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Developmental Biology

हड्डीवाला तंत्रिका नेटवर्क समारोह के विकास पर अंत-स्रावी बाधित यौगिकों के प्रभाव का आकलन बहु इलेक्ट्रोड सरणियों का उपयोग

doi: 10.3791/56300 Published: April 26, 2018

Summary

पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के संपर्क में तीव्रता से भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकते हैं । इस तरह के bisphenols के रूप में अंत स्रावी बाधित रसायनों तंत्रिका तंत्र पर प्रतिकूल असर करने के लिए जाना जाता है । यहां हम एक इन विट्रो हड्डीवाला (चिकी भ्रूण) का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन न्यूरॉन नेटवर्क मॉडल जल्दी भ्रूण पर विष जोखिम के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए.

Abstract

बीआईएस-phenols, जैसे बीआईएस-phenol ए (BPA) और बीआईएस-phenol-एस (बीपीएस), polymerizing एजेंटों व्यापक रूप से प्लास्टिक और कई रोजमर्रा के उत्पादों के उत्पादन में इस्तेमाल कर रहे हैं । वे एस्ट्राडियोल की तरह गुण के साथ अंत-स्रावी बाधित यौगिकों (EDC) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । EDCs के लिए दीर्घकालिक जोखिम, यहां तक कि कम मात्रा में, कैंसर, व्यवहार विकारों सहित विभिंन स्वास्थ्य दोषों के साथ जोड़ा गया है, और बांझपन, जल्दी विकास के समय के दौरान अधिक जोखिम के साथ । के विकास पर BPA के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ंयूरॉन समारोह, हम एक में इस्तेमाल किया इन विट्रो न्यूरॉन एक मॉडल के रूप में जल्दी लड़की भ्रूण मस्तिष्क से व्युत्पंन नेटवर्क. हमने पाया है कि BPA के लिए जोखिम नेटवर्क गतिविधि, विशेष रूप से spiking गतिविधि और तुल्यकालन के विकास को प्रभावित किया । नेटवर्क गतिविधि में परिवर्तन एक दवा या यौगिक और व्यवहार के परिणाम पर उसके प्रभाव के आणविक लक्ष्य के बीच महत्वपूर्ण कड़ी है । बहु इलेक्ट्रोड arrays तेजी से उपयोगी उपकरण बनने के लिए इन विट्रो मेंनेटवर्क गतिविधि पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन कर रहे हैं । वहां कई बाजार में उपलब्ध प्रणालियों रहे है और, हालांकि वहां इलेक्ट्रोड की संख्या में भिंनता है, प्रकार और इलेक्ट्रोड सरणी और विश्लेषण सॉफ्टवेयर की गुणवत्ता, मूल अंतर्निहित सिद्धांतों, और डेटा प्राप्त भर में एक ही है विभिंन प्रणालियों । हालांकि वर्तमान में दो के विश्लेषण के लिए सीमित विट्रो संस्कृतियों में आयामी, इन मेे सिस्टम को मस्तिष्क स्लाइस में vivo नेटवर्क गतिविधि में सक्षम सुधार किया जा रहा है । यहां, हम भ्रूण जोखिम और रिकॉर्डिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान ंयूरॉंस नेटवर्क गतिविधि और synchrony, साथ प्रतिनिधि परिणामों के साथ ।

Introduction

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, आमतौर पर Bisphenol के रूप में निर्दिष्ट-एक या BPA, एक एंटी ऑक्सीडेंट है पाली कार्बोनेट और epoxy राल आधारित थर्मल पेपर, सीडी से लेकर उत्पादों की एक विस्तृत विविधता में पाया, और चकनाचूर सबूत कांच के अंदर कोटिंग के लिए, पेय के डिब्बे । हालांकि bpa के लिए एक अंत-स्रावी बाधित एजेंट है कि1एस्ट्रोजन नकल करता है ज्ञात किया गया है, इसके बीमार BPA के लिए हर रोज आकस्मिक जोखिम के कारण प्रभाव पर अध्ययन ज्यादातर पिछले 10 में बाहर आ गए हैं-15 साल. BPA जोखिम के भी कम स्तर के परिणाम जल्दी विकास के समय में सबसे गहरा है, माताओं के जोखिम के माध्यम से embryogenesis के दौरान सहित2,3। अंत में स्रावी बाधित रसायनों के लिए महिला भ्रूण के जोखिम में utero भी योनि से स्तन कैंसर के लिए4,5में वृद्धि रोग संवेदनशीलता को जोड़ा गया है । पशु अध्ययनों से प्रदर्शन किया है BPA के लिए जोखिम असामान्य मस्तिष्क संरचना और कार्यात्मक असामान्यताओं में प्रकट होता है6. एक परिणाम के रूप में, शिशु खिला बोतलों में BPA के उपयोग के अधिकांश नियामक एजेंसियों द्वारा यूरोप और उत्तरी अमेरिका, एफडीए सहित पर प्रतिबंध लगा दिया गया है । विनियमों के साथ अनुपालन करने के लिए, कई निर्माताओं 4, 4 '-sulfonyldiphenol या bisphenol-S (बीपीएस) के लिए बंद कर दिया है. तथ्य यह है कि bpa और बीपीएस संरचनात्मक अनुरूप है और हाल ही में रिपोर्ट के आधार पर एस्ट्रोजन प्रतिलेखन में बीपीएस के तुलनीय शक्ति दिखाया7, यह BPA के सापेक्ष इस यौगिक की विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए BPA के प्रभाव का परीक्षण (और अंय EDCs) ंयूरॉंस के नेटवर्क पर एक हड्डीवाला मॉडल, चिकी भ्रूण का उपयोग कर । इन विट्रो में न्यूरॉन्स की संस्कृतियों फार्म synaptic संपर्कों और उत्पन्न कार्रवाई की क्षमता (spikes भी कहा जाता है). इन संस्कृतियों के spiking गतिविधि बहु इलेक्ट्रोड सरणी (मेे) प्रणालियों का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है । spikes synchrony में माना जाता है जब वे एक दूसरे के 5 ms के भीतर होते हैं । प्रारंभिक यादृच्छिक spiking गतिविधि है कि अंततः सिंक्रनाइज़ ंयूरॉंस नेटवर्क8,9के विकास की एक महत्वपूर्ण विशेषता है । Synchrony विभिंन तरीकों का उपयोग कर मापा जा सकता है और कई एल्गोरिदम साहित्य में वर्णित है9,10,11। हमारे विश्लेषण में, हम एक Paiva और सह द्वारा विकसित एल्गोरिथ्म का उपयोग करें12 जो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में एकीकृत है जो विदेश मंत्रालय अधिग्रहण प्रणाली ड्राइव । भ्रूण लड़की ंयूरॉंस की मजबूत spiking गतिविधि तंत्रिका नेटवर्क गतिविधि13पर BPA के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोटाइप प्रदान करता है । बहु इलेक्ट्रोड arrays का प्रयोग spiking गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, हमने देखा है कि BPA जोखिम ंयूरॉन spiking synchrony9,14के विकास को रोकता है । यहाँ, हम लड़की भ्रूण संस्कृतियों में न्यूरॉन spiking synchrony के विकास पर प्रतिनिधि परिणामों के साथ साथ संस्कृति में चिकी पर BPA जोखिम का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं.

Protocol

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के लिए (जल्दी) embryogenesis के दौरान BPA जोखिम के प्रभाव का परीक्षण मानकीकृत किया गया है, और बीपीएस, BPF, या लड़की भ्रूण ंयूरॉंस में अंय EDC के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल डेलावेयर राज्य विश्वविद्यालय की संस्थागत नीतियों और एवियन भ्रूण के लिए NIH नीति इस प्रकार है । प्रोटोकॉल भी है DSU सामग्री और रासायनिक सुरक्षा के दिशा निर्देशों के साथ पुष्टि में है ।

1. सामग्री सेटअप

  1. भंग BPA (m.w. २२८.२९) में 10% इथेनॉल (v/v) पानी में एक 1 मिमी स्टॉक समाधान बनाने के लिए (०.२३ 10% इथेनॉल की एमएल प्रति मिलीग्राम). बाद के कमजोर पड़ने (०.१ µ मीटर, ०.५ µ मीटर, 1 µ एम, 5 µ एम, और 10 µ मीटर) neurobasal माध्यम में बनाओ ।
    चेतावनी: BPA एक पर्यावरण विष है और देखभाल जब पाउडर हैंडलिंग प्रयोग किया जाना चाहिए ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तालिका में अंडे की मशीन में लड़की अंडे की मशीन । E7 भ्रूण के लिए 7 दिनों के लिए अंडे की मशीन ।
  3. तैयार रहत. बंध्याकरण की आवश्यक संख्या को ७०% इथेनॉल में भिगोकर 3 से 4 ज के लिए और फिर कुल्ला BSLII हूड में बाँझ आसुत जल के लगभग 10 मिलीलीटर में तीन बार ।
    नोट: रहत एक 8 x 8 ग्रिड में व्यवस्थित ६४ nanoporous प्लेटिनम इलेक्ट्रोड होते हैं । इलेक्ट्रोड व्यास 30 µm है और इलेक्ट्रोड के बीच की रिक्ति २०० µm है. इस रूप में विविकृत इथेनॉल का उपयोग न करें, क्योंकि इससे विदेश मंत्रालय की जंग को बढ़ावा मिलेगा ।
  4. ढक्कन के साथ एक बाँझ कंटेनर के अंदर रहत रखें (बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए) और एक मेज शीर्ष मशीन के लिए कदम । ५५ डिग्री सेल्सियस से कम 6 घंटे के लिए बनाओ । यह कदम उचित नसबंदी के लिए महत्वपूर्ण है और तापमान ६० डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए । बाँझ को बनाए रखने, आगे उपयोग होने तक भंडारण के लिए BSLII हुड को रहत युक्त पकवान ले जाएँ.
    नोट: हम प्लास्टिक के ढक्कन और सतह के साथ एक ओवन सुरक्षित गिलास बेकिंग डिश का उपयोग ७०% इथेनॉल और सुखाने के लिए BSLII हूड में जगह के साथ यह निष्फल ।
  5. Aliquot अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स ECM समाधान । रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर शीशी गल और १०० µ एल aliquots पर-20 ° c फ्रीज ।
    नोट: ECM जमे हुए भेज दिया है । ECM कमरे के तापमान के लिए नहीं लाया जाना चाहिए कोट करने के लिए तैयार है जब तक यह कमरे के तापमान पर polymerizes और, एक बार बहुलक, यह कोट करने के लिए असंभव है । विकास कारकों के बिना ECM अज्ञात कारकों के कारण अतिरिक्त प्रभाव को रोकने के लिए पसंद है ।
  6. सभी विच्छेदन उपकरणों (Dumont #5 संदंश, घुमावदार संदंश, छोटे कैंची, और स्प्रिंग कैंची) और स्व-सील सामग्री ७०% इथेनॉल के साथ लेपित विच्छेदन व्यंजन को निष्फल और उंहें विच्छेदन डाकू में सूखी ।

2. चिकी भ्रूण ंयूरॉन संस्कृति और नेटवर्क गतिविधि

  1. चढ़ाना के दिन, से ECM की एक शीशी-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे, और बर्फ पर जगह निकालें । BSLII हूड के अंदर ३०० µ एल कोल्ड neurobasal मीडियम को जोड़कर 25% तक पतला करें ।
  2. एक P200 pipetteman का उपयोग कर 25% ECM के १०० µ एल जोड़ने के केंद्र मेे ध्यान रखने के लिए इलेक्ट्रोड को छूने के लिए नहीं है और तुरंत सतह पर एक पतली फिल्म छोड़ने हटा दें । कवर विदेश मंत्रालय और सह में जगह2 मशीन (३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2) के लिए तैयार जब तक प्लेट ंयूरॉंस ।
  3. एक E7 egg के बाहरी कवच (भ्रूण 7 दिन, 7 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन) ७०% इथेनॉल के साथ निष्फल । Decapitate कैल्शियम के बिना एक Sylgard नीचे विच्छेदन शीत बाँझ हांक संतुलित लवण समाधान (HBSS) युक्त पकवान में भ्रूण की हत्या । आंखों के चारों ओर कट और आंख हटा दें । DuMont #5 ठीक संदंश और स्प्रिंग कैंची का प्रयोग ventral पक्ष पर एक चीरा बनाने के लिए और त्वचा की बाहरी परतों को हटाने के लिए forebrain और ऑप्टिक tectum बेनकाब । pial झिल्ली को छील कर सावधानीपूर्वक निकाल लें । एक और पेट्री डिश में forebrain स्थानांतरण और यह स्प्रिंग कैंची के साथ के बारे में 2 मिमी के छोटे टुकड़ों में कटौती ।
    नोट: कोई रक्त वाहिकाओं pial झिल्ली को हटाने के बाद forebrain से जुड़ी नहीं होना चाहिए । यदि उपलब्ध है, यह एक बाँझ विच्छेदन हुड में विच्छेदन करने के लिए बेहतर है, हालांकि हम काफी अच्छा परिणाम प्राप्त किया है जब विच्छेदन उपकरणों और विच्छेदन क्षेत्र पूरी तरह से ७०% इथेनॉल के साथ निष्फल रहे है के रूप में लंबे समय के रूप में एक हुड के बाहर किया जाता है .
  4. एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में forebrain के टुकड़ों को इकट्ठा करने और के रूप में संभव के रूप में HBSS के बहुत से हटाने के लिए forebrain के टुकड़े करने के लिए दे ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक ।
  5. ०.०५% Trypsin/EDTA (पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस से गर्म) और 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, ध्यान से ऊतक के टुकड़े परेशान बिना trypsin हटाने और 1 मिलीलीटर neurobasal मध्यम जोड़ें । टिशू के टुकड़ों को नीचे की ओर सिंक होने दें और मीडियम को निकाल लें । इस धोने को एक बार और दोहराएं । इस चरण को trypsin/EDTA से धोना है ।
  7. neurobasal मीडियम के 2 मिलीलीटर डालें और triturating शुरू करें । Trituration एक बाँझ आग पॉलिश पाश्चर पिपेट लेने शामिल है और इसे माध्यम से कई बार धीरे ऊतक के ऊतक के कोई अधिक टुकड़े जब तक गुजर देखा जाता है. अगर कोई टुकड़े दोहराया गुजरता के बाद रहना, बस उंहें छोड़ने के लिए नीचे बसने के लिए ।
    नोट: triturating करते समय फेन से बचें-अगर फेन फार्म करता है, बंद करो और आकांक्षा से निकालो.
  8. neurobasal माध्यम के साथ पुनः निलंबित कोशिकाओं 1:10 पतला और Trypan नीले रंग और एक hemocytometer का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं गिनती । मिश्रण ५० µ के साथ पतला कोशिकाओं के एल Trypan नीले समाधान के ५० µ एल में एक ०.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब । coverslip पर रखने के बाद hemacytometer के लिए 10 µ l जोड़ें और उज्ज्वल स्पष्ट कोशिकाओं गिनती (नीले कोशिकाओं मर चुके हैं और गिना नहीं जाना चाहिए).
    नोट: एक एकल E7 ऑप्टिक tectum श्रेणी से विशिष्ट सेल संख्या 1 और 5 x 107 कोशिकाओं/
  9. प्लेट २,२०० कोशिकाओं के घनत्व पर ECM लेपित रहत पर असंबद्ध कोशिकाओं/ हमारे विदेश मंत्रालय की व्यवस्था के लिए, इस अनुवाद के लिए लगभग १३०,००० विदेश मंत्रालय के प्रति कोशिकाओं । neurobasal माध्यम जोड़ने के लिए विदेश मंत्रालय में वॉल्यूम को 1 मिलीलीटर में लाने और सेल लगाव और neurite विस्तार (चित्रा 1) के लिए रात में सह2 मशीन में जगह रहत ।
    नोट: विभिंन क्षेत्रों और इलेक्ट्रोड संख्या के रहत के लिए, विभिंन सेल घनत्व की कोशिश की जा सकता है-सामांय में, अधिक से अधिक नेटवर्क गतिविधि में उच्च कोशिका घनत्व परिणाम है, लेकिन यह भी कम रहता संस्कृतियों की ओर जाता है ।
  10. अगले दिन, neurobasal माध्यम में 10 µ मीटर के एक अंतिम एकाग्रता के लिए BPA जोड़ें 1 मिमी इलाज मेे करने के लिए १.१ कदम में किए गए शेयर से । नियंत्रण मेे, पानी में 10% इथेनॉल (v/v) समाधान की एक ही मात्रा में जोड़ें ।
  11. neurobasal माध्यम से 10 µ मीटर BPA हर दूसरे दिन इन विट्रो में (7DIV) और उसके बाद हर दिन, के रूप में नेटवर्क गतिविधि बढ़ जाती है जब तक के साथ मध्यम खर्च बदलें ।
    नोट: के रूप में नेटवर्क गतिविधि बढ़ जाती है, चयापचय गतिविधि बढ़ जाती है और मीडिया परिवर्तन अधिक लगातार होने की आवश्यकता है । मध्यम बारी नारंगी मत देना ।

3. रिकॉर्डिंग ंयूरॉंस नेटवर्क गतिविधि

  1. अधिग्रहण के दिन, ताजा neurobasal माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम विनिमय और रिकॉर्डिंग से पहले 2 ज की एक ंयूनतम के लिए सह2 मशीन के लिए रहत वापस । रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर शुरू और तापमान आइकन पर क्लिक करके ३७ ° c के लिए विदेश मंत्रालय के तापमान सेट (पूरक चित्रा 3.1 a-b) ।
    नोट: रिकॉर्डिंग चढ़ाना के दिन 3 के रूप में जल्दी शुरू कर सकते है और जब तक संस्कृतियों जीवित है के रूप में जारी रख सकते हैं ।
  2. "सरस्वती" चिह्न (बाईं विंडो पैनल में धाराओं के तहत) पर राइट-क्लिक करके अधिग्रहण मापदंडों सेट और "प्रसंस्करण जोड़ें" और "स्पाइक डिटेक्टर" का चयन करें और पॉप अप विंडो में ठीक क्लिक करें । "स्पाइक डिटेक्टर (6 एक्स एसटीडी)" फ़ाइल नाम (पूरक आंकड़ा 3.2 a-b) के नीचे दिखाई देगा ।
  3. अगले सही स्पाइक डिटेक्टर पर क्लिक करें, चुनें "प्रसंस्करण जोड़ें" और "फट डिटेक्टर" और पॉप अप विंडो में ठीक क्लिक करें । "फट डिटेक्टर" (आईएसआई) सरस्वती आइकन के नीचे दिखाई देगा (पूरक चित्रा 3.3 a-b) ।
  4. अगला दायां क्लिक करें फट डिटेक्टर पर, चुनें "प्रसंस्करण जोड़ें" और "तंत्रिका सांख्यिकी संकलक." पॉप अप विंडो में, सुनिश्चित करें कि फ़ाइल हैडर, एग्रीगेट अच्छी तरह से आँकड़े और Synchrony चयनित हैं. ठीक क्लिक करें । "सांख्यिकी संकलक" नीचे दिखाई देगा (पूरक चित्रा 3.4 a-b) ।
    नोट: यह अनुकूली दहलीज पार (6x एसटीडी फिल्टर) सेट कर देगा, अंतर-स्पाइक 5 पर spikes की एक ंयूनतम संख्या के साथ १०० ms पर, 20 ms में एक synchrony पैरामीटर के साथ 10 एस पर फायरिंग दर का पता लगाने का मतलब है, और न्यूनतम स्पाइक दर पर ०.०८३३३३ spikes प्रति मिनट ।
  5. नीचे घड़ी चिह्न पर क्लिक करके 5 मिनट (३००,००० ms) की रिकॉर्डिंग समय के लिए शेड्यूल्ड रिकॉर्डिंग सेट करें । यह सेटिंग अनुभाग में जानकारी को बदलने के लिए हर ५.१ मिनट और रिकॉर्ड के लिए 5 मिनट के लिए रिकॉर्ड हासिल की है । यह तुरंत शुरू कर दिया जाएगा और एक बार (पूरक चित्रा ३.५) क्रियान्वित किया जाएगा ।
  6. मेे जाने से पहले यह सुनिश्चित कर लेना कि विदेश मंत्रालय का तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है । मशीन से विदेश मंत्रालय हटाएं, उसे रिकॉर्डिंग इकाई पर रखें, और नीचे मेे ताला लगा दें । प्रारंभ रिकॉर्ड में शेड्यूल किए गए रिकॉर्डिंग अनुभाग या "फ़ाइल चलाएं" विंडो में रिकॉर्ड चिह्न पर क्लिक करके नेटवर्क गतिविधि रिकॉर्ड करना शुरू करें । आमतौर पर, 5 मिनट (३००,००० ms) की रिकॉर्डिंग का समय पर्याप्त है, हालांकि अब 10 मिनट तक की रिकॉर्डिंग प्राप्त की जा सकती है ।
  7. रिकॉर्डिंग के बाद, विदेश मंत्रालय लौटने के लिए मशीन ।
    नोट: देखभाल के लिए बाँझ बनाए रखने के लिए और समय मेे मशीन के बाहर है को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए ।

4. डेटा विश्लेषण

  1. रॉ डाटा का विश्लेषण ऑफ़लाइन रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है । फ़ाइल पुल डाउन मेनू और खुली रिकॉर्डिंग पर क्लिक करें । विश्लेषण करने के लिए अपुष्ट डेटा फ़ाइल का चयन करें । आवश्यक spiking पैरामीटर्स को कैप्चर करने के लिए अपुष्ट रिकॉर्डिंग को फिर से चलाएं ।
  2. spikes की औसत संख्या प्राप्त करने के लिए, स्पाइक डिटेक्टर मॉड्यूल का उपयोग करें और Synchrony सूचकांक प्राप्त करने के लिए, तंत्रिका सांख्यिकी संकलक मॉड्यूल का उपयोग करें ।
  3. पहले के रूप में स्पाइक डिटेक्टर, फट डिटेक्टर और सांख्यिकी संकलक मॉड्यूल लोड (धारा 3) ।
  4. स्पाइक डिटेक्टर, फट डिटेक्टर, और आँकड़े संकलक मॉड्यूल खिड़कियों के भीतर पुल डाउन मेनू से, का चयन करें स्पाइक सूची, नेटवर्क फट सूची, और उन्नत मैट्रिक्स, क्रमशः.
  5. डेटा फ़ाइल रिकॉर्ड करना प्रारंभ करने के लिए अभिलेख बटन क्लिक करें जो निर्देशित फ़ोल्डर में. csv फ़ाइल बनाएगी । स्पाइक पैरामीटर-spikes और Synchrony सूचकांक की कुल संख्या-. csv फ़ाइल में दर्ज किया जाएगा ।
    नोट: वास्तविक समय विश्लेषण जबकि रिकॉर्डिंग कच्चे डेटा की सिफारिश नहीं है के रूप में यह प्रोसेसर समय और गणना संसाधनों का उपभोग कर सकता है ।

Representative Results

हम चिकी भ्रूण ंयूरॉन संस्कृतियों में synchrony विकास पर BPA के प्रभाव की जांच की । spiking गतिविधि के तुल्यकालन इन विट्रो मेंन्यूरॉन नेटवर्क के सामान्य विकास का एक संकेतक है. जब दो spikes एक दूसरे के 5 ms के भीतर हो, वे तुल्यकालिक माना जाता है । इन विट्रो में ंयूरॉंस संस्कृतियों शुरू में यादृच्छिक spiking गतिविधि प्रदर्शित-spikes बेतरतीब ढंग से होते है और अंतर स्पाइक अंतराल एक सामांय वितरण दिखाते हैं । संस्कृतियों के रूप में परिपक्व, spiking गतिविधि और अधिक सिंक्रनाइज़ हो जाता है और अंतर स्पाइक अंतराल लगातार कर रहे हैं । एक संस्कृति के तुल्यकालिक spiking गतिविधि quantitated एक Synchrony सूचकांक (एसआई) प्राप्त करने के लिए रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर12 का उपयोग करते हुए स्पाइक बार के पार सहसंबंध विश्लेषण के द्वारा किया गया था. हमने पाया है कि BPA जोखिम प्रतिकूल spiking गतिविधि और synchrony सूचकांक (चित्रा 2और बी3) को कम करने से नेटवर्क गतिविधि के विकास को प्रभावित करता है । संक्षेप में, हमें पता चला है कि एक भ्रूण प्रभावों पर BPA जोखिम के हानिकारक प्रभाव ंयूरॉन समारोह कि संस्कृति में लड़की ंयूरॉंस में synchrony विकास के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है सहित, ।

Figure 1
चित्र 1: पृथक्करण, चढ़ाना, और नेटवर्क गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए लड़की forebrain के विच्छेदन से कदम चित्रण प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: (क) spikes की औसत संख्या काफी कम है BPA इलाज E7 लड़की forebrain संस्कृतियों में जब संस्कृतियों नियंत्रण की तुलना में । spikes की औसत संख्या रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निकाला गया था । मतलब (नियंत्रण, १४,८९० ± ९४९.०, n = 15 और BPA, ५,६२४ ± ४६५.९, n = 22) काफी अलग थे (ख़राब टी परीक्षण, पी < 0.0001) । (ख) औसत synchrony सूचकांक (एसआई) BPA इलाज E7 चिकी forebrain संस्कृतियों में काफी कम है जब संस्कृतियों पर नियंत्रण की तुलना में । SI रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के भीतर तंत्रिका सांख्यिकी संकलक मॉड्यूल का उपयोग कर निकाला गया था. एसआई का अर्थ है (नियंत्रण, ०.५१५९ ± ०.०६५४७ n = 15 और BPA, ०.११४० ± ०.०१८४० n = 22) काफी अलग थे (ख़राब टी परीक्षण, पी < 0.0001). त्रुटि पट्टियां मानक विचलन दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

तेजी से विकास और embryogenesis के रूप में विकास के चरणों विशेष रूप से BPA सहित विभिन्न अंत-स्रावी बाधित यौगिकों के हानिकारक प्रभाव के लिए संवेदनशील हैं. हम एक में इन विट्रो हड्डीवाला ंयूरॉंस नेटवर्क मॉडल में BPA जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम स्थापित किया है कि BPA कील दर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विकासशील ंयूरॉंस नेटवर्क में synchrony सूचकांक (चित्रा 2ए बी) कम करती है ।

हमारी कार्यप्रणाली जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था और आसानी से अंय EDCs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । लड़की से भ्रूण ंयूरॉन संस्कृतियों अपेक्षाकृत आसान अंय हड्डीवाला मॉडल, चूहे या माउस सहित की तुलना में स्थापित कर रहे हैं । इसके अलावा, वहां एक अलग पशु कमरे के लिए कोई आवश्यकता नहीं है-एक प्रयोगशाला पीठ पर एक सरल मशीन के लिए इन परख बाहर ले पर्याप्त है । हम नेटवर्क गतिविधि पर EDC, BPA के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक बहु-इलेक्ट्रोड प्रणाली (मेे) के उपयोग का वर्णन करते हैं । यहां बताए गए प्रोटोकॉल अंय सिस्टंस पर लागू किए जा सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू बांझपन का रखरखाव है । यह बाँझ शर्तों के तहत भ्रूण के विच्छेदन-७०% इथेनॉल और बाँझ हांक संतुलित लवण समाधान के उपयोग के साथ उपकरणों को निष्फल करने के लिए पर्याप्त है शामिल हैं । के रूप में डेटा सप्ताह की अवधि में एकत्र की है, यह महत्वपूर्ण है बाँझ की हैंडलिंग बनाए रखने के लिए रहत । एक बार की स्थापना की ंयूरॉंस संस्कृतियों लंबे समय तक किया जा सकता है अवधि-अप करने के लिए तीन महीने-और इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोगी है दीर्घकालिक जोखिम EDCs और अंय यौगिकों के लिए ंयूरॉंस नेटवर्किंग पर । इस प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू विच्छेदन से समय चढ़ाना है । इष्टतम समय trypsin के साथ ऊतक की मशीन सहित 30 मिनट, है । अब समय ले लिया, गरीब कोशिकाओं का अस्तित्व ।

हम यहां एक बुनियादी प्रोटोकॉल है कि किसी भी रासायनिक या दवा है कि व्यवहार और तंत्रिका समारोह को प्रभावित करता है के आकलन के लिए लागू किया जा सकता का वर्णन । यहां, हम २,२०० प्रति मिमी कोशिकाओं के एक सेल घनत्व का इस्तेमाल किया है2; हालांकि, यह संशोधित किया जा सकता है और अंय कक्ष घनत्व उपयोग किया जा सकता है । सामांय में, हमने पाया है कि बढ़ती सेल घनत्व बढ़ जाती है नेटवर्क गतिविधि-एक छोटे समय में अधिक spikes । विधि वर्णित है, हालांकि नेटवर्क गतिविधि पर रसायनों के प्रभाव का आकलन करने में बहुत उपयोगी सीमाओं है । विधि की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक यह है कि इन विट्रो संस्कृतियों में दो आयामी हड्डीवाला मस्तिष्क के तीन आयामी वास्तुकला को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । स्लाइस रिकॉर्डिंग का उपयोग करके इसे दूर किया जा सकता है । एक अंय विकल्प के लिए एक छोटी सी खिड़की के माध्यम से विकासशील चिकी भ्रूण को उपचार लागू है15, उपचार आहार के अंत में मस्तिष्क काटना, एक vibratome पर मोटी वर्गों बनाने के लिए, और जगह पर विदेश मंत्रालय के लिए रिकॉर्डिंग नेटवर्क गतिविधि ।

हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण है कि यह नेटवर्क गतिविधि के विकास पर EDCs के प्रभाव की परीक्षा में सक्षम बनाता है और इन रसायनों के प्रभाव के लिए एक यंत्रवत आधार की खोज प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को NSF (HBCU रिसर्च दीक्षा पुरस्कार, एचआरडी १४०१४२६ और EPSCoR ईपीएस-०८१४२५१) और NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1) ने समर्थन दिया है । कृष्णसिंह डेलावेयर INBRE-III ६४०४ से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 foreceps Fine Science Tools 11251-10
Axion Muse MEA Axion Biosystems M64-GL1-30Pt200 Will be called MEA system in manuscript
Axis Software Axion Biosystems Will be called recording software in the manuscript
BPA Sigma-Aldrich 239658-250g
curved forceps Fine Science Tools 11272-50
EtOH Sigma-Aldrich 64-17-5
Fertilized chicken eggs from any local farm or Spafas
HBSS Fisher 14170112
Hemacytometer Fisher  02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free BD Biosciences 356231 Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript
Neurobasal medium BrainBits Nb4-500
Neuroexplorer statistical software Nex Technologies Neuroexplorer version 5
Pasteur pipettes Fisher  13-678-20A
spring scissors Fine Science Tools 15514-12
Sylgard bottom dissection dishes Living Systems Instrumentaion DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dye Fisher 15-250-061
Trypsin-EDTA Fisher 15400054

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References

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Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).More

Sanchez, K. R., Mersha, M. D., Dhillon, H. S., Temburni, M. K. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (134), e56300, doi:10.3791/56300 (2018).

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