Summary
Воздействие экологических токсинов может остро влияние развивающихся эмбрионов. Эндокринные нарушения химических веществ, таких как бисфенолов известны отрицательно влияют на нервную систему. Здесь мы описываем протокол с использованием модели нейронной сети в vitro позвоночных (куриных эмбрионов) для изучения функциональных последствий воздействия токсинов на ранних эмбрионов.
Abstract
Бис фенолы, например бис фенола (BPA) и бис фенол S (BPS), полимеризовать агентов, широко используется в производстве пластмасс и многочисленных повседневных продуктов. Они классифицируются как эндокринные нарушения соединения (EDC) с эстрадиол подобными свойствами. Долгосрочное воздействие даже при низких дозах, в ЭЭС, был связан с различными дефектами здоровья, включая рак, поведенческих расстройств и бесплодия, с большей уязвимости в ранние периоды развития. Для изучения последствий BPA на развитие нейрональных функции, мы использовали в vitro нейронной сети производные от ранних Чик эмбриональных мозга как модель. Мы обнаружили, что воздействие BPA повлияли на развитие сетевой активности, в частности пики активности и синхронизации. Изменение сетевой активности является важную связь между препарата или составные молекулярных цели и его воздействия на поведенческие итоги. Несколькими электродами массивы становятся все более полезными инструментами для изучения воздействия наркотиков на сетевой активности в пробирке. Существует несколько систем на рынке, и, хотя есть различия в количество электродов, тип и качество электрода массива и анализ программного обеспечения, основных принципов, и полученные данные-это то же самое, по всей различных систем. Хотя в настоящее время ограничивается анализ двумерных в vitro культур, эти системы МПС совершенствуются для включения в vivo сетевой активности мозга ломтиками. Здесь мы предоставляем подробный протокол для эмбриональных экспозиции и записи активности нейронной сети и синхронности, наряду с представителем результаты.
Introduction
4, 4′-Isopropylidenediphenol, известный как бисфенол-А или BPA, добавка антиоксидант найден в широкий спектр поликарбоната и эпоксидная смола на основе продуктов, начиная от Термобумага, компакт-диски и поколебать доказательства стекла, внутри покрытие банок для напитков. Хотя известно, что BPA эндокринные нарушения агентом, который имитирует эстрогенов1, исследования на ее пагубных последствий из-за повседневной случайные воздействия BPA основном вышли за последние 10 – 15 лет. Последствия даже низкие уровни воздействия BPA самые глубокие в начале развития периодов, в том числе во время эмбриогенеза путем воздействия матерей2,3. В утробе матери подверженности женщин эмбрионов эндокринной системы, нарушения химических веществ также связано с восприимчивость увеличение заболеваний от влагалища до груди Рак4,5. Исследования на животных показали, что воздействие BPA приводит к нетипичным мозга структуры и функциональных нарушений, проявляется в поведении6. Как следствие использование BPA в детской бутылочки была запрещена наиболее регулирующих органов в Европе и Северной Америке, включая FDA. В соответствии с правилами, многие производители перешли на 4, 4'-sulfonyldiphenol или бисфенола S (BPS). Основано на факте, что BPA и BPS являются структурные аналоги и что недавние доклады показали сопоставимых потенции BPS эстрогенных транскрипции7, важно изучить токсичность этой смеси относительно BPA.
Здесь мы описываем протокол для тестирования воздействие BPA (и другие ЭЭС) на сети нейронов, используя модель позвоночных, куриных эмбрионов. В vitro культуры нейронов образуют синаптических контактов и создавать потенциалы действия (также называемый шипы). Пики активности этих культур могут быть записаны с помощью систем несколькими электродами массив (MEA). Шипы считаются в синхронности когда они происходят в течение 5 мс друг от друга. Первоначальный случайных пики активности, что в конечном итоге синхронизирует является ключевой особенностью разработки нейрональных сетей8,9. Синхронии может быть измерена с помощью различных методов и несколько алгоритмов описаны в литературе9,10,11. В нашем анализе мы используем алгоритм, разработанный Пайва и коллег12 , которая интегрирована в записи программного обеспечения, которое управляет система сбора МПС. Надежные пики активности нейронов зародышевых куриных предоставляет прототип для изучения воздействие BPA на нейронной сети деятельность13. Используя массивы многолетних электрода для записи пики активности, мы наблюдали, что BPA Выдержка подавляет развитие нейрональных пики синхронности9,14. Здесь мы предоставляем подробные методологии для изучения воздействия BPA на куриных эмбрионов нейронов в культуре вместе с представителем результаты на развитие нейрональных пики синхронности в Чик эмбриональных культур.
Protocol
Протокол, ниже был стандартизирован для проверки последствий воздействия BPA во время эмбриогенеза (ранние) и может быть изменен для использования с BPS, БНФ или другие EDC в Чик эмбриональных нейронов.
Этот протокол следует институциональной политики Делавэр государственного университета и низ политики для птичьего эмбрионов. Протокол также находится в подтверждение с ДСУ в материал и рекомендации по химической безопасности.
1. материал установки
- Растворяют BPA (м.в. 228.29) в 10% этанола (v/v) в воде сделать Стоковый раствор 1 мм (0,23 мг / мл 10% этанола). Сделайте последующих разведениях (0,1 мкм, 0,5 мкм, 1 мкм, 5 мкм и 10 мкм) в neurobasal среде.
Предупреждение: BPA это экологических токсинов и проявлять осторожность при обработке порошка. - Инкубации куриных яиц в коммерчески доступных настольная Яйцо инкубатор на 37 ° C. Инкубируйте яйца на 7 дней для E7 эмбрионов.
- Подготовка измерительных Стерилизируй-отпусти требуемое количество МЭС путем замачивания в этанол 70% для 3-4 ч и затем промойте три раза примерно в 10 мл стерильной дистиллированной воды в BSLII капот.
Примечание: МЭС содержат 64 нанопористого платиновые электроды расположены в сетка 8 x 8. Диаметр электрода-30 мкм и расстояние между электродами составляет 200 мкм. Не используйте денатурированного этилового спирта для стерилизации МЭС, поскольку это приведет к коррозии МПС. - Место МЭС внутри стерильный контейнер с крышкой (для поддержания стерильных условий) и перейти к столешнице инкубатора. Выпекать в течение по крайней мере 6 часов при температуре 55 ° C. Этот шаг очень важен для правильного стерилизации и Температура не должна превышать 60 ° C. Сохранения стерильности, переместите блюдо, содержащие МЭС на капот BSLII для хранения до дальнейшего использования.
Примечание: Мы используем безопасное стекло духовки выпечки блюдо с пластиковой крышкой и поверхности стерилизовать его с 70% этанола и место в BSLII шкаф для сушки. - Алиготе решение дополнительных клеточных матриц ECM. Оттепель флакона на 4 ° C на ночь и заморозить 100 мкл аликвоты при-20 ° C.
Примечание: ECM поставляется замороженные. ECM должны не доведены до комнатной температуры до готовности в пальто, а он polymerizes при комнатной температуре, после полимеризуется, это невозможно для пальто. ECM без факторы роста предпочтителен для предотвращения дополнительных эффектов из-за неизвестных факторов. - Стерилизовать всех инструментов диссекции (Дюмон #5 щипцы, изогнутый пинцет, маленькие ножницы и ножницы весной) и самоуплотняющийся материал с покрытием рассечение блюда с 70% этанола и дайте им высохнуть в капюшоне рассечение.
2. Чик эмбриональных нейрон культуры и сетевой активности
- В день обшивки, удалите флакон от ECM от-20 ° C морозильник, спрей с 70% этиловом спирте и место на льду. Разбавляют до 25%, добавив 300 мкл холодной neurobasal среднего внутри BSLII Худ.
- С помощью Р200 pipetteman мкл 100 25% ECM в центр МПС, стараясь не коснуться электродами и удалить немедленно оставляя тонкую пленку на поверхности. Обложка МПС и место в CO2 инкубатора (37 ° C и 5% CO2) до готовности пластины нейронов.
- Стерилизуйте внешней оболочки яйцеклетки E7 (эмбриональных 7 день, инкубировали при 37 ° C в течение 7 дней) с 70% этиловом спирте. Обезглавить эмбриона в нижней Sylgard рассечение блюдо содержащие холодного стерильного Хэнк сбалансированный солями раствор (HBSS) без кальция. Вырезать вокруг глаз и удалить глаз. С помощью Дюмон #5 изысканные щипцами и весной ножницы сделать надрез на вентральной стороне и удалять внешние слои кожи, чтобы разоблачить переднего мозга и зрительного tectum. Пил и тщательно удалить сетчаточных мембраны. Передача переднего мозга в другой чашке Петри и разрезать его на мелкие кусочки около 2 мм с весны ножницами.
Примечание: Не должно быть каких-либо кровеносных сосудов, придает переднего мозга после удаления сетчаточных мембраны. Если возможно, желательно для выполнения диссекции в стерильным дисекция капот, хотя мы получили довольно хорошие результаты, когда диссекция выполняется вне капотом до тех пор, как инструменты и рассечение области тщательно стерилизованные с 70% этанол . - С помощью пипетки стерильные передачи, соберите части переднего мозга в 15 мл пластиковых пробирок и удалить столько HBSS как можно скорее после давая части переднего мозга раковина в нижней части пластиковых пробирок.
- Добавить 1 мл 0,05% трипсина/ЭДТА (предварительно разогретую до 37 ° C) и Инкубируйте 15 минут при 37 ° C.
- С помощью пипетки Пастера, тщательно удалить трипсина не нарушая куски ткани и добавьте 1 mL neurobasal среднего. Пусть кусочки ткани раковина на дно и удалить носитель. Повторите это мыть еще раз. Этот шаг, чтобы смыть ЭДТА трипсина.
- Добавить 2 мл neurobasal среды и начать истирание. Тритурация предполагает принятие стерильные пипетки Пастера огонь полированные и передавая ткани через него несколько раз осторожно до тех пор, пока не более кусочки ткани видны. Если любые части остаются после повторных проходов, просто оставьте их поселиться в нижней.
Примечание: Избегайте вспенивания во время истирание - если пены форме, остановить и удалить путем аспирации. - Разбавьте 1:10 вновь приостановлено клетки с neurobasal среднего и количество жизнеспособных клеток с помощью Трипановый синий краситель и Горяева. Mix 50 мкл разбавленного клеток с 50 мкл раствора Трипановый синий в пластиковых пробирок 0,5 мл. 10 мкл hemacytometer после размещения на coverslip и граф ярко ясно клеток (синие клетки мертвы и не должны учитываться).
Примечание: Число типичных клеток из одного диапазона оптоволоконный tectum E7 между 1 и 5 x 10-7 кл/мл. - Пластина диссоциированных клетки на ECM покрытием МЭС на плотность клеток/площадь 2200 мм. Для нашей системы МПС это переводится примерно 130 000 ячеек на МПС. Добавьте neurobasal средних и доводят объем в МПС по 1 мл и МЭС в CO2 инкубатора ночь для клеток привязанность и расширение neurite (рис. 1).
Примечание: Для МЭС различных областей и электрод чисел, плотности различных клеток могут быть судимы - в общем, выше плотность клеток приводит к большей сетевой активности, но также приводит к короче жили культур. - Следующий день, добавьте BPA в конечной концентрации 10 мкм в neurobasal среде из бульона 1 мм на этапе 1.1 обработанных МПС. Для управления МПС добавьте такой же объем 10% этанола в растворе воды (v/v).
- Средний заменить провел с neurobasal носитель, содержащий 10 мкм BPA каждый день до 7 дней в пробирке (7DIV) и каждый день после этого, как увеличение активности сети.
Примечание: Как сетевой активности увеличивается, увеличивается метаболической активности и средства массовой информации изменения должны быть более частым. Не позволяйте среднего оранжевой линией.
3. запись активности нейронной сети
- В день приобретения обмен питательной среды с свежими neurobasal среднего и вернуть CO2 инкубатора для минимум 2 ч перед записью МЭС. Запустите программное обеспечение для записи и установите температуру МПС до 37 ° C, нажав на значок температуры (дополнительная цифра 3.1a-b).
Примечание: Запись может начаться уже в день 3 обшивки и может продолжаться до тех пор, пока живы культур. - Настройка параметров получения, щелкнув правой кнопкой на значке «Муза» (под потоки на панели слева окна) и выберите «Добавить обработка» и «Спайк детектор» и нажмите кнопку ОК в всплывающее окно. «Всплеск детектор (6 x STD)» будет отображаться ниже имя файла (дополнительная цифра 3.2a-b).
- Далее щелкните правой кнопкой мыши на Спайк детектор, выберите «Добавить обработка» и «Взрыв детектор» и в всплывающем окне нажмите кнопку ОК. «Взрыв детектор» (МСИ) будет отображаться под значком Muse (дополнительная цифра 3.3a-b).
- Далее щелкните правой кнопкой мыши на взрыв детектор, выберите «Добавить обработка» и «Нейронные статистики компилятора.» В всплывающем окне убедитесь, что заголовок файла, агрегированные хорошо статистики и синхронности отмечены. Нажмите кнопку ОК. «Статистика компилятора» появится ниже (дополнительная цифра 3.4A-b).
Примечание: Это будет задать адаптивный порог пересечения (6 x STD фильтр), интервал между Спайк 100 мс с минимальное количество шипов на 5, среднее, выпустив скорость обнаружения на 10 s с параметром синхронности в 20 мс и скорость Минимальная Спайк 0.083333 шипы в минуту. - Настройка запланированной записи для записи время 5 минут (300 000 мс), нажав на значок часов в дне. Это достигается путем изменения информации в разделе Настройка записи каждые 5,1 минут и записывать на 5 минут. Это будет запущен немедленно и будет выполняться один раз (дополнительный рисунок 3.5).
- Убедитесь, что температура МПС достигло 37 ° C перед перемещением МПС. Удаление МПС из инкубатора, поместите его на устройство записи и заблокировать МПС. Начните запись сетевой активности, щелкнув начать запись в разделе запись по расписанию или значок записи в окне «Файл играть». Как правило время записи 5 минут (300 000 мс) является достаточным, хотя можно получить больше записей до 10 минут.
- После записи, возвращение МПС в инкубаторе.
Примечание: Будьте внимательны поддерживать стерильность и свести к минимуму время, которую МПС находится за пределами инкубатора.
4. анализ данных
- Анализ исходных данных может быть сделано в автономном режиме с помощью программного обеспечения для записи. Нажмите на выпадающее меню файл и откройте запись. Выберите файл исходных данных для анализа. Переиграйте необработанные записи для захвата необходимые параметры пики.
- Чтобы получить среднее число шипов, использовать модуль детектор Спайк и для получения индекса синхронности, использовать модуль нейронных статистики компилятора.
- Загрузите Спайк детектор, детектор взрыв и статистические модули компилятора как раньше (раздел 3).
- Из выпадающего меню в пределах Спайк детектор, детектор лопнул и статистики компилятора модуль windows выберите список Спайк, пакетный список сетевых и расширенный метрик, соответственно.
- Нажмите кнопку записи, чтобы начать запись файл данных, который будет создан CSV-файл в папке режиссер. Параметры Спайк - общее количество шипов и синхронности индекс - будут записаны в файл CSV.
Примечание: анализ в реальном времени во время записи необработанных данных не рекомендуется, как это может потреблять процессорного времени и вычислительных ресурсов.
Representative Results
Мы изучили воздействие BPA на развитие синхронности в куриных эмбрионов нейронов культур. Синхронизация пики активности является показателем нормального развития нейронных сетей в пробирке. Когда два шипа происходят в течение 5 мс друг от друга, они считаются синхронной. В vitro нейрональных культур первоначально отображения случайных пики активности — шипы происходят случайно и интервалы между Спайк показывают нормальное распределение. Как культуры зрелой, пики активности становится более синхронизированы и интервалы между Спайк являются постоянными. Синхронные пики активности культуры был предел кросс корреляции анализ Спайк раз с помощью записи программного обеспечения12 для получения синхронности индекса (Си). Мы обнаружили, что BPA Выдержка отрицательно влияет на развитие деятельности сети путем уменьшения пики активности и синхронности индекс (рис. 2 и 2b). Таким образом мы показали, что пагубные последствия воздействия BPA на эмбриона влияет на его развитие, включая нейронные функции, которая может оцениваться синхронность развития в куриных нейронов в культуре.
Рисунок 1: Схема протокола изображающие шагах от рассечение куриных переднего мозга до диссоциации, обшивки и записи сетевой активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: (A) среднее количество шипов значительно ниже BPA лечение E7 куриных переднего культур по сравнению с контролем культур. Среднее количество шипов было извлечено с помощью программного обеспечения для записи. Средства (контроль, 14,890 ± 949.0, N = 15 и BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) существенно отличались (неспаренный t тест, p < 0.0001). (B) средняя синхронности индекс (SI) значительно ниже BPA лечение E7 куриных переднего культур по сравнению с контролем культур. Си был извлечен с использованием нейронных статистики компилятор модуля записи программного обеспечения. Средства SI (контроль, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 и BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) существенно отличались (неспаренный t тест, p < 0.0001). Планки погрешностей изображают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Фазы быстрого роста и развития таких эмбриогенеза особенно уязвимы к пагубные последствия различных соединений, эндокринные нарушения, включая АДС. Мы предоставляем подробные протоколы для изучения последствий воздействия BPA в модели позвоночных нейронной сети в пробирке . Используя этот протокол, мы установили, что BPA понижает уровень Спайк, а также индекс синхронности в развивающихся нейрональных сетях (рис. 2-б).
Наша методология была разработана для изучения воздействия BPA в раннем эмбриогенезе и может быть легко адаптирована для изучения последствий других ЭЭС. Эмбриональных нейрональных культур от куриных относительно легко установить по сравнению с другими моделями позвоночных, включая крыса или мыши. Кроме того, нет никаких требований для отдельной комнате животных — простой инкубатор на лабораторном столе достаточно для проведения этих анализов. Мы описывают использование несколькими электродами системы (МПС) для оценки влияния EDC, BPA, на сетевой активности. Протоколы, описанные здесь может применяться к другим системам. Одним из важнейших аспектов настоящего Протокола является обеспечение стерильности. Это включает диссекции эмбриона в стерильных условиях — стерилизации инструментов с 70% этанола и использования стерильных Хэнк сбалансированный соли раствора достаточно. Как данные собираются в течение недель, важно поддерживать стерильной обработки МЭС. Нейрональных культур после может быть культивировали долгосрочный - вплоть до трех месяцев — и таким образом являются полезными для изучения долгосрочного воздействия ЭЭС и других соединений на нейронных сетей. Еще одним важным аспектом этого протокола является время от вскрытия покрытий. Оптимальное время — 30 мин, в том числе инкубации ткани с трипсином. Чем больше времени, чем беднее выживание клетки.
Здесь мы описываем основной протокол, который может быть применен к оценке любого химического или наркотиков, который влияет на поведение и нервные функции. Здесь мы использовали плотность ячеек 2200 клеток на2мм; Однако это может быть изменено и другие клетки плотности могут быть использованы. В общем мы обнаружили, что увеличение плотность клеток увеличивает сетевой активности - больше шипов в более короткие сроки. Метод описал, хотя и весьма полезной для оценки воздействия химических веществ на сетевой активности имеет ограничений. Один из величайших ограничения метода является, что эти в пробирке культур являются две мерных может не отражать трехмерную архитектуру головного мозга позвоночных. Это может быть преодолено с помощью фрагмента записи. Другой альтернативой является применять лечение для развивающихся куриных эмбрионов, значит небольшого окна вырезать на широком конце яйцо15, вскрыть мозга в конце лечения, сделать толстые секции на vibratome и на МПС для запись сетевой активности.
Наш протокол имеет важное значение в том, что он позволяет изучение эффекта ЭЭС на развитие сетевой активности и предлагает изучение механистический основы для воздействия этих химических веществ.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Это исследование поддерживается NSF (Негритянское учебное заведение-UP исследований инициации премии, РЛР 1401426 и EPSCoR EPS-0814251) и низ (КОБРЕ 1P20GM103653-01A1). К.с. поддерживается стипендий от INBRE-III 6404 Делавэр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 foreceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Axion Muse MEA | Axion Biosystems | M64-GL1-30Pt200 | Will be called MEA system in manuscript |
| Axis Software | Axion Biosystems | Will be called recording software in the manuscript | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| curved forceps | Fine Science Tools | 11272-50 | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Fertilized chicken eggs | from any local farm or Spafas | ||
| HBSS | Fisher | 14170112 | |
| Hemacytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356231 | Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript |
| Neurobasal medium | BrainBits | Nb4-500 | |
| Neuroexplorer statistical software | Nex Technologies | Neuroexplorer version 5 | |
| Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20A | |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15514-12 | |
| Sylgard bottom dissection dishes | Living Systems Instrumentaion | DD-90-S-BLK-3PK | |
| Trypan Blue dye | Fisher | 15-250-061 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher | 15400054 |
References
- Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).
- Dodds, C. Synthetic oestrogens. Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).
- Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S. Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).
- Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women. New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).
- Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats. Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).
- Okada, A., Kai, O. Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system. Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).
- Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice. Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).
- Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).
- Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities. Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).
- Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27 (2015).
- Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function. PLOS Genetics. 12 (7), 1006223 (2016).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits. PLoS ONE. 5 (12), 14443 (2010).
- Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results. J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).
- Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells. Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).
- Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic. NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).
- Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. A Comparison of Binless Spike Train Measures. Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Chiappalone, M., et al. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Res. 93, (2006).
- Li, X., et al. Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development. Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).
