Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

تقييم آثار المركبات على تطوير شبكات عصبونية الفقاريات دالة باستخدام صفائف متعدد القطب الصماء

doi: 10.3791/56300 Published: April 26, 2018

Summary

التعرض للسموم البيئية يمكن أن تؤثر بشدة الأجنة النامية. الصماء المواد الكيميائية مثل بيسفينولس معروفة تؤثر تأثيراً سلبيا على الجهاز العصبي. هنا يمكننا وصف بروتوكول باستخدام نموذج شبكة العصبية فقاريات (الجنين الفرخ) في المختبر لدراسة تأثير الوظيفية للتعرض للسمية على الأجنة في وقت مبكر.

Abstract

مكررا-الفينول، مثل الفينول مكررا أ (BPA) ومكررا-الفينول-S (BPS)، هي مبلمرة وكلاء المستخدمة على نطاق واسع في إنتاج البلاستيك والمنتجات اليومية العديدة. أنها تصنف كمركبات تحريف الغدد الصماء (EDC) مع خصائص مثل استراديول. وقد ربط التعرض الطويل الأمد ليشكل، حتى في الجرعات المنخفضة، مع مختلف العيوب الصحية بما في ذلك السرطان، والاضطرابات السلوكية، والعقم، ومع مزيد من الضعف خلال فترات النمو المبكر. لدراسة آثار BPA على تطوير وظيفة الخلايا العصبية، استخدمنا في المختبر العصبية شبكة المستمدة من الدماغ الفرخ الجنينية المبكرة كنموذج. لقد وجدنا أن التعرض لمنهاج عمل بيجين أثرت تطوير نشاط الشبكة، على وجه التحديد النتوءات النشاط والمزامنة. تغيير في نشاط الشبكة من صلة أساسية بين الهدف الجزيئية لدواء أو مركب وأثره على النتائج السلوكية. صفائف متعدد القطب بشكل متزايد أدوات مفيدة لدراسة آثار المخدرات على نشاط الشبكة في المختبر. هناك العديد من النظم المتاحة في السوق، وعلى الرغم من أن هناك اختلافات في عدد الأقطاب ونوع ونوعية الصفيف القطب والبرمجيات التحليل، والمبادئ الأساسية، والحصول على البيانات هو نفسه عبر أنظمة مختلفة. رغم حاليا يقتصر على تحليل للثقافات ثنائي الأبعاد في المختبر ، ويجري تحسين هذه النظم اتفاق بيئي متعدد الأطراف لتمكين في فيفو نشاط الشبكة في شرائح المخ. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعرض الجنينية وتسجيل نشاط شبكة الخلايا العصبية والتزامن، جنبا إلى جنب مع نتائج تمثيلية.

Introduction

4، 4-إيسوبروبيليدينيديفينول، يشار إليها عادة Bisphenol A أو منهاج عمل بيجين، كمادة مضافة مضادة لأكسدة وجدت في مجموعة متنوعة واسعة من البولي والايبوكسي الراتنج على أساس المنتجات بدءاً من ورق حراري، الأقراص المدمجة، وتحطيم الزجاج، إلى الداخل دليلاً على طلاء من علب المشروبات. على الرغم من أن منهاج عمل بيجين كان من المعروف أن تكون عامل تحريف الغدد الصماء الذي يحاكي الإستروجين1، دراسات عن آثارها السيئة بسبب التعرض العرضي اليومية لمنهاج عمل بيجين معظمهم تخرج في السنوات 10-15 الماضية. النتائج المترتبة على انخفاض حتى مستويات التعرض BPA الأكثر عمقاً في أوائل فترات الإنمائية، بما في ذلك من خلال امبريوجينيسيس من خلال التعرض للأمهات2،3. كما ارتبط بقابلية المرض زيادة في الرحم التعرض للأجنة الإناث للمواد الكيميائية الصماء من المهبل لسرطان الثدي4،5. وقد أثبتت الدراسات الحيوانية يؤدي التعرض لمنهاج عمل بيجين إلى بنية الدماغ شاذة وتشوهات وظيفية تتجلى في السلوك6. نتيجة لذلك، حظرت استخدام منهاج عمل بيجين في زجاجات إرضاع الرضع الوكالات التنظيمية الأكثر في أوروبا وأمريكا الشمالية، بما في ذلك إدارة الأغذية والعقاقير. الامتثال للوائح، تحولت العديد من الشركات المصنعة إلى 4، 4 '--سولفونيلديفينول أو bisphenol-S (BPS). استناداً إلى حقيقة أن منهاج عمل بيجين و BPS بنظائرها الهيكلية وأن التقارير الأخيرة أظهرت فاعلية قابلة للمقارنة من BPS في النسخ إستروجين7، من المهم دراسة السمية لهذا المركب بالنسبة لمنهاج عمل بيجين.

هنا يصف لنا وضع بروتوكول لاختبار آثار منهاج عمل بيجين (وأخرى يشكل) على شبكات الخلايا العصبية باستخدام نموذج الفقارية، الجنين الفرخ. تشكل الاتصالات متشابك في المختبر الثقافات من الخلايا العصبية وتوليد إمكانات العمل (تسمى أيضا المسامير). يمكن تسجيل النشاط التشويك من هذه الثقافات باستخدام أنظمة الصفيف متعدد القطب (طيران الشرق الأوسط). تعتبر المسامير تكون في التزامن عند حدوثها داخل 5 مللي ثانية من بعضها البعض. نشاط التشويك عشوائية أولية في نهاية المطاف بالتزامن سمة رئيسية لتطوير الشبكات العصبية8،9. عدة خوارزميات يرد في الأدب9،،من1011والتزامن يمكن أن تقاس باستخدام أساليب مختلفة. في تحليلاتنا، نستخدم خوارزمية وضعتها إيفا وزملاء العمل12 التي يتم إدماجها في برنامج التسجيل الذي يدفع نظام الاستحواذ على شركة طيران الشرق الأوسط. نشاط الخلايا العصبية الجنينية الفرخ التشويك قوي يوفر نموذجا لدراسة تأثير منهاج عمل بيجين على نشاط شبكات عصبونية13. استخدام صفائف متعدد القطب إلى سجل النشاط التشويك، لاحظنا أن التعرض BPA يحول دون تنمية الخلايا العصبية التشويك تتسق9،14. هنا، نحن نقدم منهجية مفصلة لدراسة التعرض BPA على الفرخ الجنين العصبية في الثقافة جنبا إلى جنب مع نتائج الممثل على وضع التزامن التشويك الخلايا العصبية في ثقافات بدائية الفرخ.

Protocol

البروتوكول الواردة أدناه قد تم توحيدها لاختبار تأثيرات التعرض BPA أثناء امبريوجينيسيس (المبكر)، ويمكن تعديلها للاستخدام مع BPS، BPF، أو مؤسسة أخرى في الخلايا العصبية الجنينية الفرخ.

ويتبع هذا البروتوكول السياسات المؤسسية لجامعة ولاية ديلاوير وسياسة المعاهد الوطنية للصحة لاجنة الطيور. البروتوكول أيضا في تأكيد مع تفاهم للمواد والمبادئ التوجيهية للسلامة الكيميائية.

1-مواد الإعداد

  1. حل منهاج عمل بيجين (m.w. 228.29) في الإيثانول 10% (v/v) في المياه لجعل حل أسهم 1 مم (0.23 ملغ لكل مل إيثانول 10%). جعل تخفيف اللاحقة (0.1 ميكرومتر و 0.5 ميكرومتر، 1 ميكرومتر، 5 ميكرومتر و 10 ميكرون) في المتوسط نيوروباسال.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين السمية بيئية وينبغي توخي الحذر عند التعامل مع المسحوق.
  2. احتضان البيض الفرخ في حاضنة بيض منضدية متاحة تجارياً في 37 درجة مئوية. احتضان البيض لمدة 7 أيام للأجنة E7.
  3. إعداد تعقيم المشاع العدد المطلوب للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التي نقع في الإيثانول 70% عن 3 إلى 4 ح وشطف ثم ثلاث مرات في حوالي 10 مل ماء المقطر العقيمة في هود بسليي.
    ملاحظة: الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تتضمن 64 نانوبوروس البلاتين أقطاب مرتبة في شبكة 8 × 8. قطر القطب هو 30 ميكرومتر والتباعد بين الأقطاب هو 200 ميكرومتر. عدم استخدام الإيثانول التشويه والتحريف لتعقيم في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف كهذا سيؤدي إلى تآكل اتفاق بيئي متعدد الأطراف.
  4. وضع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف داخل حاوية معقمة مع غطاء (للحفاظ على ظروف معقمة) ونقل إلى حاضنة جدول أعلى. خبز لمدة 6 ساعات على الأقل في 55 درجة مئوية. هذه الخطوة غير الحرجة للتعقيم السليم ولا ينبغي أن تتجاوز درجة الحرارة 60 درجة مئوية. الحفاظ على العقم، تحريك الطبق يحتوي على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هود بسليي للتخزين حتى استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: نحن نستخدم فرن زجاج المأمون صحن الخبز مع غطاء بلاستيكي وتعقيم سطح فإنه مع الإيثانول 70% والمكان في هود بسليي للتجفيف.
  5. قاسمة الحل مصفوفة الخلوية إضافية إدارة المحتوى في المؤسسة. ذوبان الجليد القنينة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها، وتجميد 100 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم شحنها ECM المجمدة. لا ينبغي إدارة المحتوى في المؤسسة إلى درجة حرارة الغرفة حتى جاهزة لمعطف كما أنها بوليميريزيس في درجة حرارة الغرفة، وحالما بلمرة، من المستحيل أن معطف. إدارة المحتوى في المؤسسة دون عوامل النمو هو المفضل لمنع تأثيرات إضافية بسبب عوامل غير معروفة.
  6. تعقيم جميع أدوات تشريح (الملقط دومون #5، منحنى ملقط ومقص صغير ومقص الربيع) والختم الذاتي المواد مغلفة بأطباق تشريح مع الإيثانول 70% والسماح لهم الجافة في هود التشريح.

2-فرخ العصبية الجنينية الثقافة ونشاط الشبكة

  1. في يوم الطلاء، إزالة قنينة رذاذ من إدارة المحتوى في المؤسسة من الثلاجة-20 درجة مئوية، مع الإيثانول 70%، ووضع على الجليد. تضعف إلى 25% بإضافة 300 ميليلتر نيوروباسال الباردة المتوسطة داخل غطاء بسليي.
  2. استخدام P200 بيبيتيمان إضافة 100 ميليلتر من إدارة المحتوى في المؤسسة 25% إلى مركز شركة طيران الشرق الأوسط مع الحرص على عدم لمس الأقطاب وإزالة فورا تاركاً طبقة رقيقة على السطح. تغطية اتفاق بيئي متعدد الأطراف، ووضع في حاضنة2 CO (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2) حتى جاهزة لوحة الخلايا العصبية.
  3. تعقيم الغلاف الخارجي للبويضة E7 (الجنينية يوم 7، المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام) مع الإيثانول 70%. قطع رأس الجنين إلى أسفل سيلجارد طبق تشريح تتضمن متوازنة الأملاح الحل (حبس هانك العقيمة الباردة) دون الكالسيوم. قص حول العينين وإزالة مقل العيون. استخدام دومون #5 غرامة ملقط ومقص الربيع جعل شق على الجانب البطني وإزالة الطبقات الخارجية من الجلد لفضح تكتم forebrain والألياف البصرية. التقشير وإزالة الغشاء بيل بعناية. نقل فوريبرين إلى آخر طبق بيتري ومقطعة قطع صغيرة حوالي 2 مم مع مقص الربيع.
    ملاحظة: ينبغي أن لا يكون هناك الأوعية الدموية أي تعلق فوريبرين بعد إزالة الغشاء بيل. إذا كانت متوفرة، فمن الأفضل إجراء التشريح في غطاء تشريح عقيمة، على الرغم من أن نحصل على نتائج جيدة إلى حد ما عندما يتم إجراء تشريح خارج غطاء طالما بالصكوك وتشريح منطقة يجري تعقيم شامل مع الإيثانول 70% .
  4. استخدام ماصة نقل عقيم، جمع قطعة فوريبرين إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل وإزالة قدر من حبس ممكن بعد ترك قطعة بالوعة forebrain إلى الجزء السفلي من الأنبوب الطرد المركزي.
  5. أضف 1 مل من 0.05% التربسين/يدتا (استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. استخدام ماصة باستور، بعناية إزالة التربسين دون الإخلال بقطعة الأنسجة وإضافة 1 مل نيوروباسال المتوسطة. ترك قطعة من الأنسجة في الحوض إلى الأسفل وإزالة المتوسطة. كرر هذا الغسيل مرة أخرى. هذه الخطوة ليغسل التربسين/يدتا.
  7. إضافة 2 مل من نيوروباسال المتوسطة وبدء تريتوراتينج. تريتوريشن ينطوي على اتخاذ ماصة باستور مصقول النار عقيمة وتمرير عدة مرات الأنسجة من خلال ذلك بلطف حتى ينظر إلى لا أكثر من قطعة من الأنسجة. إذا بقيت أي قطعة بعد يمر المتكررة، مجرد ترك لهم لتسوية للأسفل.
    ملاحظة: تجنب مزبد مع تريتوراتينج--إذا كان شكل زبد ووقف وإزالة بتطلع.
  8. تمييع تعليق إعادة الخلايا 01:10 مع المتوسطة نيوروباسال وعد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام صبغة تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. ميكس 50 ميليلتر من الخلايا المخفف مع 50 ميليلتر من حل تريبان الأزرق في أنبوب الطرد مركزي 0.5 مل. إضافة 10 ميليلتر هيماسيتوميتير بعد وضع على ساترة وحساب الخلايا واضحة مشرقة (الخلايا الزرقاء هي ميتة ولا ينبغي أن يحسب).
    ملاحظة: أرقام الخلية النموذجية من مجموعة E7 تكتم الألياف بصرية واحد بين 1 و 5 × 107 خلايا/مل.
  9. لوحة ينتابها الخلايا في ECM مغلفة بالاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في كثافة 2,200 الخلايا/ساحة مم. لنظامنا اتفاق بيئي متعدد الأطراف، وهذا يترجم إلى خلايا 130,000 تقريبا كل اتفاق بيئي متعدد الأطراف. إضافة نيوروباسال المتوسطة لجلب وحدة التخزين شركة طيران الشرق الأوسط إلى 1 مل ووضع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في الحاضنة2 CO بين عشية وضحاها لمرفق خلية ونورت ملحق (الشكل 1).
    ملاحظة: للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف من مناطق مختلفة وأرقام القطب، كثافة الخلية مختلفة يمكن أن يحاكم-وبصفة عامة، يؤدي إلى زيادة نشاط الشبكة أعلى كثافة الخلية، ولكن يؤدي أيضا إلى الثقافات عاش أقصر.
  10. في اليوم التالي، إضافة منهاج عمل بيجين إلى تركيز نهائي من 10 ميكرون في المتوسط نيوروباسال من المخزون 1 ملم به في الخطوة 1، 1 لاتفاق بيئي متعدد الأطراف المعالجة. لمراقبة اتفاق بيئي متعدد الأطراف، إضافة نفس الحجم من الإيثانول 10% في المحلول المائي (v/v).
  11. استبدال قضى المتوسطة مع المتوسطة نيوروباسال تحتوي على 10 ميكرومتر BPA كل يوم حتى 7 أيام في المختبر (7DIV) وفي كل يوم بعد ذلك، كما يزيد من نشاط شبكة الاتصال.
    ملاحظة: كما يزيد من نشاط الشبكة، يزيد من النشاط الأيضي والتغييرات وسائل الإعلام بحاجة إلى أن تكون أكثر تواترا. لا تدع المتوسطة بدوره أورانج.

3-تسجيل نشاط شبكة الخلايا العصبية

  1. في يوم اقتناء، تبادل المتوسطة الثقافة مع المتوسطة نيوروباسال جديدة والعودة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف للحاضنة2 CO للحد ني ح 2 قبل التسجيل. بدء تشغيل برنامج تسجيل وضبط درجة حرارة لشركة طيران الشرق الأوسط إلى 37 درجة مئوية عن طريق النقر على رمز درجة الحرارة (تكميلية الشكل 3.1 a-ب).
    ملاحظة: تسجيل يمكن أن تبدأ في أقرب وقت اليوم 3 من الطلاء، ويمكن أن تستمر ما دامت الثقافات على قيد الحياة.
  2. إعداد معلمات اقتناء بالنقر على أيقونة "موسى" (في إطار تيارات في لوحة الإطار الأيسر) وحدد "إضافة معالجة" و "كاشف سبايك" وانقر فوق موافق في يطفو على السطح نافذة. "سبايك كاشف (STD 6 x)" سوف تظهر أسفل اسم الملف (تكميلية الشكل 3.2 a-ب).
  3. القادم انقر على الحق في "كشف سبايك" وحدد "إضافة معالجة" و "انفجر الكاشف" وانقر فوق موافق في يطفو على السطح نافذة. "انفجر الكاشف" (ISI) سوف تظهر أسفل رمز موسى (تكميلية الرقم 3.3a-ب).
  4. انقر على الحق في "الكشف عن انفجار" المقبل، حدد "إضافة معالجة" و "المترجم إحصائيات العصبية". في النافذة المنبثقة، ضمان أن يتم تحديد رأس الملف، وتجميع الإحصائيات جيدا والتزامن. انقر فوق موافق. سوف تظهر "إحصاءات برنامج التحويل البرمجي" أدناه (تكميلية الرقم 3.4a-ب).
    ملاحظة: سيؤدي هذا إلى تعيين عبور عتبة التكيفية (6 x STD تصفية)، الفاصل بين المصطلحات الخاصة في 100 مللي ثانية مع عدد أدنى من طفرات في 5، يعني إطلاق الكشف عن معدل الساعة 10 s مع معلمة تتسق في 20 مللي ثانية، ومعدل ارتفاع الحد الأدنى في التموج 0.083333 في الدقيقة.
  5. إعداد التسجيل المجدول لوقت التسجيل لمدة 5 دقائق (300,000 ms) بالنقر على أيقونة على مدار الساعة في الجزء السفلي. ويتحقق ذلك عن طريق تغيير المعلومات الموجودة في المقطع إعداد تسجيل كل دقيقة 5.1 وتسجيل لمدة 5 دقائق. هذا وسوف تبدأ فورا وسوف يتم تنفيذها مرة واحدة (تكميلية الشكل 3.5).
  6. تأكد من أن درجة حرارة شركة طيران الشرق الأوسط قد وصل إلى 37 درجة مئوية قبل أن ينتقل شركة طيران الشرق الأوسط. إزالة شركة طيران الشرق الأوسط من الحاضنة ووضعه في وحدة التسجيل وتأمين شركة طيران الشرق الأوسط. البدء بتسجيل نشاط الشبكة بالنقر فوق بدء السجل في المقطع التسجيل المجدول أو رمز السجل في نافذة "تشغيل الملف". نموذجياً، وقت تسجيل لمدة 5 دقائق (300,000 ms) كافية، على الرغم من أن يمكن الحصول على تسجيلات أطول تصل إلى 10 دقائق.
  7. بعد التسجيل، العودة شركة طيران الشرق الأوسط إلى الحاضنة.
    ملاحظة: يجب الحرص على الحفاظ على العقم ولتقليل الوقت اتفاق بيئي متعدد الأطراف خارج الحاضنة.

4. تحليل البيانات

  1. يمكن أن يتم تحليل البيانات الخام دون اتصال باستخدام برنامج التسجيل. انقر فوق المنسدلة القائمة ملف وفتح التسجيل. حدد ملف البيانات الخام ليتم تحليلها. إعادة التسجيلات الأولية لالتقاط التشويك المعلمات المطلوبة.
  2. للحصول على "عدد متوسط من المسامير" واستخدام الوحدة النمطية "كشف سبايك" والحصول على "مؤشر التزامن"، استخدام الوحدة النمطية "العصبية إحصاءات برنامج التحويل البرمجي".
  3. تحميل كاشف سبايك وكاشف الاندفاع ووحدات المحول البرمجي الإحصاءات قبل (الفرع 3).
  4. من القوائم المنسدلة داخل الكاشف سبايك وانفجر الكاشف، و "إحصاءات برنامج التحويل البرمجي" الوحدة النمطية windows، حدد قائمة بالمصطلحات، وشبكة انفجر قائمة، ومقاييس متقدمة، على التوالي.
  5. انقر فوق الزر السجل لبدء تسجيل ملف البيانات الذي سيقوم بإنشاء ملف.csv في المجلد إخراج. سيتم تسجيل المعلمات سبايك-العدد الإجمالي للمسامير و "الرقم القياسي للتزامن"--في الملف.csv.
    ملاحظة: الوقت الحقيقي أثناء تسجيل البيانات الخام لا يوصي بإجراء تحليل كهذا يمكن أن تستهلك وقت المعالج والموارد الحسابية.

Representative Results

قمنا بدراسة تأثير منهاج عمل بيجين على التنمية تتسق في الفرخ الجنين الثقافات العصبية. تزامن النتوءات النشاط مؤشرا من مؤشرات التطور الطبيعي للشبكات العصبية في المختبر. عندما اثنين من طفرات تحدث داخل 5 مللي ثانية لبعضها البعض، فهي تعتبر متزامن. في المختبر الثقافات العصبية في البداية عرض نشاط التشويك عشوائية-طفرات تحدث عشوائياً والفواصل بين سبايك إظهار توزيع عادي. الثقافات الناضجة، يصبح أكثر مزامنة النشاط التشويك والفواصل بين ارتفاع مستمر. وكان quantitated النشاط التشويك متزامن لثقافة بالارتباط عبر تحليل سبايك مرات باستخدام تسجيل البرنامج12 لاشتقاق مؤشر التزامن (SI). ووجدنا أن التعرض BPA يؤثر سلبا على نمو نشاط الشبكة بتقليل النشاط التشويك والرقم القياسي للتزامن (الشكل 2 و 2). وخلاصة القول، أننا أظهرنا أن الآثار الضارة للتعرض BPA على جنين يؤثر في التنمية، بما في ذلك وظيفة الخلايا العصبية التي يمكن تقييمها من خلال وضع التزامن في الخلايا العصبية الفرخ في الثقافة.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي للبروتوكول التي تصور الخطوات من تشريح فرخ forebrain للانفصال، الطلاء، وتسجيل نشاط الشبكة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: (أ) متوسط عدد المسامير أقل بكثير في منهاج عمل بيجين تعامل الثقافات forebrain الفرخ E7 عند مقارنتها بالثقافات التحكم. تم استخراج متوسط عدد المسامير باستخدام برنامج التسجيل. الوسائل (التحكم، 14,890 ± 949.0، N = 15 ومنهاج عمل بيجين، 5,624 ± 465.9، N = 22) تختلف اختلافاً كبيرا (الاختبار t مزاوج، ف < 0.0001). (ب) أن تتسق متوسط المؤشر (SI) أقل بكثير في منهاج عمل بيجين تعامل الثقافات forebrain الفرخ E7 عند مقارنتها بالثقافات التحكم. تم استخراج الاشتراكية الدولية استخدام الوحدة النمطية "المترجم إحصائيات العصبية" داخل برنامج التسجيل. وسائل SI (التحكم، 0.5159 ± 0.06547 N = 15 ومنهاج عمل بيجين، 0.1140 ± 0.01840 ن = 22) تختلف اختلافاً كبيرا (الاختبار t مزاوج، ف < 0.0001). أشرطة الخطأ تصور الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

مراحل النمو السريع والتنمية مثل embryogenesis معرضة بشكل خاص للآثار الضارة للمركبات الصماء المختلفة، بما في ذلك منهاج عمل بيجين. نحن توفير بروتوكولات مفصلة لدراسة آثار التعرض BPA في نموذج شبكة العصبية فقاريات في المختبر . باستخدام هذا البروتوكول، أنشأنا أن منهاج عمل بيجين يخفض معدل سبايك فضلا عن فهرس تتسق في الشبكات العصبية النامية (الشكل 2أ-ب).

كانت تهدف إلى دراسة التعرض BPA أثناء embryogenesis المبكر منهجيتنا ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة آثار أخرى يشكل. الثقافات الخلايا العصبية الجنينية من الفرخ سهلة نسبيا لإقامة مقارنة بالنماذج الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الفئران أو الماوس. وعلاوة على ذلك، ليس هناك اشتراط لغرفة منفصلة لحيوان – حاضنة بسيطة على مقاعد البدلاء مختبر غير كافية لإجراء هذه الاختبارات. يصف لنا استخدام نظام متعدد القطب (طيران الشرق الأوسط) لتقييم تأثير تنمية الصادرات، منهاج عمل بيجين، على نشاط الشبكة. يمكن تطبيق البروتوكولات المذكورة هنا إلى أنظمة أخرى. جانبا مهما من هذا البروتوكول هو الحفاظ على العقم. وهذا يشمل تشريح الجنين تحت ظروف معقمة – تعقيم الصكوك مع الإيثانول 70% واستخدام "الحل" العقيمة هانك المتوازن أملاح غير كافية. كما يتم جمع البيانات على مدى فترة من أسابيع، من المهم الحفاظ على مناولة العقيمة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. الثقافات العصبية متى أنشئت يمكن تكون مثقف طويل الأجل-تصل إلى ثلاثة أشهر، وبالتالي فهي مفيدة لدراسة التعرض الطويل الأمد ليشكل والمركبات الأخرى في الشبكات العصبية. جانب آخر مهم من هذا البروتوكول هو الوقت من تشريح للطلاء. الوقت الأمثل 30 دقيقة، بما في ذلك الحضانة للأنسجة مع التربسين. يعد الوقت الذي يستغرقه، أكثر فقراً وبقاء الخلايا.

ونحن هنا وصف بروتوكول أساسية التي يمكن تطبيقها لتقييم أي مادة كيميائية أو المخدرات التي تؤثر على السلوك والوظيفة العصبية. هنا، لدينا تستخدم بكثافة خلية من الخلايا 2,200 الواحد مم2؛ ومع ذلك، يمكن تعديل هذه وكثافات خلية أخرى يمكن استخدامها. وبصفة عامة، فقد وجدنا أن زيادة كثافة الخلية يزيد نشاط الشبكة--أكثر من طفرات في وقت أقصر. وصف الأسلوب، رغم أن ذلك مفيد جداً في تقييم آثار المواد الكيميائية على نشاط الشبكة تعاني من أوجه قصور. واحدة من أعظم أوجه القصور في الأسلوب أن هذه الثقافات في المختبر اثنين الأبعاد قد لا تعكس بنية ثلاثية الأبعاد للدماغ الفقاريات. ويمكن التغلب على هذا باستخدام تسجيلات شريحة. بديل آخر تطبيق العلاجات على الجنين النامي الفرخ يعني من نافذة صغيرة قطع في نهاية واسعة من البيض15، تشريح الدماغ في نهاية نظام المعالجة، وجعل أبواب سميكة على فيبرتوم، ووضع على شركة طيران الشرق الأوسط تسجيل نشاط الشبكة.

لدينا بروتوكول مهم حيث أنه يمكن دراسة أثر يشكل على تطوير نشاط الشبكة ويوفر استكشاف أساس الميكانيكية لآثار هذه المواد الكيميائية.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هذه الدراسة معتمد من قبل جبهة الخلاص الوطني (هبكو إلى أعلى جائزة بدء البحث، 1401426 تنمية الموارد البشرية و EPS ابسكور-0814251)، والمعاهد الوطنية للصحة (نحاس 1P20GM103653-01A1). ك. س. معتمد من قبل على زمالة من 6404 الثالث إينبري في ولاية ديلاوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 foreceps Fine Science Tools 11251-10
Axion Muse MEA Axion Biosystems M64-GL1-30Pt200 Will be called MEA system in manuscript
Axis Software Axion Biosystems Will be called recording software in the manuscript
BPA Sigma-Aldrich 239658-250g
curved forceps Fine Science Tools 11272-50
EtOH Sigma-Aldrich 64-17-5
Fertilized chicken eggs from any local farm or Spafas
HBSS Fisher 14170112
Hemacytometer Fisher  02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free BD Biosciences 356231 Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript
Neurobasal medium BrainBits Nb4-500
Neuroexplorer statistical software Nex Technologies Neuroexplorer version 5
Pasteur pipettes Fisher  13-678-20A
spring scissors Fine Science Tools 15514-12
Sylgard bottom dissection dishes Living Systems Instrumentaion DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dye Fisher 15-250-061
Trypsin-EDTA Fisher 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis. Arch. of Histol. Cytol. 69, (2), 101-107 (2006).
  2. Dodds, C. Synthetic oestrogens. Br. Med. Bull. 11, (2), 131-134 (1955).
  3. Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S. Toxicology In Vitro. 26, (5), 727-731 (2012).
  4. Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women. New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).
  5. Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats. Environ Health Persp. 117, (6), 910-915 (2009).
  6. Okada, A., Kai, O. Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system. Asian J Androl. 10, (2), 271-276 (2008).
  7. Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice. Environ. Res. 108, (2), 150-157 (2008).
  8. Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, (4), 883-888 (2007).
  9. Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities. Proceedings Natl. Acad. Sci. 107, (47), 20405-20410 (2010).
  10. Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27 (2015).
  11. Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function. PLOS Genetics. 12, (7), 1006223 (2016).
  12. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits. PLoS ONE. 5, (12), 14443 (2010).
  13. Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results. J. Neurophysiol. 106, (3), 1500-1514 (2011).
  14. Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells. Nature. 281, (5730), 378-380 (1979).
  15. Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic. NeuroReport. 22, (16), 809-813 (2011).
  16. Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. A Comparison of Binless Spike Train Measures. Neural Comp. and Appl. 19, (3), 405-419 (2010).
  17. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
  18. Chiappalone, M., et al. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Res. 93, (2006).
  19. Li, X., et al. Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development. Biosens Bioelectron. 22, (7), 1538-1543 (2007).
تقييم آثار المركبات على تطوير شبكات عصبونية الفقاريات دالة باستخدام صفائف متعدد القطب الصماء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).More

Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter