Summary
Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.
Abstract
미토 콘 드리 아 셀의 강국입니다 그리고 ATP의 형태로 세포 에너지를 생산. 미토 콘 드 리아 기능 장애는 생물학적 노화 및 질환 대사 질환, 조기 노화 증후군, Alzheimer의 질병 (광고) 및 파 킨 슨 병 (PD)와 같은 신경 퇴행 성 질환 등의 다양 한에 기여 한다. 미토 콘 드리 아 건강의 유지 보수는 미토 콘 드리 아 속 mitophagy 통해 역 기능 mitochondria의 효율적 허가에 따라 다릅니다. 정확 하 게 감지 하 autophagy/mitophagy, 특히 동물 모델 실험 방법 개발에 도전 있다. Mitophagy의 분자 메커니즘의 이해로 최근 진행은 소설 mitophagy 탐지 기술 개발을 활성화 하 고 있다. 여기, 인간의 세포, 꼬마 선 충 mitophagy 모니터 여러 다양 한 기법 소개 (예를 들어, 윈저 DCT-1 / 하는지 1 긴장), 마우스 (mt Keima). 간 종 평가 포함 하 여 이러한 mitophagy 탐지 기술의 조합 mitophagy 측정의 정확도 개선 하 고 mitophagy 건강과 질병에서의 역할의 더 나은 이해로 이어질.
Introduction
Mitophagy은 미토 콘 드리 아 유지 보수를 위해 필수적 이다. 미토 콘 드리 아 여러 세포 신호 경로 교차 하 고 보편적인 하위 세포 세포 세포 에너지 생산과 세포 물질 대사, 칼슘 항상성1,2,3, 에 대 한 책임은 4. 미토 콘 드리 아 끊임없이 경험 반응성 산소 종 (선생님)와 미토 콘 드리 아 이용과 같은 내 인 성 및 외 인 근원에서 과제 각각, "세"와 역 기능 mitochondria의 세대 이끌어 내는. 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 유해한 ROS의 양을 증가 하는 동안 ATP 생산의 효율성을 감소 하 고 대사 질환, 광고, 같은 나이 관련 된 질병에 연결 되었다 PD1,5,6 . 유도 미토 콘 드리 아 세포 역 기능을 방지 하기 위해 셀 필요가 특히 미토 콘 드리 아를 손상 인식 하 고 효율적으로 세포 과정을 통해 그들을 제거 미토 콘 드 리아 autophagy를 (mitophagy) 불린다. 이 mitophagy 건강에서의 중요성을 설명 하 고 질병 검색 mitophagy 정확 하 고 효율적인 방법에 대 한 필요성을 보여줍니다 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.
Mitophagy는 많은 단백질과 단백질 단지5,,78와 관련 된 여러 단계 프로세스입니다. 간단 하 게, 손상 된 mitochondrion 처음 인식 이며9,10플라즈마 멤브레인, 바인딩과 그물, 골 단지, 핵, 또는 mitochondrion 자체에서 발생 한 수 있습니다 더블 membraned phagophore에 의해 잠겼습니다. 구형 phagophore elongates 및 결국 미토 콘 드리 아 autophagosome (mitophagosome) 구성 안에 미토 콘 드리 아를 봉인. mitophagosome 다음 성능 저하, 형성 하는 autolysosome는 손상된 mitochondrion 저하 및 재활용7,8은 리소좀으로 퓨즈. 또한 mitophagy에 관련 된 주요 autophagic 단백질 포함: Autophagy 관련 7 (ATG7) 및 Beclin1 (개시), Microtubule-Associated 단백질 1A/1B-라이트 3 (LC3-II) ( C. elegans에서 하는지-1)과 p62 체인 (phagophore의 구성 요소), 그리고 관련 된 lysosomal 막 당단백질 2 (LAMP2)6,7. 또한, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (핑크-1), Parkin1, 핵 점 단백질 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 상호 작용 단백질 3 처럼 (닉스/BNIP3L) (DCT-1 C. 선 충)를 포함 하 여 mitophagy에 고유한 여러 가지 필수적인 단백질은 다른 사람의 사이에서5,6,11.
Autophagy의 수준에서 변화를 감지 하는 일반적인 방법은 LC3-II/LC3-나의 LC3-II/말라 비율입니다. 그러나,이 메서드는 일반적인,이 비율 증가 증가 개시 또는 리소좀12mitophagosome의 장애인된 융합 반영 수 있습니다. 또 다른 방법은 없는 autophagy 마커 (예를 들어, LC3)와 미토 콘 드리 아 단백질 (예를 들어, Translocase의 외부 미토 콘 드리 아 막 20 (TOMM20, proteasomes에 의해 타락 될 수 있는)) 사이 colocalization를 평가 하는 것입니다. 그러나,이 수만 총 mitophagy 수준에서 변경 내용을 나타내고는 단계를 구별할 수 없습니다 어떤 막힘에 발생 합니다. 이 mitophagosomes의 축적을 병렬로 lysosomal 억제제 (예를 들어, E64d + Pepstatin A, EP에 게 불리는)를 사용 하 여 명백 하 게 될 수 있습니다. Mitophagosomes EP와 치료 다음과의 수와 초기에 mitophagosomes의 수의 차이 mitophagy를 나타낼 수 있습니다. 이러한 제한에는 소설 mitophagy 탐지 기술의 개발 라는 메시지가 있다. 인간의 질병의 넓은 스펙트럼에 mitophagy의 증가 관련성에 비추어 우리 연구원에 대 한 도움이 될 수 있습니다 몇 가지 강력한 mitophagy 탐지 기법 제시. 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 기술을 커버 하 고 mitophagy의 변경 사항을 확인 하려면 여러 기술을 결합 하는 것이 좋습니다.
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Protocol
동물 (남성 및 여성 쥐)는 태어나 고 NIH 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 공인된 동물 시설에서 사육 했다. 안락사 메서드는 모든 국가 및 기관의 규정에 일치 해야 합니다.
1입니다. 인간의 세포에 Mitophagy의 탐지
- Mt Keima 플라스 미드를 사용 하 여 mitophagy의 검출
참고: mt-Keima, 서 간체 미토 콘 드리 아 대상 신호 융합 Keima 단백질 mitophagy 검색 비보에 유용한 입증 했다. mt Keima 녹색 형광 (여기 458 nm) 기본 또는 중립 조건 및 산 성 조건에서 빨간색 형광 (여기 561 nm) 전시 비율 pH에 민감한 형광 단백질 이다. 건강 한 미토 콘 드리 아 기본 또는 중립 조건 (pH 7-8)에 번 창 하 고 산 Keima와 페 때 녹색 형광으로 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 mitophagy 받을 때 산 성 리소좀과 융합, pH 4.5 고 산 Keima를 포함 하는 미토 콘 드리 아 전시회 빨간 형광6,,1314. 중요 한 것은, 산 Keima은 오랜 동안 mitophagy의 평가 사용 하는 lysosomal 프로 테아 제. 프로토콜 아래 6 잘 플레이트 설계 되었습니다.- 주 1: 기본 인간 세포 (예를들면, 섬유 아 세포) 또는 불멸 하 게 인간의 세포 (예를들면, Hela 세포 또는 U2OS 셀)를 사용 합니다. 씨 약 0.3-1 × 106 6 잘 플레이트 (다음날에 70 %confluency 도달 하는 셀 수 있도록 셀 성장 율)에 따라 셀/잘. 완전 한 세포 배양 매체에서 세포를 유지 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 중간 보충 10 %FBS, 및 1% 혼합 페니실린 스의 솔루션), 고 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 품 어 (20% O2, 5 %CO2 ). 6 잘 플레이트 1 mL 완전 한 세포 배양 매체/잘 추가 합니다.
참고: 유전자 overexpression/최저 또는 마약 치료가 단계6에서 할 수 있습니다. - 주 2: 믹스 mt Keima 플라스 미드 DNA6 DNA transfection 시 약 (6-잘 접시의 한 잘 혼합).
- 15 µ L DNA transfection 시 약의 제조 업체의 프로토콜에 따라 혈 청 자유로운 매체의 150 µ L로 희석.
- 혈 청 무료 매체의 150 µ L로 산 Keima 플라스 미드 DNA의 2-5 µ g을 희석.
- 희석된 DNA transfection 시 약, 10에 대 한 소용돌이 희석된 산-Keima 플라스 미드를 추가 s, 그리고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
참고: DNA transfection 조건의 최적화 접시 크기에 따라 필요할 수 있습니다 (자세한 내용은 제조업체의 프로토콜 참조). - 셀에 dropwise DNA/transfection 시 혼합물을 추가 다음 솔루션은 완전히 혼합 때까지 부드럽게 5-10 s에 대 한 번호판을 흔들어.
- 제 3 일: 신선한 완전 한 세포 배양 매체 (1 mL/잘)와 DNA transfection 시 약 포함 된 매체를 대체 하 여 미디어를 변경 합니다.
- 제 4 일: 이미지 confocal 현미경 검사 법6을 사용 하 여 셀. 두 개의 영상 채널을 사용 하 여: 녹색 채널 (여기 458 nm, 방출 570-695 nm) 시각화 정상적인 미토 콘 드리 아와 빨강 채널 (여기 561 nm, 방출 570-695 nm) 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 mitophagy를 겪고 있다. 무작위로 20 지역에 모든 잘 100-200 셀의 총 커버 40 x 확대 이미지.
- 데이터 분석을 수행 합니다. "Mitophagy 색인"을 계산 (미토 콘 드리 아 mitophagy 진행의 백분율), 빨강 및 녹색 채널에 형광의 양을 계량 하 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여: 빨강 + 녹색 형광을 붉은 형광의 비율을가지고 100을 곱하면6.
참고: 대안 transfection 안정적으로 표현 하는 산-Keima 헬러 세포 라인14를 사용 하 여 포함 됩니다. 헬러 세포 Parkin 표현 하지 않습니다, 때문이 셀 라인에서 Parkin 종속 mitophagy 공부 하 Parkin은 안정적으로 표현 해야 합니다.
- 주 1: 기본 인간 세포 (예를들면, 섬유 아 세포) 또는 불멸 하 게 인간의 세포 (예를들면, Hela 세포 또는 U2OS 셀)를 사용 합니다. 씨 약 0.3-1 × 106 6 잘 플레이트 (다음날에 70 %confluency 도달 하는 셀 수 있도록 셀 성장 율)에 따라 셀/잘. 완전 한 세포 배양 매체에서 세포를 유지 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 중간 보충 10 %FBS, 및 1% 혼합 페니실린 스의 솔루션), 고 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 품 어 (20% O2, 5 %CO2 ). 6 잘 플레이트 1 mL 완전 한 세포 배양 매체/잘 추가 합니다.
- 시 토 크롬 C 산화 효소 소 단위 II (COXII)와 LAMP2 사이 colocalization를 사용 하 여 mitophagy의 검출
참고: COXII는 미토 콘 드리 아 게놈 인코딩 내부 막 단백질 이다. 'Mitophagy 인덱스' COXII COXII의 총 금액의 비율로 표시 하는 LAMP2와 colocalized의 비율을 같게 한다.- 헬러 세포 (또는 단계 1.1.1에서에서 언급 하는 관심사의 다른 세포) 씨 4-잘 챔버 슬라이드 (1 mL 완전 한 세포 배양 매체/잘에서 1-5 × 104 셀) 셀에서에 문화 인큐베이터 (20% O2, 5% CO2) 37 ° C에서 하룻밤.
- 추가 10 m m 카보닐기의 3.0 µ L-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) 시아 나 이드 및 3 h의 셀 문화 인큐베이터 (1.2.1 단계)에서 품 어.
참고: mitophagy에 영향을 미치는 다른 약물 사용할 수 있습니다. - 문화 매체 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거, 셀을 두 번 1 mL/추위의 잘 세척 (0-4 ° C) 1 x PBS. 솔루션 다음 세척 하기 전에 10-30 s 동안 앉아 보자. 다음 각 우물에 1 x PBS에 0.5 mL 3.7 %paraformaldehyde (PFA)를 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 얼음에 10 분 동안 품 어.
주의: PFA 독 소입니다. PFA 사용할 때 증기 두건에서 작동 합니다. - PFA 솔루션 1 mL 피 펫을 사용 하 여, 셀 감기 1 두 번 씻어 X PBS (1 mL/음; 게 솔루션 10 앉아 다음 세척 하기 전에 s), 1 mL/얼음에 10 분 (1 x PBS)에 0.25% 세제의 세포를 permeabilize 고.
- Permeabilizing 버퍼, PBS와 폐기 감기 1로 두 번 셀을 부드럽게 씻어 (하자 10 앉아 솔루션의 세척 사이). 1 mL/5% FBS 1 x PBS에 하룻밤에 4 ° c.의 세포를 차단 수 분 손실을 방지 하기 위해 챔버를 커버.
- 0.5-1 COXII 항 체 (마우스, 1: 250 희석)와 LAMP2 항 체 (토끼, 1시 20분-1시 50분 희석) 5 %FBS와 얼음에 저장소 1 x PBS에 혼합된 항 체 솔루션의 0.5 mL/잘 준비 h.
- 차가운 방에서 4-잘 챔버 슬라이드 밖으로가 고 1 mL 피 펫과 차단 솔루션을 삭제. 부드럽게 씻어 두 번 1 mL/PBS와 폐기 감기 1의 셀 (하자 10 앉아 솔루션의 세척 사이), 다음 0.5 mL를 추가/잘 혼합된 항 체 솔루션의. 낮은 속도로 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여 첫 번째 항 체 솔루션을 삭제 하 고 부드럽게 셀 세 번 1 mL/감기 1 x PBS의 잘 세척 하 고 삭제. 하자 솔루션 10 앉아 다음 세척 하기 전에 s. 1: 250 5% 희석에서 1 mL/잘 형광 이차 항 체 (예, 빨간 형광 단백질 LAMP2;에 대 한 (RFP)의 파장 568 nm와 염소 안티 토끼와 염소 안티 마우스 COXII에 대 한 녹색 형광 단백질 (GFP)의 파장 488 nm)의 추가 FBS 1 x PBS에. 알루미늄 호 일 4-잘 챔버 슬라이드 커버 하 고 낮은 속도로 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 두 번째 항 체 솔루션 1 mL 피 펫을 삭제 합니다. 부드럽게 셀 6 번 1 mL/감기 1 x PBS의 잘 씻는 다. 솔루션 다음 세척 하기 전에 1 분 동안 앉아 보자.
- 50 µ L/잘 DAPI와 함께 antifade 장착 매체의 셀을 탑재 하 고 커버 전표를 추가 합니다.
- 이미지 확대 및 침수 기름 x 66 confocal 현미경 세포 (타일 검사 / 모자이크 소프트웨어 이미지가 포함 된 셀의 수를 증가 하는 데 사용할 수 있습니다). 채널 노출 시간, 디지털 이득, 디지털 오프셋, 등 모든 이미징 프로세스 (자세한 내용은 참조 소프트웨어 지침)15에 걸쳐 동일한 설정을 사용 합니다.
- 100의 20 임의의 이미지를 양적 분석을 사용 하 여 colocalization 분석 소프트웨어15세포. "닫힌 베 지 어" 함수를 사용 하 여 전체 개별 셀을 선택 합니다. RFP, 가중치 또는 unweighted, 분석된 셀에 mitophagy 수준을 결정 하에 GFP의 피어슨의 colocalization 계수를 비교 합니다. 분석을 통해 colocalization 분석 소프트웨어의 수평 및 수직 십자선에 대 한 값을 유지 합니다. 이러한 십자선을 정확 하 게 설정 하려면 셀의 두 개의 추가 세트를 준비 하 고 한 COXII 및 다른 LAMP2. 그런 다음, 각 채널15 픽셀 분포 바로 위에 십자선 설정 (자세한 내용은 소프트웨어 지침 참조).
- 높은 처리량 측정 mitophagy 심사에 대 한 이미징
참고: 큰 화합물 라이브러리에서 mitophagy 유도 또는 억제 하는 mitophagy 화합물의 높은 처리량 화면 수행은 기술적으로 요구. 미토 콘 드리 아 autophagosomes와 colocalization에 기반 하는 이미징 기술을 mitophagy16심사에 대 한 더 간단한, 그러나 매우 중요 한 대안 이다.- 제 1 일: 96 잘 접시의 세포 (예를들면, 5000 셀/100 mL 셀 문화 미디어/잘에서 인간의 기본 fibroblasts) 씨앗 (1.1.1 단계 참조).
- 주 2: 지정 된 보육 시간에 대 한 두 번째 날 FCCP 또는 관심의 다른 화합물에서에서 세포 치료 (1.2.2 단계 참조).
- 따라 단계 1.2.2-1.2.9 COXII에 대 한 1 차 항 체를 사용 하 여 (마우스, 5%와 1: 250 희석 1 x PBS에서 FBS) 및 LC3B (토끼, 1: 100-5%와 1: 200 희석 1 x PBS에서 FBS). 또는, COXII 및 LAMP2에 대 한 1 차 항 체를 사용할 수 있습니다.
- 16형광 판독기 사용 하 여 셀을 이미지. 최소 500 세포/잘와 무작위로 배치 필드에 이미지를 수집 합니다.
- 16셀 분석기 사용자 지정 프로토콜 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
2. C. 선 충 에 Mitophagy의 탐지
참고: 선 충 류 선 충 C. organismal 수준에서 mitophagy를 시험 하는 플랫폼을 제공 합니다. 2 개의 긴장 mitophagy를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다: (1) 미토 콘 드리 아-타겟 윈저 (mtRosella) 또는 (2) mitophagy 수용 체 DCT-1 하는지-1 융합 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 (DsRed)5, autophagosomal 표식 함께 GFP 융합 17.
- 윈저 바이오 센서를 사용 하 여 모니터링 Mitophagy
참고: 윈저 pH에 민감한 GFP 변형 융합 pH을 구분 하지 않는 DsRed를 결합 하 여 분자 바이오 센서 이다. 윈저 바이오 센서 산 성 리소좀 (pH 4.5 ~)와 다른 세포질 구획의 pH 차이의 활용. 이 바이오 센서는 Saccharomyces cerevisiae 에 헬러, HEK293, 및 HCT11618,19등 여러 포유류 세포 라인 mitophagy 성공적으로 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 우리는이 다재 다능 한 듀얼-형광 기자 적응 하 고 유전자 변형 C. 선 충 을 생성 체 벽 근육 세포에서 미토 콘 드리 아 표적으로 윈저 (mtRosella)를 표현 하는 선 충. Mitophagy 유도 mtRosella 형광의 감소 GFP/DsRed 비율에 의해 표시 됩니다.- 제 1 일: L4와 대장균 (OP50) 해 부 현미경5를 사용 하 여 시드 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 접시에 시체 벽 근육 세포에서 미토 콘 드리 아 표적으로 윈저 (mtRosella)를 표현 하는 벌레의 애벌레를 선택 합니다. 적어도 3 개의 3.5 cm 접시에 10-20 벌레/접시를 놓습니다. 20 ° C5의 표준 온도에서 선 충을 품 어.
주: 웜 해부학, 포함 한 L4 애벌레20, 및 한 위치에서 다른21벌레를 전송 하는 데 사용 되는 선택을 하는 방법에 대 한 참조를 참조 하십시오. - 주 5: 15-20 L4 유전자 변형 애벌레를 선택 하 여 선 충을 동기화 하 고 신선한에 전송 OP50 시드 NGM 접시. 실험 조건 당 적어도 5 접시를 사용 합니다.
- 제 7 일: 관심이 나 긍정적인 컨트롤의 mitophagy에 영향을 미치는 약물에 대 한 차량 번호판을 준비 합니다.
- Mitophagy 유도 화합물 박테리아에 의해 대사 되지는 되도록 자외선의 222 µW/cm2 (강도)와 15 분 동안 NGM 번호판을 노출 하 여 시드 대장균 (OP50) 박테리아를 죽 일. 접시 2000 J/m2으로 노출 되어야 합니다.
참고: 초 노출 필요 = 2000/((intensity in µW/cm2) * 100). - 시드 NGM 접시 위쪽에 관심의 compound(s)를 추가 합니다. 부정적인 통제로 차량 번호판 복합 차량 (화합물, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 등을 분해 하는 데 사용 되는 용 매)의 상응 하는 금액을 추가 합니다. Mitophagy 유도, 미토 콘 드리 아 toxicant의 긍정적인 통제 파라콰트 (8mm 최종 농도) 사용 되었습니다. DdH2O 치료 그룹에 대 한 천 배지 위에 190 µ L로 8 M 파라콰트 주식의 10 µ L을 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 차량 그룹 ddH2O 한 천 배지 위에 190 µ L와 DMSO의 10 µ L을 포함 하는 솔루션을 추가 합니다.
참고: 파라콰트 작업 솔루션 수 있습니다 1 개월에 보관 4 ° c. - 부드럽게 마약까지 번호판을 소용돌이 또는 차량 코트 전체 표면. 벌레를 전송 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 닫힌 뚜껑 건조 격판덮개를 허용 한다.
참고: 마약 판 또한 그것 고형화 하기 전에 액체 NGM에 약물을 추가 하 여 준비 될 수 있습니다.
- Mitophagy 유도 화합물 박테리아에 의해 대사 되지는 되도록 자외선의 222 µW/cm2 (강도)와 15 분 동안 NGM 번호판을 노출 하 여 시드 대장균 (OP50) 박테리아를 죽 일. 접시 2000 J/m2으로 노출 되어야 합니다.
- 제 7 일: 10-20 2-하루-오래 된 성인 유전자 변형 동물 단계 2.1.2 파라콰트, 관심, 또는 차량 (DMSO)의 compound(s)를 포함 하는 접시에서에서 준비의 전송. 2 일 동안 20 ° C에서 유전자 변형 동물을 품 어.
- 주 9: 2 %agarose 패드 ( 보충 자료참조)를 준비 합니다. 다음 패드 당 M9에 20mm levamisole의 1 방울 (10 µ L)를 추가 합니다. M9 levamisole 드롭에서 그들을 배치 하 여 이미지에 대 한 유전자 변형 동물을 무력화. 부드럽게 위에 coverslip 장소.
- 단일 유전자 변형 동물 epifluorescence 현미경에 부착 된 카메라를 사용 하 여 캡처. 10 X 배율5체 벽 근육 세포에서 mtRosella을 표현 하는 전체 유전자 변형 선 충의 형광 이미지를 취득 합니다. 수집 된 이미지를 저장 합니다.
- ImageJ 소프트웨어 인수 이미지를 처리 합니다. 장 조직에서 autofluorescence을 피하기 위해 벌레의 머리에 있는 체 벽 근육 세포를 분석 합니다. 각 동물의 머리 영역의 형광 각 이미지에 대 한 평균 픽셀 강도 값과 전체 영역을 측정 합니다. 관심의 특정 영역을 분석:
- 이미지를 변환 하는 '이미지'와 '색상' 드롭 다운 메뉴에서 '분할 채널'을 선택 합니다.
- 형광 관심 영역을 잡으려고 '자유 선택' 도구를 사용 합니다.
- '분석' 드롭다운 메뉴에서 '측정' 명령을 선택 하 고 픽셀 강도 분석을 수행.
- 픽셀 강도 분석 전체 면적에 의해 강도 나누어 정규화 한다. 정규화, 시 DsRed 비율22에 GFP를 계산 합니다.
- 통계 분석을 소프트웨어 실시 학생 t를 사용 하 여-테스트 (두 그룹 간의 비교) 또는 중요 한5,17 p < 0.05와 통계 분석 ANOVA (여러 그룹 간의 비교) .
- 제 1 일: L4와 대장균 (OP50) 해 부 현미경5를 사용 하 여 시드 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 접시에 시체 벽 근육 세포에서 미토 콘 드리 아 표적으로 윈저 (mtRosella)를 표현 하는 벌레의 애벌레를 선택 합니다. 적어도 3 개의 3.5 cm 접시에 10-20 벌레/접시를 놓습니다. 20 ° C5의 표준 온도에서 선 충을 품 어.
- DCT-1과 1 하는지 사이의 공동 지역화를 사용 하 여 mitophagy를 평가
참고: DCT-1 조건, 포유류5에 그것의 상 상속 orthologues BNIP3와 닉스/BNIP3L와 비슷한 스트레스에 대 한 응답 mitophagy 수용 체로 작동 하는 외부 미토 콘 드리 아 막 단백질 이다. 따라서, mitophagy 개시는 DCT-1 mitophagy 수용 체 및 autophagosomal 막 단백질 하는지-1 (체 포유류 LC3) 사이 공동 지역화에 의해 평가 됩니다.- 제 1 일: 몸 벽 근육 세포5 는 OP50에 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1을 표현 하는 유전자 변형 동물의 선택 L4 애벌레 시드 NGM 접시. 5-10 웜/3.5 c m 플레이트, 배치 하 고 적어도 3 개의 격판덮개를 사용 하 여. 20 ° c.에 선 충을 품 어
참고:에서 transgenes는 별도 플라스 미드에 있으며 게놈에 통합 되지 않습니다. Rol-6(su1006) 및 p묘 2 GFP contransformation 마커를 운반 하는 선 충을 선택. 만 두 contransformation 마커 유전자 변형 웜 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1 몸 벽 근육 세포에 표현 한다. - 2.1.2-2.1.5에서 단계를 따릅니다.
- Confocal 현미경5,23에 연결 된 카메라를 사용 하 여 이미지 단일 몸 벽 근육 세포. 걸릴 z-스택 이미지 아래 63 x 확대 및 전체 몸 벽 근육 셀의 테두리를 검색 합니다. 높은 확대도 사용할 수 있습니다.
- 열고 이미지 confocal 소프트웨어와 함께 인수를 처리 합니다. Mitophagy의 autophagosomal 표시 (DsRed::LGG-1)에 mitophagy 수용 체 (DCT-1::GFP)의 공동 지역화 하 여 표시 됩니다. 수동으로 각 스택에 몸 벽 근육 세포5의 공동 지역화 이벤트 측정 합니다. 모든 현미경 및 카메라 설정 (렌즈, 돋보기, 필터, 노출 시간, 해상도, 레이저 강도, 이득, 등)을 실험을 통해 일관성 유지에 필수적 이다. 모든 설정은 유의 하십시오.
- 통계 분석을 소프트웨어 실시 학생 t를 사용 하 여-테스트 (두 그룹 간의 비교) 또는 중요 한5,17 p < 0.05와 통계 분석 ANOVA (여러 그룹 간의 비교) . 학생의 t를 사용 하는 양방향 비교-테스트 (p < 0.05 중요 한 여겨진다). 여러 비교에 대 한 특별 게시물 Bonferroni 테스트에 의해 수정 단일 요소 (ANOVA) 분산 분석을 사용 합니다. 적어도 50-70 동물 또는 각 실험 조건에 대해 30-50 체 벽 근육 세포를 분석 하는 것이 좋습니다. 실험 3 번 이상 반복 합니다.
- 제 1 일: 몸 벽 근육 세포5 는 OP50에 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1을 표현 하는 유전자 변형 동물의 선택 L4 애벌레 시드 NGM 접시. 5-10 웜/3.5 c m 플레이트, 배치 하 고 적어도 3 개의 격판덮개를 사용 하 여. 20 ° c.에 선 충을 품 어
3입니다. 쥐에서 Mitophagy의 탐지
참고: 쥐에서 mitophagy를 검색 하기 위해 이전 방법, 구분, 복잡 하 고 계량 하기 어려운 했다. 표현 대상으로 미토 콘 드 리아 형태의 형광 기자 Keima 유전자 변형 마우스 모델 (mt Keima) 지금 다양 한 생리 및 병 태 생리 조건에서에서 mitophagy의 수준을 평가에 활용할 수 있습니다.
- 14기관 동물 관리 및 사용 위원회 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 마우스를 안락사
- 마우스 (복 부 쪽)는 사지에 핀을 사용 하 여 작업 플랫폼을 확보. 간24노출 미세가 위와 집게를 사용 하 여 더 낮은 복 부에 절 개를 확인 합니다. 간 (예를 들어, 1 × 1 × 1 cm에서 오른쪽 엽의 조각)의 조각을 잘라 미세가 위와 집게를 사용 하 여.
참고: 쥐에서 mitophagy의 검색 복잡 이며 마우스 해부학 및 고도로 숙련 된 마우스 처리와 마우스 수술 지식이 필요 합니다. 이 프로토콜은이 방법에 기본 핵심 단계를 제공 합니다 그리고 더 자세한 방법은 사용할 수24. - 얼음을 빠르게 조직에 금속 접시에 간 샘플을 놓습니다. 차가운 금속 접시에 조직을 유지 하 고 최대한 신속 하 게 처리. 최적으로, 해 부의 1 시간 이내 사용 합니다.
- 곡선된 집게를 사용 하 여 간 샘플 들어올린 얼음 1 x PBS의 5 mL로 씻어.
- 주걱의 스푼 끝을 사용 하 여 얼음에 간 페 트리 접시 (Ø 100 m m) 전송.
- 잘라 간 샘플 손으로 0.5-1 m m 두꺼운 부분 단일에 지 블레이드를 사용 하 여.
- 신중 하 게 유리 하단 접시 미세 집게를 사용 하 여 조직 단면도 전송 합니다.
- 조심 스럽게 바닥에 평평 하 게 집게와 간 섹션을 설정 합니다.
- 감기 1 x PBS의 3-5 방울과 슬라이스 간 커버.
참고: DAPI 얼룩 특정 조직 (예를 들어, 뇌)24에 관심 영역을 식별 하려면 것이 좋습니다. 붉은 산-Keima 신호는 리소좀과의 공동 지역화의 유효성을 검사 하려면 dextran 캐스케이드 블루 등 lysosensor, lysosomal 염료 사용된24일 수 있다. - 두 개의 순차적 업무가24통해 confocal 현미경 검사 법에서 조직 섹션 이미지. 두 개의 영상 채널 설정: "녹색" mt Keima 채널 (여기 458 nm, 방출 570-695 nm 범위)와 "레드" mt-Keima (여기 561 nm, 방출 570-695 nm 범위). 실험 조건 사이 영상 설정을 유지 합니다. 더 효율적인 이미징에 대 한 한 번에 두 동물을 분석 합니다.
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Representative Results
인간 세포에 Mitophagy의 검출:
여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 인간 헬러 세포 mt Keima 플라스 미드와 페 했다. 건강 한 세포는 잘 조직 된 미토 콘 드 리아 네트워크 시연 (GFP, 488 nm)와 mitophagy의 몇 가지 부각 (RFP, 561 nm). 그러나, 세포는 미토 콘 드리 아 uncoupler FCCP와 청소용 (3 h 30 µ M) mitophagy 발생 (그림 1A)에서 깊은 증가 전시. Mitophagy는 LAMP2와 COXII (그림 1B) 사이 공동 지역화를 사용 하 여 측정 했다.
C. 선 충 에서 Mitophagy의 검출
우리 DsRed 하는지-1 mtRosella 및 DCT-1 융합을 표현 하는 유전자 변형 선 충의 세포 산화 스트레스 등 정상과 mitophagy 유도 조건에서 GFP 융합 체 벽 근육 검사. 유전자 변형 동물 파라콰트 (2 일 동안 8 m m)에 노출 되었다. Mitophagy 유도 mtRosella 형광 (그림 2A)의 감소 GFP/DsRed 비율으로 표시 됩니다. 또한, DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1 신호 간의 공동 지역화 이벤트의 상승 된 수는 산화 스트레스 (그림 2B)에 대 한 응답 mitophagy 자극을 의미 한다.
Mitophagy 산 Keima 마우스를 사용 하 여 검색:
Vivo에서 mitophagy의 분석 영상 정상 및 병 태 생리 조건에서 mitophagy에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 다른 기관 조직, 간, 소 뇌 (그림 3), 같은 mitophagy 발생 confocal mitophagy와 구상 될 수 있다.
그림 1입니다. 인간 세포에서 mitophagy를 평가 하는 다른 방법. (A) 인간의 HeLa 세포 했다 페 mt Keima 플라스 미드와 함께 3 일 동안 뒤에 모두 488에서 이미징 및 561 nm. 긍정적인 통제로 ceflls 이미징 FCCP (30 µ M) 3 h 사전으로 대우 되었다. (B) LAMP2 (RFP)와 COXII (GFP) 얼룩진 인간의 기본 섬유 아 세포의 이미지. 안티-TOM20 (빨강) 및 안티-LC3 (녹색) 항 체로 얼룩진 인간의 섬유 아 세포의 (C) 이미지. 오른쪽에 막대 표시 autophagosomes와 공동 지역화 하는 미토 콘 드리 아의 판독 됩니다. 공동 지역화 에너지 스트레스 (포도 당 자유로운 갈 락 토스 미디어)와 (A), 24 h. 대표 규모 바 lysosomal 억제제 E64d와 Pepstatin A (EP)의 추가 의해 증가 된다 (B), 그리고 (C) 마지막에 표시 됩니다 각 패널의 독립적으로 안 그림. 양적 데이터 평균 ± S.E.M.에에서 표시 됩니다 * * *p < 0.001; t-테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. C. 선 충에 mitophagy의 검색 기능이 vivo에서 . (A) 유전자 변형 nematodes 몸 벽 근육 세포에서 mtRosella 표현 8mm 파라콰트로 치료 했다. Mitophagy 자극 pH을 구분 하지 않는 DsRed에 pH에 민감한 GFP 사이 감소 비율의 의미는 (n = 50; * * *p < 0.001; t-테스트). 화살촉을 창 자 autofluorescence 지적. 스케일 바 20 µ m. 수집 내용 표시: 노출 시간, 200 ms; 대비, 중간입니다. 이미지는 10 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 양적 데이터 평균 ± S.E.M. 값에 표시 됩니다. (B) 유전자 변형 nematodes DCT-1 함께 하는지-1 융합 체 벽 근육 세포에서 DsRed autophagosomal 단백질 GFP 융합 mitophagy 수용 체를 표현 하는 공동 8 m m 파라콰트에 노출 되었다. Mitophagy 유도 GFP의 공동 지역화의 의미와 DsRed 신호 (이미지 DCT-1의 각 그룹은 autophagosomes 아래의 빨간색 위쪽과 아래쪽에 병합된 이미지에 녹색에서 표시 n = 30; * * *p < 0.001; t-테스트). 판매 바 20 µ m. 수집 내용 표시: 해상도, 1024 X 1024; 마스터 얻을, Track1: 562와 Track2: 730; 배기 필터, Track1 Channel1: 639 nm와 Track2 채널 2: 519 nm; 강도, Track1 레이저 (543 nm): 12.9%와 Track2 (488 nm): 39.4%. 이미지는 40 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 양적 데이터 평균 ± S.E.M.에에서 표시 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Mt Keima 유전자 변형 쥐에서 mitophagy의 vivo에서 탐지. Mt Keima 신호 간 (위)에 mt Keima 마우스의 뇌 영역 (를 포함 하 여 Purkinje 세포, 하단 패널)의 대표 이미지 (458 nm, 녹색; 561 nm, 빨간색). 눈금 막대 나타냅니다 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Mitophagy의 정확한 측정은 기술적으로 요구 하 고 있다. 여기, 우리는 mitophagy의 질적 모두 검출 및 정량화의 가장 일반적인 실험실 실험 모델 mitophagy 수준에 대 한 허용 하는 여러 가지 강력한 기법 제시.
복제할 데이터를 얻기 위해 적어도 3 개의 생물 학적 반복 된 실험 설계는 필요 하다. 실험 및 분석에 관련 된 모든 연구 실험 그룹 id에 멀게 합니다. 또한, 필드 이미징 선택 되어야 한다 무작위로 이미지 중. 세포 배양 및 C. 선 충 연구, 적어도 3 개의 생물 학적 반복 수행 되어야 한다. Mt Keima 마우스 연구, 쥐의 충분 한 번호를 사용 하 여 통계적 의미를 달성 하는 것이 좋습니다. 포유류 세포에 대 한 각 실험에 대 한 30-100 셀을 분석 하 고 적어도 3 다른 실험을 실행 합니다. 이 단계에서 품질 관리 결과를 복제할 수 있습니다. 효 모에 mitophagy의 감지 되었습니다 최근25다른 요약.
생체 외에서 mitophagy 탐지 기술에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. Transfection 효율, 시 약 및 DNA의 품질에 따라 달라 집니다 사용, transfection mt Keima 단백질의 동안 생명 이다. 따라서, 서로 다른 조건 (예를 들어, 다른 셀 라인을 사용 하 여)에서 transfection 효율의 최적화 필요 하다. LAMP2/COXII 방법에 대 한 항 체 특이성 최적의 기본 항 체 희석 배 이미지의 품질에 영향을 하 고 실험을 시작 하기 전에 테스트 해야 합니다. 동일 항 체 품질 및 희석은 중요이 콘텐츠 이미징 방법에 적용 됩니다. 자동된 현미경 시스템 및 사용자 정의 분석 프로토콜 이미징 및 적어도 1500 셀/조건, 다른 비보에 이미징 기반된 방법에 비해 매우 강력한 결과 만드는의 분석에 대 한 수 있습니다. 또한, 분석 프로토콜 mitophagy 연구에 매우 유용 하는 셀에 의해 셀 기준 길이 총 지역 등 추가 미토 콘 드 리아 매개 변수에 데이터를 제공 합니다.
어떤 경우에 그것은 TOMM20 같은 미토 콘 드 리아 외부 막 단백질 LAMP2의 colocalization 시험을 권장 하지 않습니다. Mitophagy의 아주 초기 단계 Parkin 중재 미토 콘 드 리아 외부 막 단백질, TOMM20 및 Mitofusin 1 (MFN1)를 포함 하 여의 ubiquitination를 포함 한다. Parkin 여러 다른 유비퀴틴 사슬 연계 26S 프로테아좀에 의해 단백질의 분해를 촉진, K48 연결 유비퀴틴 체인 등이 단백질에 변화. 따라서, 이러한 ubiquitinated 미토 콘 드 리아 외부 막 단백질 mitophagy 차단된6비록 저하 여전히 수 있습니다. 이 전체 데이터 해석에서 잘못 된 반응의 결과 데이터를 왜곡 수 있습니다. 또한, 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA nucleoids)의 mitophagy의 두 번째 표시기 이며 면역 형광 항 DNA 항 체6을 사용 하 여 측정할 수 있습니다.
C. 선 충 에서 vivo에서 mitophagy 모니터링에 대 한 몇 가지 중요 한 단계는 다음과 같습니다.
1. 새로운 접시 마다 24-48 h 혼합된 인구 또는 기아, 자체에 이르게 자손의 파생물을 피하기 위해 권장 유전자 변형 동물의 이전 mitophagy 실행할 수 있는. 따라서, 비-굶 어 nematodes 사용 되어야 한다.
2. Levamisole nematodes을 무력화 하는 데 사용 되는 가벼운 마 취입니다. 나트륨 아 지 드 등 미토 콘 드리 아 활동에 영향을 미칠 수 있는 마 취약을 피하십시오. 나트륨 아 지 드 미토 콘 드리 아 호흡 사슬의 구성 요소를 차단 하 고 에너지 생성, 미토 콘 드 리아 산화 스트레스에 이어지는 perturbs. 따라서, 나트륨 아 지 드 mitophagy를 실행할 것입니다.
3. 표본 현미경 검사 중 건조 수 없습니다 한다. 따라서, 물 대신 M9 버퍼를 사용 하 여 호의 베푸는 삼투성 조건 되도록 것이 좋습니다.
4. 장 autofluorescence C. 선 충나이로 증가 한다. 따라서, 소장에 가까운 몸 벽 근육 세포는 현미경 검사 하는 동안 피해 야 한다.
5. 파라콰트 mitophagy 유도에 실패 하는 경우: a. b. 벌레에 파라콰트 노출 시간을 증가 때문에 효율이 시간이 지남에 감소 증가 파라콰트 농도, 또는 c. 파라콰트의 신선한 작업 솔루션 준비.
6. matricidal 부 화를 증가 하는 경우 웜 중 파라콰트, 노출에서 관찰 됩니다: a. 파라콰트 치료 기간을 줄일 수, b. 줄일 파라콰트 농도, fluorodeoxyuridine (FUdR) (최종 c. 보충 접시 100-400 μ M의 농도), 부 화 계란, 또는 디 방지 DNA 합성의 억제제 실시 이전 웜 (예를 들어, 4-하루-오래 된 웜)에서 실험.
이 절차는 mt Keima 유전자 변형 쥐를 사용 하 여 그림 3과 같이 간에서 mitophagy 이미징에 대 한 단계를 설명 합니다. 뇌 및 간 조직 mt Keima 시스템14를 사용 하 여 분석 되었습니다. 듀얼-여기 비율 영상 간 조직에 두 개의 순차적 업무가 통해 얻을 수 있습니다. 모든 이미지는 갓 삭제 장기에서 가져와야 합니다. 조직 검사 유지 되어야 한다 감기 및 처리 가능한 한 빨리. 어떤 나이에 간 슬라이스를 얻을 수 있습니다. 때 mitophagy 이미징, 현미경 분석 중 각 기관 레이저 파워 및 노출 시간을 최적화 합니다. 레이저 파워 mt Keima 신호14의 명확한 시각화 수 있도록 최저 출력에서 설정 되어야 합니다. 그러나, 산 Keima 유전자 변형 쥐에 대 한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 고정 아래 lysosomal 막에 걸쳐 pH 기온 변화도의 손실 뿐 아니라 Keima의 불안정 때문이 마우스 모델은 cryo 단면화 및 immunohistochemistry에 적합 합니다. 또 다른 한계는 mt-Keima, 또는 매트릭스 집계가이 단백질의 영향을 미칠 수 알 수 없는 미토 콘 드리 아 또는 세포 기능, 비록 미토 콘 드 리아 산소 소비 속도14변경 되지 않습니다. 또한, 산 Keima 마우스와 관련 된 비용과 시간 상기 세포 배양 방법과 C. 선 충 보다 높은 처리량 분석에 대 한 바람직한 덜 렌더링 합니다. 여기에 언급 된 방법 외 양적 mt Keima 마우스에 mitophagy를 공부 하는 다른 방법에는 서쪽 오 점 또는 FACS 포함 됩니다. 또 다른 mitophagy 마우스 모델, mt Keima 유전자 변형 쥐 뿐만 아니라 주의 하는 "미토-QC", pH에 민감한 형광 미토 콘 드리 아 신호26유전자 변형 마우스 모델. 복잡성과 mitophagy의 역학, 다른 일반적인 mitophagy 검출 방법, 전자 현미경 등 결과 강화 하기 위해 더럽혀 서 상기 형광 메서드를 결합 하는 것이 좋습니다.
여기에 언급 된 그들과 같은 새로운 mitophagy 탐지 기술의 개발 높은 처리량 약 화면에 mitophagy의 기계 론 적인 연구에서 광범위 한 응용 프로그램을 가질 것 이다. 그 mitophagy은 exogenous와 내 생 변동 (예를 들어, 셀 문화 조건 셀 밀도, 기아, hypoxia, 등등)에 의해 쉽게 영향을 주목 해야 한다 1 , 5 , 8. 따라서 그것은 답해야 같은 실험 조건 모든 실험에 대 한 유지 됩니다. 그것은 올바른 해석의 mitophagy 상태를 확인 하려면 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문에 다른 mitophagy 검출 방법의 조합을 사용 해야 합니다. 더 mitophagy, 언급, 기술을 통해 달성의 메커니즘의 이해 mitophagy 검출의 새로운, 더 정확한 방법의 개발에 대 한 수 있습니다.
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Disclosures
보어 연구소 ChromaDex와 GlaxoSmithKline CRADA 준비 하고있다.
Acknowledgments
우리 박사 아츠 시 미 야와 키와 박사 리처드 J. Youle mt Keima 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사 및 mt Keima 통합 Hela 세포. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 Raghavendra A. Shamanna와 박사 데보라 L. Croteau 감사합니다. 이 연구는 NIH (VAB)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다, 노화, 2014-2015 년에 국립 연구소와 NIA 2016-2017 내부 실험실 (EFF, VAB) 부여 합니다. EFF HELSE 대단히 OST RHF에 의해 지원 되었다 (프로젝트 No: 2017056)와 노르웨이의 연구 위원회 (프로젝트 No: 262175).
작가 기부:
EFF는 원고를 설계 하 고 준비 초안; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH, 그리고에 드 쓴 다른 부분의 종이; NT, JP, HN, VAB 개정 원고와 전문성을 제공.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
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