.5) for optagelser, og en stimulus generator for stimulation, for at sammenligne efficaciousness for TWS i vågen rotter en uge efter operationen.
Bemærk: Elektrisk stimulation er fastsat og ekstracellulære aktivitet fra enkelt neuroner er registreret fra den samme implanterede mikroelektrode enhed ved hjælp af begge systemer. Parametrene stimulation (nuværende intensitet, impuls og frekvens) skal justeres til hvert dyr efter regionen hjernen målrettet. I den foreliggende undersøgelse, en 150-250 µA, 2500 Hz strøm blev brugt til at stimulere den ringere colliculus.
- Adfærdsmæssige undersøgelser vedrørende
Bemærk: når ingen metal barriere er indført mellem transceiver og den animalske hoved fase, TWS finder anvendelse på en bred vifte af adfærdsmæssige opgaver. Som eksemplarisk adfærdsmæssige test, blev det brugt i det åbne område til måling af generelle adfærdsmæssige aktivitet og på forhøjet plus labyrint, en standard test til at vurdere angst-lignende adfærd i gnavere 15. En video kamera var placeret centralt over åben mark og forhøjet plus labyrint for adfærdsmæssige optagelser.- Forud for adfærdsmæssige test, håndtere hvert dyr på tre på hinanden følgende dage (5 min hver dag). Før hver håndtering periode slut hoved scenen med batteri til mikroelektrode enheden tidligere implanteret. Udfør ikke nogen optagelse eller stimulation under håndteringen.
- Åben mark
- placere rotten i midten af feltet åben (40 cm x 40 cm x 40 cm, rødt lys ~ 30 Lux) og gør det muligt at udforske apparater til mindst 5 min under indspilning af neurale.
- Afgøre undslippe tærskel - minimum nuværende intensitet producerer løb eller spring. I den foreliggende undersøgelse, levere en høj frekvens 2500 Hz stimulation (pulse bredde: 100 µs; puls interval: 100 µs) til den ringere colliculus i 1 min. intervaller øger den nuværende intensitet af 20-50 µA trin indtil rotter viste undslippe opførsel.
- Vende tilbage rotten til sit hjem bur, rydde feltet åben (0,1% eddikesyreopløsning) og tørre sig.
Bemærk: For at sammenligne stimulation effekten af TWS med traditionelle tøjret systemet proceduren beskrevet ovenfor blev udført ved hjælp af begge systemer.
- Forhøjet plus labyrint
Bemærk: plus-labyrinten bruges i disse eksperimenter var lavet af grå akryl og bestod af to åbne arme (50 cm lang x 10 cm bred) og to lukkede arme (50 cm lang x 10 cm bred, 40 cm høje mure) som strakte sig fra en central pla tform forhøjet 50 cm over gulvet 16.- Placere rotten i midten af plus-labyrint vender mod en åben arm og lad det frit udforske apparatet under fortsatte optagelse under 5 min.
- Registrere antallet af poster i, og tid brugt i åbne og lukkede arme over en periode på 5 min.
- Returnere rotten til sit hjem bur, ren (0,1% eddikesyre opløsning) og tør labyrint før hver test.
- Perfusion og histologi
- bedøver rotte med xylazin/ketamin (150 mg/kg og 100 mg/kg, henholdsvis; i.p.).
- Indopereret elektrode enhed tilsluttes stimulation kabel og anvende elektrisk stimulation (nuværende intensitet 50 µA, pulse bredde: 100 µs; puls interval: 100 µs) under 90 s for at producere en lille læsion omkring elektrode tip.
- Tager stimulation-kablet og perfuse dyr gennem venstre hjertekammer med fysiologisk saltvand efterfulgt af 200 mL 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M natrium fosfat buffer, pH 7.3 (for en detaljeret beskrivelse Se reference 17 ).
- Fjerne hjernen og fordybe det for 4 h i frisk fiksativ på 4 ° C.
- Kontroller temperaturen i de vigtigste kryostatkammeret er på -20 ° C.
- Fryse hjerner på tøris og skær dem i 50 µm seriel koronale sektioner ved hjælp af en kryostaten.
- Pletten sektioner med cresylviolet for at lokalisere positioner i Skudspidserne elektrode ifølge atlas af Paxinos og Watson 14.
Representative Results
TWS tekniske data
Det trådløse system tilbyder 4 uafhængige optagelse kanaler og 1 stimulation kanal. Ekstracellulære aktivitet blev afhentet af optagelse single core elektrode og videregivet til høj impedans signalinput til det trådløse system. Den optagede signal var pre forstærket (x200) af en AC-kombineret, differential input forforstærker og bandpass filtreret (fast signal båndbredde, 500 Hz... 5 kHz) til at registrere kun multi-enhed aktivitet, fordi i den nuværende undersøgelse den primære interesse var at optage enhed aktivitet og ikke lokale felt potentialer. Integreret programmerbare gevinst main-forstærker tilbyder software-justerbar gain for de fire optagelse kanaler (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). Komplet signalet kæden af det trådløse system tilbydes samlede gevinst værdier af x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 og x12800. Efter forstærkning og filtrering, var det analoge signal digitaliseret af en analog til digital konverter, moduleret med en høj frekvens luftfartsselskab og overføres via en radio transceiver ved hjælp af 2,4-2,5 GHz ISM båndet. Den samme transceivertype blev brugt på anden siden af stien transmission. Denne anden transceiver var forbundet til en computer via en USB-port. Transmission sti blev anvendt til tovejs dataoverførsel til at sende de ekstracellulære indspillet signaler fra dyret til computeren og vice versa kontrolparametre for signal forstærkning og stimulation fra computeren til dyret.
Brug TWS, var det muligt at registrere flere enhed hjerneaktivitet og ændre dyrets adfærd ved at stimulere den ringere colliculus, mens rotten bevæger sig frit i det åbne område. Transceiver var placeret op til 5 m fra dyret og var forbundet til computeren via en USB-port (Se figur 2). En sammenligning af de optagede signal kvaliteter givet med den tøjret og det trådløse system er vist i figur 5. TWS optegnelser multi-enhed aktivitet med en lignende signalkvalitet som en kabelforbundet registreringssystem. Mikro-stimulator er en ægte trådløse stimulator, der opdaterer stimulation parametre i realtid, dvs den stimulation signal, hvis parametre er defineret med TWS software er gået til stimulation elektrode tilsluttet hoved scenen inden for nogle millisekunder efter at skubbe knappen stimulation. Det var derfor muligt at ændre parametrene stimulation uden at tage dyret ud af buret. Denne funktion har den fordel, at man kan minimere tid for stimulation eksperimenter.
En TWS software var specielt designet til at tillade kontrol af alle funktioner i det trådløse system (f.eks. registrering og stimulation) via en anskuelighed brugergrænseflade (figur 3 og figur 4). For mikro-stimulation, et signal om stimulation blev brugt, var udviklet ved hjælp af den grafiske brugergrænseflade af TWS software. Stimulator af TWS blev brugt i en afgift afbalanceret constant-aktuelle stimulation tilstand. Stimulation mønster blev sendt trådløst til constant-aktuelle stimulator integreret i hovedet fase trådløse enhed. Stimulation nuværende blev anvendt mellem en arbejdende mikroelektrode placeret i mål af interesse (som for eksempel den ringere colliculus i den nuværende undersøgelse) og en større Fjern counter elektrode, der tjente som TWS jorden eller reference elektrode. Afhængigt af stimulation elektrode impedans og spænding overholdelse af constant-aktuelle stimulator er det muligt at bruge en maksimal stimulation nuværende række ±625 µA, selvom en meget lavere aktuelle tærskel var nødvendigt i de nuværende eksperimenter. Her er bifasisk afgift afbalanceret constant-aktuelle stimulation blev brugt med peak strømme op til 300 µA. I tilfælde af bifasisk stimulation, den første puls bruges til at fremkalde den fysiologiske virkning og den anden puls vender normalt elektrokemiske processer, der forekommer under stimulation puls18. TWS hoved scenen leverer realtid stimulation mønstre angives via den grafiske brugergrænseflade af TWS-softwaren (Se figur 4).
TWS software er inddelt i tre hovedafsnit: en (i) hovedvinduet med styringer til optagelse og stimulation, en (ii) stimulus generator vindue med alle indstillingsmuligheder for stimulation signal parametre og (iii) replayer vindue til afspilning af registrerede datafiler. Den hoved-rude tillader brugeren at vise de registrerede signaler af op til 4 kanaler, optagelse, indstille gevinst for alle kanaler og start/stop optagelse af de viste signaler. Signal-data er gemt i en fil på computer hard disk. Filstien angives i konfigurationsmenuen. Udover optagelse parametre, den hoved-rude giver mulighed for at starte og stoppe stimulering proces. Konstant stimulation nuværende, der er passeret gennem stimulation elektroden i den animalske hjernen vises i realtid på skærmbilledet hovedvinduet. Parametrene for stimulation signal er pre justeret i vinduet stimulus parameter indstillinger. Det er muligt at definere mono- eller bifasisk stimulation puls tog og for at indstille alle almindeligt anvendte stimulation puls parametre som for eksempel pulse bredde, pulse amplitude, tid mellem pulser, etc. (for detaljer se figur 4). Funktionen stimulation puls, at resultaterne fra før valgte parameterværdier er vist i et grafisk display i vinduet stimulation generator.
TWS software var designet efter usability aspekter. Anvendeligheden af softwaren er af afgørende betydning at sikre en jævn udvikling af trådløse stimulation/optagelse eksperiment og et sikkert og behageligt arbejdsmiljø. Det hjælper også for at forbedre reproducerbarhed af eksperimentet.
Single-enhed optagelse data og elektrisk stimulation
Ekstracellulær flere enheden aktivitet blev successivt indspillet i den ringere colliculus fra den samme indopereret elektrode ved hjælp af TWS og en konventionel tøjrede optagelse system. Figur 5 viser repræsentative rå data registreres ved hjælp af begge systemer, mens dyret var frit bevægelige på en åben mark. Direkte sammenligning af signalerne tyder på lignende spike waveforms og støjniveau (figur 5A og 5B). En demonstration af formen spike er afbildet i A 'og B'.
Da rotterne ikke forsøgte at fjerne TWS hoved fase efter operationen og under efterfølgende dage, blev det antaget, at det ikke væsentligt forstyrre deres bevægelser og ikke forårsage ubehag. Således, ved hjælp af TWS, et fælles problem i tøjret optagelser af rotter blev undgået såsom fjernelse og tygge af stik og kabler. Faktisk, rotter med TWS hoved scenen var i stand til at udforske det åbne område og plus labyrint (see Movie 1) udstillende normale overfarter, opdræt og grooming adfærd.
Derudover stimulation parametre anvendes med TWS eller konventionelle tøjret system fremkaldt det samme adfærdsmæssige resultatet, undslippe her adfærd. Startende fra 100 µA, blev stimulation nuværende amplitude øget trin for trin indtil tærsklen escape - minimum nuværende intensitet producerer kører eller hoppe - blev nået og undslippe adfærd blev fremkaldt. De enkelte undslippe tærskler 4 rotter var ens, når du bruger begge systemer (figur 5 c).
Figur 1: TWS mikroelektrode unit. (1) optagelse enkelt elektrode/triode (2) stimulation elektrode (3) elektrode fiber forbindelsen bord (4) fleksibel forbindelseskabler (5) jordledningen (6) stik bord, (7) mandlige eller kvindelige connector for TWS system (A); TWS mikroelektrode enhed tilsluttet forforstærker (8) og indehaveren (9); (B) klar til at blive tilknyttet et stereotaxisk ramme (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Ovenfra af TWS hoved fase monteret modul (A) uden akkumulator strømforsyning. Samlede dimensioner: højde 12,5 m, dybde 24 mm (19,3 mm + 4,7 mm), bredde 22,1 mm, vægt: 5.96 g. underside (B) viser elektrode enhed stik; akkumulator strømforsyning, højde 9 mm, dybde 26 mm, bredde 20 mm, vægt 6 g (C); en oversigt over komponenterne TWS anvendes til denne test: (1) hoved stage enhed med akkumulator monteret på animal´s kraniet, (2) transceiver enhed tilsluttet til computerens USB-port, (3) TWS software (D); Foto af en rotte frit flytte og viser TWS hoved scenen tilsluttet mikroelektrode enhed tidligere implanteret (E) og TWS software viser eksemplarisk indspillet signaler (F). TWS hoved scenen leverer realtid stimulation mønstre angives via anskuelighed brugergrænseflade af TWS software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: TWS software anskuelighed brugergrænseflade, optage skærmen. Optagelse udførelsen af TWS med en enkelt bipolar optagelse elektrode, implanteret i den ringere colliculus, er afbildet på skærmen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: TWS software anskuelighed brugergrænseflade. stimulation skærm (A) og stimulation parameter specifikationer (B). Stimulation signal parametre (C) som pulse bredde (PxW), puls amplitude (PxA), inter puls forsinkelse (IPD), tid mellem pulser (TBP), puls per tog (PPT) og tiden mellem togene (TBT) kan justeres via TWS software anskuelighed brugergrænseflade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kvalitativ sammenligning mellem en multi-enhed signal registreret extracellularly med TWS (A) og en kabelforbundet optagelse setup (B). Begge optagelser blev indhentet fra de samme TWS mikroelektrode enhed (impedans 0.5MOhm) implanteret i den ringere colliculus. Aksial afstanden mellem de to optagelse elektrode kontakter var ca 400 µm. Optagelse båndbredden for kablede system og TWS var identisk (500 Hz... 5 kHz), signaler blev udtaget med 40 kHz (wired system) og 32 kHz (TWS). Begge systemer indspillet multi-enhed aktivitet med en lignende signalkvalitet. Der er ingen klar forskel i fyring priser mellem TWS og kablede optagelser. Aktionspotentialet bølgeform af neuron fra begge optagelser er vist i A 'og B'. Lignende stimulation parametre var nødvendige for 4 rotter at nå undslippe tærskel ved hjælp af en tøjret system (TS) eller TWS (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: En eksemplarisk rotte udviser normal sonderende adfærd under den plus labyrint test. TWS giver dyret ind i åbne og lukkede arme uden ledninger at få sammenfiltrede op i testapparater, men det er lille og let nok, således at det kun minimalt griber ind i opgaven, selv. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Discussion
Her, blev et bredt tilgængelige trådløse optagelse og stimulation system for elektrofysiologiske og adfærdsmæssige undersøgelser i frit flytte dyr præsenteret. TWS er blevet valideret i adfærdsmæssige assays ved hjælp af den ringere colliculus som en modelstruktur. TWS tilgang har flere fordele sammenlignet med eksisterende. For det første, bruger systemet en enkelt bærbar TWS hoved-fase udstyret med en forforstærker og et genopladeligt batteri, så stabil langsigtet optagelser i op til 1 time med det samme batteri og trådløs operationer afstand for op til 5 m. for det andet, TWS hoved fase er lys og kompakt, vejer 12 gram inklusive batteriet, og blev udviklet for at forhindre rotte fra at fjerne hovedet scenen og tygge ledningerne. Det var veltolereret af dyr siden ingen indvirkning på animal´s adfærdsmæssige repertoire med og uden TWS hoved fase blev observeret, at gøre ordningen gældende for en bred række adfærdsmæssige opgaver. For det tredje sender systemet i realtid. For det fjerde, gennem samtidige tovejs optagelse og stimulering af neurale aktivitet, systemet giver et sofistikeret værktøj til at vurdere årsagssammenhænge mellem specifikke hjernen aktivisering mønstre og adfærd, således at overvinde manglerne envejs systemer. Denne funktion gør metoden særligt værdifulde for feltet af dyb brain stimulation, som normalt kræver nøjagtig vurdering, overvågning og tilpasning af stimulation parametre under langsigtede adfærdsmæssige eksperimenter. Endelig, en kronisk implantable mikroelektrode enhed blev udviklet med integreret optagelse, stimulation og referenceelektrode, der nemt kan implanteres i løbet af en konventionel stereotaxisk kirurgi. Fra dette synspunkt er TWS et integreret trådløst system, hvilket øger reproducerbarhed af stimulation og optagelse eksperimenter. Optagelsen kvalitet af TWS viste sig at være lig den optagelseskvalitet givet med en kommercielt tilgængelig via kabel registreringssystem (Se figur 5).
Det er almindeligt kendt, at elektrisk stimulation af den ringere colliculus i rotter fremkalder klart undslippe adfærd kendetegnet ved løb eller spring, der efterligner reaktioner at frygte elicited af miljøudfordringer11,12, 13. Denne adfærd er fremkaldt i den nuværende undersøgelse ved at stimulere den ringere colliculus benytter TWS eller den traditionelle tøjret system. For at teste stimulation effekten af TWS, blev undslippe tærskler – minimum nuværende intensitet producerer kører eller hoppe – sammenlignet ved hjælp af begge systemer. Rotter med TWS hoved scenen er i stand til at køre hurtigt, hoppe og klatre ud af det åbne område, vise dvs typiske undslippe adfærd, med større bevægelsesfrihed. Vigtigere, var undslippe tærskler ens i forhold til traditionelle tøjret system. Sammen, blev en temmelig udfordrende paradigme brugt til at teste modstandsdygtighed af TWS, som det mestrede på en problemfri måde.
TWS er også velegnet til kronisk elektrisk stimulation eksperimenter da mikroelektrode enhed implanteret giver kronisk brug. TWS giver mulighed for at justere parametrene stimulation nuværende meget præcist i en måde at præcist afsløre hyppighed og mængde af stimulation nuværende som er effektiv til at fremkalde en adfærdsmæssige reaktion. Derudover samme dyr blev stimuleret med den samme aktuelle tærskel 3 dage senere og de samme ønskede adfærdsmæssige reaktion blev fremkaldt. Dette tyder på, at vævet omkring stimulation elektrode tip ikke blev beskadiget af stimulation nuværende, der normalt kræver øget stimulation nuværende amplituder med gentagne stimulering for at fremkalde de samme adfærdsmæssige reaktion.
Derudover er det muligt at reducere den eksperimentelle tid betydeligt, fordi TWS mikro-stimulator opdaterer stimulation parametre i realtid, når eksperimentatoren ændres dem i den grafiske brugergrænseflade. Andre elektriske Stimulatorer19 bruges til prækliniske forskning behovet skal omprogrammeres til stimulus parameter opdatering. I disse tilfælde er enheden programmeret af tethering dyr via kabel til en programmerings enhed. Dette er ikke påkrævet, når du bruger TWS.
Endelig, batteriet er fastgjort til toppen af TWS hoved scenen og elektrisk tilsluttet hoved op via en to-pins magnet stik til nem udveksling af batteriet. Fordelen er, at det er muligt at skifte batteri uden at frakoble TWS hoved scenen fra enheden, indopereret elektrode, der er meget mere behageligt at dyret under eksperimentet. Under den nuværende undersøgelse brugte vi et batteri, hvis drift tid er kun 1 h. I tilfælde af eksperimentet tager længere tid end 1 h, anbefales det at have en ekstra opladet batteri tilgængelige. TWS kan tilsluttes udskiftning genopladelige batterier med kapacitet på (i) 230 mA i 1 h drift tid eller (ii) 450 mA for ca 2,5 h operationstid. Begge typer batterier kan genoplades fuldt i 15 min.
I Resumé beskriver den nuværende undersøgelse driften af TWS designet til neurale stimulation og optagelse fra frit opføre smådyr. En helt integreret sæt af implantabelt mikroelektrode enhed, hoved fase, modtager og software præsenteres så godt. Kvaliteten af den trådløse optagelse og stimulation er lig at af de tøjrede optagelse system med fordelen af at være mere behagelig, let og sikkert at dyret. TWS kan derfor bruges til at erstatte den tøjret system, da det begrænser ikke dyrets mobilitet og giver en fleksibel metode til at styre stimulation og neurale optagelse under omstændigheder hvor andre metoder ville være vanskeligt eller umuligt. TWS kan derfor være et vigtigt redskab til at undersøge hvordan elektriske aktivitet i definerede neurale kredsløb genererer visse former for adfærd, et grundlæggende spørgsmål i neurovidenskab.
Disclosures
Medforfattere Uwe Thomas og Sascha Thomas er ejere af "Thomas optagelse GmbH", som er ved at udvikle produkter anvendes i denne undersøgelse og relateret til forskning generelt emnet beskrevet i denne hvidbog. Derudover modtager medforfatter Dirk Hoehl indkomst fra "Thomas optagelse GmbH". De kan økonomisk drage fordel af denne omstændighed, hvis virksomheden har succes med markedsføring af sine produkter, der er relateret til denne forskning. "Thomas" kontrolapparatet anvendes i denne undersøgelse var dedikeret til afdelingen Behavioral Neuroscience, eksperimenterende og biologisk psykologi - Philipps Universität Marburg uden beregning.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en grant forskning fra tysk sammenslutning af industriel forskning foreninger (AiF giver nummer: KF2780403JL3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 | Thomas RECORDING GmbH | AN001165 | The Thomas Wireless System (TWS) version 2.0 is a portable multichannel telemetry system with laptop computer, a preinstalled Microsoft Windows operating system and TWS control software. The TWS includes: low noise 4 channel pre– and programmable main amplifier with fixed bandwidth, single channel constant–current stimulator for application of biphasic current pulses, software programmable micro stimulator, implantable connector system and a basic head stage unit for mounting to an animal. The system is delivered with a transceiver with USB port connection for laptops or desktop personal computers, the control software running under Microsoft operating system Windows. The TWS system can be used for extracellular neural stimulation and recording in freely behaving small animals (e.g. rats, guinea pigs). This system can be adapted to be used in larger animals (e.g. primates) as well. |
| Software for Thomas Wireless System (TWS) | Thomas RECORDING GmbH | inlcuded in AN001165 | The software for the Thomas wireless system is running under Microsoft Windows operating system and provides the graphical user interface (GUI) for the Thomas Wireless System (TWS). The TWS GUI offers complete control of the TWS functions 4 channel recording and 1 channel stimulation. |
| Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) | Thomas RECORDING GmbH | AN001132 | Implantable tetrode for recording (4 channels) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS). Recording tetrode specifications: tetrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, tetrode fiber outer diameter: 100µm, tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance: 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm, dimensions of the electrode can be specified by the end user |
| Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) | Thomas RECORDING GmbH | AN001118 | Implantable microelectrode for recording (single channel) and stimulation (single channel) for use with Thomas Wireless Systems (TWS). Recording electrode specifications: electrode fiber material: quartz glass insulated platinum tungsten fiber, electrode fiber outer diameter: 80µm/250µm (please specify), tip shape D, impedance 0.5-0.8MOHm; Reference electrode: tip shape: D; Impedance. 300-500kOhm; Material: quartzglass insulated platinum/tungsten; Stimulation electrode specification: fiber material: platinum/iridium, diameter: 125µm, lacquer insulated, tip shape : D, impedance: < 10kOhm |
| Holder for electrode implantation | Thomas RECORDING GmbH | AN000838 | Special bent metal rod for microelectrode implantation for standard electrode holders. The rod is used to hold an implantable electrode. The implantable electrode is fixed to the rod with special Thomas RECORDING water soluable glue (AN001080). (Electrode holder is not included) |
| Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/230mAh) | Thomas RECORDING GmbH | AN001208 | Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 230mA for approximately 1h operation time. (size: 27mm x 20mm x 6mm, weight app. 6g) |
| Replacement accumulator power supply for the Thomas Wireless System (3,7V/450mAh) | Thomas RECORDING GmbH | AN001209 | Replacement rechargeable battery (accumulator) for Thomas Wireless System with a capacity of 450mA for more than 1h operation time. (size: 48mm x 30mm x 4mm, weight app. 11g) |
| Accumulator charger for Thomas Wireless System (TWS) rechargable accumulator | Thomas RECORDING GmbH | AN001207 | Mains powered charger for the Thomas Wirless System (TWS) rechargable accumulators (AN001209 and AN001209) |
| Water soluble glue | Thomas RECORDING GmbH | AN001080 | Thomas RECORDING water soluble electrode glue is a specially selected product for use with implantable microelectrodes in neuroscientific research. Its unique properties ensure a rigid connection between electrode and mounting device although it is easily removable with warm water. The Thomas RECORDING water soluble electrode glue can be used out-of-the-box, without any time consuming preparation. Thomas RECORDING water soluble electrode glue is not harmful to humans, animals or the environment. Quantity: 1 box of 10 gramms |
| Miniature differential preamplifier | Thomas RECORDING GmbH | AN000329 | The Miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2 is a 2-channel, differential input preamplifier that is designed for low noise recordings from excitable tissue. It is intended for extracellular recording in conjunction with the implantation of implantable microelectrodes for freely moving animal appliactions with the Thomas Wireless System (TWS). The 2-Channel Miniature Differential Preamplifier (MDPA-2) is connected to the implantable microelectrodes for providing the initial tenfold amplification stage. Ideally Thomas RECORDING quartz glass insulated platinum/tungsten electrodes are used to yield optimal recording results with high signal amplitudes and low noise levels. The MDPA-2 has additional common ground and reference electrode inputs. |
| Connection cable | Thomas RECORDING GmbH | AN000330 | Connection cable to connect the Thomas Miniature differential preamplifier (MDPA-2) to a main amplifier and an accumulator power supply. |
| Rechargeable power supply for the miniature preamplifier | Thomas RECORDING GmbH | AN000328 | Rechargeable accumulator power supply for the Miniature differential preamplifier (MDPA-2). |
| Accumulator charger (US) | Thomas RECORDING GmbH | AN000167 | Accumulator charger for the power supply AN000328 (US mains power outlet conenctor) |
| Accumulator charger (EU) | Thomas RECORDING GmbH | AN000168 | Accumulator charger for the power supply AN000328 (EU mains power outlet connector) |
| Differential preamplifier/main amplifier/bandpass filter | Thomas RECORDING GmbH | AN000677 | TREC AC Main Amplifier (LabAmp-03) is a single-channel, differential main amplifier for neurophysiological applications (e.g. extracellular recording with microelectrodes). This Instrument is designed to work with the miniature Differential Pre-Amplifier, Model MDPA-2. The single channel of the LabAmp-03 contains a high-gain, low-noise differential amplifier stage followed by low frequency and high-frequency filters. The amplifier has two different filter amplifiers, a single unit activity (SUA) filter –amplifier and a local field potential (LFP) filter amplifier, both are connected parallel in the signal path. Record Mode offers two levels of signal gain (x10, x100) in a first stage and 4 additional levels (x5, x10, x25 and x50) in a final amplifier stage. Each amplifier has different bandpass characteristics for single unit activity (SUA) 500Hz…20kHz and local field potentials (LFP) 0,1Hz…140Hz. An audio monitor and a window discriminator is integrated in the device. The LabAmp-03 has an integrated audio monitor with loudspeaker. This unit provides audio reproduction of electrophysiological signals. The unit combines an audio amplifier in a compact, rugged package. This is especially suited to monitoring neural firing and muscle contractions. The audio monitor input is internally connected to the SUA-Filter amplifier output. The LabAmp-03 is delivered with external power supply for a mains power operation voltage range of 100-240V AC/50-60Hz. |
| USB Oscilloscope | Thomas RECORDING GmbH | AN001096 | USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. This 2-channel PC oscilloscope is perfect suitable for mobile use on a laptop and permanent installation in control cabinets, industrial equipment and many other applications where a small, lightweight and powerful oscilloscope is required. This oscilloscope is connected to the signal output of the main amplifier is for display of recorded extracellular activity during the implanation of the implantable microelectrodes for the Thomas Wireless System (TWS). The user can acquire the measurement data over the several data-interfaces directly on the PC with includes PC software. |
| Stimulus generator | Multichannel Systems | STG3008-FA | Stimulus Generator for Current (STG) and Voltage Driven Stimulation fulfill three functions: current driven stimulation, voltage driven stimulation, controlling and timing. The STG is available with 2, 4 or 8 independet output channels. Featuring integrated isolation units for each output channel, the STG is able to provide any arbitrary waveform. |
| Cap protector for the electrode | Thomas RECORDING GmbH | AN001193 | Protective cap for implantable electrode unit for the Thomas Wireless System |
| Surgical equipment | Scissors, blunt-end forceps, spatulas, surgical clippers, dental drill, and cotton buds | ||
| Drugs and chemicals | Isoflurane, xylocaine, tramadol hydrochloride (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), dexpantenol eye salve (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% hydrogen peroxide, povidone-Iodine (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) and 70% ethanol; | ||
| Fixation material including | Stainless steel screws (BN650 M1.2x5; 4.7 mm ), acrylic resin (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), ultraviolet glue (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Germany) and cap protector (Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany); | ||
| Additional material | Gloves, heating pad, syringes, and physiological saline. | ||
| Small Animal Stereotaxic Instrument (SASI) | Thomas RECORDING GmbH | AN000287 | The model should be chosen according to the animal (rat, guinea pig, monkeys, etc) used in the study |
| Video camera | EverFocus | EverFocus, model: EQ150 | |
| Open field | Made of transparent or gray acrylic, having round shape measuring 40x40x40cm | ||
| Elevated plus maze | Made of gray acrylic and consisted of two open arms (50 cm long x 10 cm wide) and two closed arms (50 cm long x 10 cm wide, with 40 cm high walls) that extended from a central platform elevated 50 cm above the floor. |
References
- Rao, R. P., Mielke, F., Bobrov, E., Brecht, M. Vocalization-whisking coordination and multisensory integration of social signals in rat auditory cortex. Elife. 3, e03185 (2014).
- Tseng, W. T., Yen, C. T., Tsai, M. L. A bundled microwire array for long-term chronic single-unit recording in deep brain regions of behaving rats. J. Neurosci. Methods. 201 (2), 368-376 (2011).
- Ball, D., et al. Rodent scope: a user-configurable digital wireless telemetry system for freely behaving animals. PLoS One. 9 (2), e89949 (2014).
- Chien, C. N., Jaw, F. S. Miniature telemetry system for the recording of action and field potentials. J. Neurosci. Methods. 147 (1), 68-73 (2005).
- Hawley, E. S., Hargreaves, E. L., Kubie, J. L., Rivard, B., Muller, R. U. Telemetry system for reliable recording of action potentials from freely moving rats. Hippocampus. 12 (4), 505-513 (2002).
- Alam, M., Chen, X., Fernandez, E. A low-cost multichannel wireless neural stimulation system for freely roaming animals. J. Neural. Eng. 10 (6), 066010 (2013).
- Xu, S., Talwar, S. K., Hawley, E. S., Li, L., Chapin, J. K. A multi-channel telemetry system for brain microstimulation in freely roaming animals. J. Neurosci Methods. 133 (1-2), 57-63 (2004).
- Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals. Sci. Rep. 4, 5963 (2014).
- Ativanichayaphong, T., He, J. W., Hagains, C. E., Peng, Y. B., Chiao, J. C. A combined wireless neural stimulating and recording system for study of pain processing. J. Neurosci. Methods. 170 (1), 25-34 (2007).
- Ye, X., et al. A portable telemetry system for brain stimulation and neuronal activity recording in freely behaving small animals. J. Neurosci. Methods. 174 (2), 186-193 (2008).
- Brandão, M. L., Tomaz, C., Leão-Borges, P. C., Coimbra, N. C., Bagri, A. Defense reaction induced by microinjections of bicuculline into the inferior colliculus. Physiol Behav. 44, 361-365 (1988).
- Brandão, M. L., Melo, L. L., Cardoso, S. H. Mechanisms of defense in the inferior colliculus. Behav Brain Res. 58, 49-55 (1993).
- Melo, L. L., Cardoso, S. H., Brandão, M. L. Antiaversive action of benzodiazepines on escape behavior induced by electrical stimulation of the inferior colliculus. Physiol Behav. 51, 557-562 (1992).
- Paxinos, G., Watson, P. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 3rd ed, Academic Press. San Diego, CA. (2007).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods. 14, 149-167 (1985).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Merrill, D. R., Bikson, M., Jefferys, J. G. Electrical stimulation of excitable tissue: design of efficacious and safe protocols. J Neurosci Methods. 141, 171-198 (2005).
- Ewing, S. G., Porr, B., Riddell, J., Winter, C., Grace, A. A. SaBer DBS: A fully programmable, rechargeable, bilateral, charge-balanced preclinical microstimulator for long-term neural stimulation. J Neurosci Methods. 213, 228-235 (2013).
