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In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Published: November 22, 2017 doi: 10.3791/56301
Automatic Translation
1,6, 2, 3, 1, 4, 1, 1, 1, 5, 6, 2,7, 5, 6, 1,8
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

Summary

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

Abstract

As mitocôndrias são as potências de células e produzem energia celular na forma de ATP. Disfunção mitocondrial contribui para o envelhecimento biológico e uma grande variedade de doenças, incluindo doenças metabólicas, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD) e síndromes de envelhecimento prematuro. Manutenção da saúde mitocondrial depende de biogênese mitocondrial e eficiente apuramento das mitocôndrias disfuncionais através de mitophagy. Métodos experimentais para detectar com precisão a autofagia/mitophagy, especialmente em modelos animais, tem sido um desafio para desenvolver. Recentes progressos no sentido da compreensão dos mecanismos moleculares de mitophagy permitiu o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Aqui, apresentamos várias técnicas versátil para monitorar mitophagy em células humanas, Caenorhabditis elegans (por exemplo, Rosella e estirpes DCT-1 / IgG-1) e os ratos (mt-Keima). Uma combinação destas técnicas de deteção de mitophagy, incluindo a avaliação entre espécies, irá melhorar a precisão das medições mitophagy e levar a uma melhor compreensão do papel do mitophagy na saúde e na doença.

Introduction

Mitophagy é essencial para a manutenção mitocondrial. Mitocôndria celular múltiplas vias de sinalização se cruzam e é organelas celulares sub universais responsáveis pela produção de energia celular, metabolismo celular e cálcio homeostase1,2,3, 4. as mitocôndrias constantemente experimentam desafios de fontes endógenas e exógenas, como espécies reativas de oxigênio (ROS) e tóxicos mitocondriais, respectivamente, que levam à geração de mitocôndrias disfuncionais e "envelhecidas". Acúmulo de mitocôndrias danificadas diminui a eficiência da produção de ATP, enquanto aumenta a quantidade de ROS prejudiciais e tem sido associado a doenças relacionadas com a idade, como doenças metabólicas, AD e PD1,5,6 . Para evitar a disfunção celular mitocôndria induzida, necessidade de células especificamente reconhecer danificado mitocôndrias e eficientemente removê-los através de um processo celular denominado autofagia mitocondrial (mitophagy). Isto demonstrou a importância da mitophagy em saúde e doença ilustra a necessidade de métodos precisos e eficientes detectar mitophagy tanto in vitro e in vivo.

Mitophagy é um processo de várias etapas que envolvem muitas proteínas e complexos de proteína a5,7,8. Em breve, uma mitocôndria danificada primeiro é reconhecida e tragada por um phagophore double-membraned, que pode se originam da membrana plasmática, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, núcleo ou mitocôndria em si9,10. O esférico phagophore alonga e eventualmente lacra as mitocôndrias no interior, que constitui o autophagosome mitocondrial (mitophagosome). O mitophagosome então se funde com o lisossomo para degradação, formando um autolysosome em que a mitocôndria danificada é degradadas e reciclados7,8. Principais proteínas autophagic também envolvidas em mitophagy incluem: autofagia relacionados 7 (ATG7) e Beclin1 (iniciação), proteína Microtubule-Associated 1A/1B-luz corrente 3 (LC3-II) (LGG-1 em c. elegans) e p62 (componentes do phagophore), e glicoproteína de membrana lisossomal-associado 2 (luz2)6,7. Além disso, há várias proteínas essenciais exclusivos para mitophagy, incluindo induzida por PTEN putativo quinase 1 (rosa-1), proteína Nuclear de ponto 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interagindo proteína 3 como (NIX/BNIP3L) (DCT-1 em c. elegans), entre outros5,6,11.

Um método comum para detectar mudanças nos níveis de autofagia é pela relação de LC3-II/LC3-I ou II/LC3-actínio. No entanto, esse método é inespecífico, como um aumento desta relação pode refletir uma iniciação maior ou uma fusão prejudicada de mitophagosome a lisossoma12. Outro método consiste em avaliar o colocalization entre um marcador de autofagia (por exemplo, LC3) e uma proteína mitocondrial (por exemplo, Translocase de exterior mitocondrial membrana 20 (TOMM20, que pode ser degradado por proteasomes)). No entanto, isto só pode indicar alterações nos níveis de mitophagy total e não consegue distinguir da execução no qual bloqueio ocorre. Isso pode ser esclarecido usando inibidores dos lisossomos (por exemplo, A E64d + Pepstatin, denominado EP) em paralelo para causar o acúmulo de mitophagosomes. A diferença entre o número de mitophagosomes na linha de base e o número de mitophagosomes após o tratamento com EP pode indicar mitophagy. Estas limitações têm solicitado o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Tendo em conta a crescente relevância da mitophagy em um amplo espectro de doenças humanas, apresentamos várias técnicas de deteção de mitophagy robusta que podem ser útil para pesquisadores. Podemos cobrir técnicas tanto in vitro e in vivo e recomenda combinar várias técnicas para verificar alterações de mitophagy.

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Protocol

Animais (ratos machos e fêmeas) nascidos e criados em instalações animais credenciadas, em conformidade e aprovação do Comité de uso e cuidado do Animal de NIH. Métodos de eutanásia devem ser coerentes com todas as regulamentações nacionais e institucionais.

1. detecção de Mitophagy em células humanas

  1. Deteção de mitophagy usando mt-Keima do plasmídeo
    Nota: A proteína Keima, fundida a um sinal de mitocôndrias, simplificado como mt-Keima, revelou-se útil para em vivo deteção de mitophagy. MT-Keima é uma proteína fluorescente ratiometric sensíveis ao pH que apresenta fluorescência verde (excitação 458 nm) em condições básicas ou neutras e fluorescência vermelha (nm de excitação 561) em condições ácidas. Mitocôndrias saudáveis prosperam em condições básicas ou neutras (pH 7-8) e são indicadas por fluorescência verde quando transfected com mt-Keima. Quando mitocôndrias submeter-se mitophagy e se fundem com os lisossomos ácidos, o pH cai para 4,5 e mitocôndrias contendo mt-Keima apresentam fluorescência vermelha6,13,14. Importante, mt-Keima é resistente às proteases lisossomais, permitindo avaliação de mitophagy durante períodos mais longos. O protocolo abaixo é projetado para placas 6-boas.
    1. Dia 1: Use células humanas primárias (por exemplo, fibroblastos) ou imortalizadas células humanas (por exemplo, células células Hela ou U2OS). Semente aproximadamente 0.3-1 × 106 células/poço (dependendo da taxa de crescimento de célula para permitir que as células alcançar a confluência de 70% no dia seguinte) em uma placa de 6. Manter as células em meio de cultura celular completa (suplementado com 10% médio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco FBS e 1% misturaram solução de penicilina-estreptomicina) e incubá-los numa incubadora de cultura de célula a 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Adicione 1 mL meio de cultura de célula completa/poço em uma placa de 6.
      Nota: Gene nocaute/superexpressão ou drogas tratamentos podem ser feitos a este estágio6.
    2. Dia 2: Mix mt-Keima Plasmideo DNA6 e reagente de Transfeccao de DNA (a mistura para um poço de uma placa de 6).
      1. Dilua a 15 µ l de reagente de transfeccao um DNA com 150 µ l de meio livre de soro, de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Dilua o µ g de 2-5 mt-Keima do ADN do plasmídeo com 150 µ l de meio livre de soro.
      3. Adicionar plasmídeo diluídos mt-Keima ao reagente de Transfeccao de DNA diluído, vórtice para 10 s e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
        Nota: A otimização das condições de Transfeccao de DNA pode ser necessária dependendo do tamanho da placa (ver protocolos dos fabricantes para obter detalhes).
      4. Adicione a mistura de reagente de transfeccao/DNA gota a gota para células e, em seguida, agitar as placas suavemente durante 5-10 s até que a solução é completamente misturada.
    3. Dia 3: Altere os meios de comunicação, substituindo o meio de contendo reagente de Transfeccao de DNA com meio de cultura fresco célula completa (1 mL/poço).
    4. Dia 4: Imagem de células usando microscopia confocal6. Usar dois canais de imagem: canal verde (excitação 458 nm, emissão 695-570 nm) para visualizar as mitocôndrias normais e canal vermelho (excitação 561 nm, emissão 695-570 nm) para visualizar as mitocôndrias que estão passando por mitophagy. Aleatoriamente 20 áreas sob magnificação de x 40 para cobrir um total de 100-200 células em cada poço da imagem.
    5. Realizar análise de dados. Calcular o índice de"mitophagy" (percentual de mitocôndrias, passando por mitophagy), usando o software de análise de imagem para quantificar a quantidade de fluorescência em ambos os canais vermelho e verdes: tomar a relação da fluorescência fluorescência verde + vermelha, vermelha e Multiplique por 1006.
      Nota: Alternativas para transfeccao incluem o uso de linhas de célula HeLa mt-Keima expressado estàvel14. Uma vez que as células HeLa não expressam Parkin, Parkin deve ser expressos estàvel para estudar mitophagy Parkin-dependente nesta linha de celular.
  2. Deteção de mitophagy usando o colocalization entre o subunit da citocromo C oxidase II (COXII) e luz2
    Nota: COXII é uma proteína da membrana mitocondrial interna com genoma codificado. O índice de' mitophagy' é igual a relação de COXII colocalized com luz2, expressado como uma percentagem do montante total de COXII.
    1. Semente de células HeLa (ou outras células de interesse mencionado na etapa 1.1.1) em um slide de câmara 4-poço (1-5 × 104 células em meio de cultura de célula completa 1ml/poço) em uma célula cultura incubadora a 37 ° C (20% O2, 5% CO2) durante a noite.
    2. Adicione 3,0 µ l de carbonila 10mm cianeto - 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP) e incube a incubadora de cultura celular (passo 1.2.1) para 3h.
      Nota: Outras drogas que afetam o mitophagy podem ser usadas.
    3. Remover o meio de cultura usando uma pipeta de 1 mL, lavar as células duas vezes com 1 mL/bem de frio (0-4 ° C) 1X PBS. Deixe a solução descansar por 10-30 s antes da próxima lavagem. Em seguida adicione paraformaldeído de 3,7% de 0,5 mL (PFA) em 1X PBS a cada poço e incubar durante 10 min no gelo para consertar as células.
      Cuidado: PFA é toxina. Trabalho em uma coifa quando usando PFA.
    4. Descartar a solução PFA usando uma pipeta de 1 mL, lavar as células duas vezes com frio 1 X PBS (1 mL/poço; deixar solução para 10 s antes da próxima lavagem) e permeabilize as células com 1ml/bem de 0,25% de detergente (em 1X PBS) por 10 min no gelo.
    5. Descartar o buffer de permeabilizing, lave suavemente as células duas vezes com frio 1X PBS e descarte (Deixe a solução descansar por 10 s entre lavagens). Bloquear as células com 1ml/bem de 5% FBS em 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Cobrir as câmaras para evitar a perda de umidade.
    6. Preparar 0,5 mL/bem de uma solução de anticorpo misturado com anticorpo COXII (mouse, diluição de 1: 250) e anticorpo luz2 (coelho, diluição 01:20-01:50) em PBS 1x com 5% FBS e loja no gelo para 0,5-1 h.
    7. Pegue o slide 4-bem câmara do quarto frio e descartar a solução de bloqueio com uma pipeta de 1 mL. Lave delicadamente as células duas vezes com 1 mL/bem de frio 1X PBS e descarte (Deixe a solução descansar por 10 s entre lavagens), em seguida, adicionar 0,5 mL/bem de solução anticorpo misto. Incube a 37 ° C por 1h em uma coqueteleira com velocidade baixa.
    8. Descartar a primeira solução de anticorpo, utilizando uma pipeta de 1ml e delicadamente lavar as células três vezes com 1ml/bem de frio 1X PBS e descarte. Deixe a solução senta-se para 10 s antes da próxima lavagem. Adicionar 1 mL/poço de fluorescentes anticorpos secundários (por exemplo, cabra anticoelho com nm de comprimento de onda 568 de proteína fluorescente vermelha (RFP) para luz2; e anti-rato cabra com comprimento de onda 488 nm da proteína verde fluorescente (GFP) para COXII) na diluição de 1: 250 com 5% FBS em 1X PBS. Cobrir o slide de câmara 4-bem com papel alumínio e incubar a 37 ° C por 1h em uma coqueteleira com velocidade baixa.
    9. Descarte a segunda solução de anticorpo com uma pipeta de 1 mL. Lave delicadamente as células seis vezes com 1ml/bem de frio 1X PBS. Deixe a solução descansar por 1 minuto antes da próxima lavagem.
    10. Monte as células com 50 µ l/poço de meio de montagem antidesgaste com DAPI e adicionar lamínulas.
    11. As células sob um microscópio confocal com 66 x ampliação e imersão óleo de imagem (telha varreduras / mosaicos podem ser usados para aumentar o número de células, fotografada pelo software). Use as mesmas configurações como o tempo de exposição do canal, ganho digital, offset digital, etc. ao longo de toda imagem processos (ver instruções de software para obter detalhes)15.
    12. Software de análise de colocalization de uso para analisar quantitativamente pelo menos 20 imagens aleatórias de 100 células15. Use a função "Bezier fechado" para selecionar células individuais inteiras. Compare do colocalization de Pearson de GFP de RFP, ponderada ou giram, para determinar os níveis de mitophagy em células analisadas. Manter valores para mira horizontal e vertical de software de análise o colocalization em toda a análise. Para definir com precisão esses mira, preparar dois conjuntos extras de células e rotular um COXII e o outro luz2. Em seguida, defina a mira diretamente acima da distribuição de pixel para cada canal15 (ver instruções de software para obter detalhes).
  3. Um alto throughput de medição para a seleção de mitophagy de imagem
    Nota: Executar telas de alta taxa de transferência de compostos mitophagy de indução ou inibição mitophagy de grandes bibliotecas de compostos é tecnicamente exigente. Uma técnica de imagem baseada no colocalization de mitocôndrias com autophagosomes é uma alternativa mais simples, mas altamente sensível para mitophagy16de triagem.
    1. Dia 1: Semente de células (por exemplo, fibroblastos humanos primários, 5.000 células/100 mL célula meios de cultura/poço) em uma placa de 96 poços (consulte a etapa 1.1.1).
    2. Dia 2: Tratar as células a partir do segundo dia com FCCP ou outros compostos de interesse para o tempo de incubação designado (ver passo 1.2.2).
    3. Siga os passos 1.2.2-1.2.9 usando os anticorpos primários para COXII (mouse, diluição de 1: 250 com 5% FBS em 1X PBS) e LC3B (coelho, 1: 100-diluição de 1: 200 com 5% FBS em 1X PBS). Alternativamente, os anticorpos primários para COXII e luz2 podem ser usados.
    4. As células usando um leitor fluorescente16da imagem. Recolha imagens em campos colocados aleatoriamente e com um mínimo 500 células/poço.
    5. Analise os dados usando um analisador personalizado célula protocolo n º16.

2. detecção de Mitophagy em c. elegans

Nota: O nemátodo c. elegans fornece uma plataforma para ensaio mitophagy no nível de organismos. Duas linhagens podem ser usadas para monitorar mitophagy: (1) as mitocôndrias-alvo Rosella (mtRosella) ou mitophagy (2) receptor DCT-1 fundido com GFP juntamente com marcador autophagosomal IgG-1 fundido com Discosoma SP. proteína fluorescente vermelha (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy monitoramento usando Rosella biosensor
    Nota: Rosella é um biossensor molecular que combina uma diferenciação de pH DsRed fundida a uma variante GFP sensíveis ao pH. O biosensor Rosella aproveita as diferenças de pH entre a lisossoma ácida (pH ~ 4,5) e outros compartimentos celulares. Este biosensor tem sido usado para monitorar com sucesso mitophagy em Saccharomyces cerevisiae e várias linhas de células de mamíferos, tais como HeLa, HEK293 e HCT11618,19. Nós adaptado a este repórter dual-fluorescente versátil e gerado transgénicos c. elegans nematoides expressando mitocôndrias-alvo Rosella (mtRosella) em células de músculo do corpo-parede. Mitophagy indução é indicada por uma reduzida proporção GFP/DsRed de fluorescência mtRosella.
    1. Dia 1: Escolha L4 larvas de vermes expressando mitocôndrias-alvo Rosella (mtRosella) em células de músculo de corpo-parede em uma placa de mídia de crescimento de nematódeo (NGM) inoculado com Escherichia coli (OP50) usando um microscópio de dissecação5. Coloque 10-20 vermes/placa em pelo menos três pratos de 3,5 cm. Incube os nematoides à temperatura de 20 ° C5padrão.
      Nota: Consulte a referência para a anatomia do worm, incluindo identificação de larvas de L420e a maneira de fazer uma escolha que é usada para transferir vermes de um local para outro21.
    2. Dia 5: Sincronizar nematoides selecionando 15-20 L4 transgénicas larvas e transferi-los para fresco OP50 semeado placa NGM. Use pelo menos cinco placas por condição experimental.
    3. Dia 7: Prepare placas de veículos por drogas que afetam o mitophagy de interesse ou controlos positivos.
      1. Mate as bactérias Escherichia coli (OP50) semeadas, expondo placas NGM por 15 min com 222 µW/cm2 (intensidade) da luz UV para garantir que mitophagy de indução compostos não são metabolizados por bactérias. As placas devem ser expostas com 2.000 J/m2.
        Nota: Segundos de exposição necessária = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Adicione compound(s) de interesse para o topo das placas NGM semeados. Adicione uma quantidade equivalente de compostos veículo (solvente utilizado para dissolver compostos, tais como dimetilsulfóxido (DMSO)) para as placas do veículo como controlo negativo. Para o controlo positivo de indução de mitophagy, uma toxicidade mitocondrial, o paraquat (concentração final de 8 mM) foi usado. Adicione uma solução contendo 10 µ l de 8 M estoque de paraquat com 190 µ l de DDQ2O na parte superior da placa de ágar para o grupo de tratamento. Para o grupo de veículo, adicione uma solução contendo 10 µ l de DMSO com 190 µ l de DDQ2O na parte superior da placa de ágar.
        Nota: A solução de trabalho-o paraquat pode ser mantida durante 1 mês a 4 ° C.
      3. Agite suavemente as placas até o medicamento ou veículo reveste toda a superfície. Permitir que as placas secar com as tampas fechadas à temperatura ambiente pelo menos 1h antes de transferir os vermes.
        Nota: Placas de drogas também podem ser preparadas pela adição de drogas em NGM o líquido antes que ela se solidifica.
    4. Dia 7: Transferi 10-20 de 2 dias de idade adultos animais transgénicos preparados na etapa 2.1.2 para placas contendo ou o paraquat, compound(s) de interesse, ou veículo (DMSO). Incube os animais transgénicos a 20 ° C durante 2 dias.
    5. Dia 9: Prepare as almofadas de agarose 2% (ver Material complementar). Em seguida, adicione uma gota (10 µ l) de 20mm levamisole na M9 por pad. Imobilize os animais transgénicos para a imagem latente, colocando-os no drop-M9-levamisole. Coloque delicadamente uma lamela em cima.
    6. Capture animais transgénicos único usando uma câmera acoplada a um microscópio de epifluorescência. Adquira imagens fluorescentes de nemátodos toda transgênicas expressando mtRosella em células musculares de corpo-parede de ampliação 10 X5. Salve as imagens coletadas.
    7. Processe as imagens adquiridas com software ImageJ. Analise as células de músculo de parede corporal localizadas na cabeça do verme para evitar autofluorescência no tecido intestinal. Medir a área média pixels de intensidade total e valor para cada imagem fluorescente somente da região da cabeça de cada animal. Para analisar a área específica de interesse:
      1. Selecione 'dividir o canal' sob o menu drop-down 'imagem' e 'cor' para converter imagens.
      2. Utilize a ferramenta 'seleção à mão livre' para capturar a área fluorescente de interesse.
      3. Selecione o comando de 'medida' sob o menu drop-down 'analisar' e executar análise de intensidade do pixel.
      4. Intensidade do pixel deve ser normalizada, dividindo a intensidade pela área total analisada. Após a normalização, calcule a GFP a DsRed relação22.
    8. Usar a análise estatística, software para qualquer conduta estudante t-teste (comparação entre os dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para a análise estatística com p < 0,05 como significativo5,17 .
  2. Avaliar mitophagy usando co localização entre DCT-1 e IgG-1
    Nota: DCT-1 é uma proteína de membrana mitocondrial externa que atua como um receptor de mitophagy em resposta ao estresse condições, semelhantes ao seu putativo orthologues BNIP3 e BNIP3L/NIX em mamíferos5. Assim, mitophagy iniciação é avaliada pela localização co entre DCT-1 mitophagy do receptor e autophagosomal da membrana LGG-1 (homólogo dos mamíferos LC3).
    1. Dia 1: Pick L4 larvas de animais transgénicos, expressando tanto DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em corpo-parede muscular células5 para um OP50 semearam placa NGM. Coloque a placa de 5-10 minhocas/3.5 cm e use pelo menos três pratos. Incubar os nematódeos a 20 ° C.
      Nota: Os transgenes estão localizadas em plasmídeos separados e não estão integrados no genoma. Buscar nematoides carregando tanto rol-6(su1006) e pmyo-2 marcadores de contransformation GFP. Apenas vermes transgênicos com ambos os marcadores contransformation expressam tanto DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em células musculares de corpo-parede.
    2. Siga os passos de 2.1.2-2.1.5.
    3. Células de músculo do corpo-parede simples imagem usando uma câmera acoplada a um microscópio confocal5,23. Detectar as bordas das células de músculo de corpo inteiro-parede e tome z-pilha imagens abaixo dos 63 ampliação de x. Maior ampliação também pode ser usada.
    4. Abrir e processar imagens adquiridas com o software confocal. Iniciação de mitophagy é indicada pela localização co do receptor para o marcador de autophagosomal (DsRed::LGG-1) mitophagy (DCT-1::GFP). Manualmente medir eventos localização co em cada pilha de corpo-parede muscular célula5. É essencial para manter todas as configurações de microscópio e câmera (lente e lupa, filtros, tempo de exposição, resolução, a intensidade do laser, ganho, etc.) consistente ao longo de experiências. Devem notar-se todas as configurações.
    5. Usar a análise estatística, software para qualquer conduta estudante t-teste (comparação entre os dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para a análise estatística com p < 0,05 como significativo5,17 . Para comparações bidirecionais de uso do aluno t-teste (p < 0,05 é considerado significativo). Para comparações múltiplas, usar a análise de variância de fator único (ANOVA), corrigida pelo teste post hoc de Bonferroni. Recomendamos analisar pelo menos 50-70 animais ou células de músculo de corpo-parede de 30-50 para cada condição experimental. Repita a experiência pelo menos três vezes.

3. detecção de Mitophagy em ratos

Nota: Métodos anteriores para detectar mitophagy em ratos foram pesados, insensível e difícil de quantificar. Um modelo de mouse transgênicas expressando a forma mitocondrial-alvo do repórter fluorescente Keima (mt-Keima) agora pode ser utilizado para avaliar os níveis de mitophagy em uma ampla gama de condições fisiológicas e fisiopatológicas.

  1. Eutanásia em ratos usando um protocolo aprovado pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização14.
  2. Prenda o mouse (lado ventral para cima), para a plataforma de trabalho usando pinos nos membros. Fazer uma incisão no abdômen inferior usando uma tesoura de microcirurgia e fórceps para expor o fígado24. Corte um pedaço de fígado (por exemplo, um pedaço de lobo direito em 1 × 1 × 1 cm) usando uma tesoura de microcirurgia e fórceps.
    Nota: A detecção de mitophagy em ratos é complicada e exige conhecimento sobre anatomia de rato e rato altamente hábil manipulação e cirurgia de rato. Este protocolo fornece etapas básicas, chaves sobre esse método, e um método mais detalhado está disponível24.
  3. Coloque a amostra de fígado em uma placa de metal no gelo para esfriar rapidamente o tecido. Mantenha o tecido na placa de metal fria e processar o mais rápido possível. Idealmente, use dentro de 1h de dissecação.
  4. Levante a amostra de fígado usando fórceps curvo e enxágue com 5 mL de PBS 1x gelada.
  5. Transferi o fígado para uma placa de Petri (Ø 100 mm) no gelo usando o fim de colher de uma espátula.
  6. Seções de corte a amostra de fígado à mão em 0,5-1 mm espessura usando lâminas de borda única.
  7. Transferi com cuidado as secções de tecido para um prato fundo de vidro usando fórceps de microcirurgia.
  8. Defina cuidadosamente a seção de fígado com fórceps para achatar na parte inferior.
  9. Cobrir o fígado em fatias com 3-5 gotas de frio 1X PBS.
    Nota: DAPI coloração é recomendado para identificar a região de interesse em determinados tecidos (por exemplo, cérebro)24. Para validar a localização co do sinal vermelho mt-Keima com o lisossoma, corantes lisossomais, tais como o dextran cascata azul e lysosensor, podem ser usado24.
  10. As seções de tecido sob microscopia confocal através de de duas excitações sequencial24da imagem. Conjunto de dois canais de imagem: "verde" canal mt-Keima (excitação 458 nm, emissão 695-570 nm gama) e "vermelho" mt-Keima (excitação 561 nm, emissão 695-570 nm gama). Manter as configurações de imagem entre condições experimentais. Para tratamento de imagens mais eficiente, analise dois animais de uma só vez.

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Representative Results

Deteção de Mitophagy em células humanas:

Usando o procedimento aqui apresentado, as células HeLa humanas foram transfected com mt-Keima do plasmídeo. Células saudáveis demonstraram uma bem organizada rede mitocondrial (GFP, 488 nm) com alguns casos de mitophagy (RFP, 561 nm). No entanto, as células pré-tratados com um desacoplador mitocondrial Compararia (30 µM para 3h) exibiu um profundo aumento na incidência de mitophagy (figura 1A). Mitophagy também foi medido usando a localização co entre luz2 e COXII (figura 1B).

Deteção de Mitophagy em C. Elegans

Nós examinamos o músculo do corpo-parede células de nemátodos transgênicas expressando DsRed fundido com IgG-1 e mtRosella ou DCT-1 fundidas com GFP sob condições normais e mitophagy de indução como estresse oxidativo. Animais transgénicos foram expostos ao paraquat (8 mM para 2 dias). Mitophagy indução é indicada pela diminuição da GFP/DsRed relação de mtRosella de fluorescência (Figura 2A). Além disso, o elevado número de eventos co localização entre DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 sinais significa mitophagy estimulação em resposta ao estresse oxidativo (Figura 2B).

Deteção de Mitophagy usando os mt-Keima ratos:

Análise de mitophagy na vivo de imagem fornece insights sobre mitophagy em condições normais e fisiopatológicas. Usando o protocolo descrito acima, a ocorrência de mitophagy em tecidos de diferentes órgãos, como fígado e cerebelo (Figura 3), pode ser visualizada com mitophagy confocal.

Figure 1
Figura 1. Diferentes métodos para avaliar a mitophagy em células humanas. (A) humano HeLa células foram transfected com mt-Keima plasmídeo por três dias, seguido de imagem em ambos 488 nm e 561 nm. Como um controle positivo, ceflls foram tratados com FCCP (30 µM) 3 h, antes de imagem. (B) imagens de fibroblastos humanos primários manchada de luz2 (RFP) e COXII (GFP). (C) imagens de fibroblastos humanos corados com anti-TOM20 (vermelho) e anticorpos anti-LC3 (verde). As barras à direita mostram a leitura de mitocôndrias co localizando com autophagosomes. Localização de co é aumentada pelo estresse energético (mídia livre de glicose galactose) e a adição de inibidores dos lisossomos E64d e Pepstatin A (EP) para barras de escala representativas de 24 h. para o (A), (B) e (C) são etiquetados no último Figura de cada painel, de forma independente. Dados quantitativos são mostrados em média ± no MEV mostrou * * *p < 0,001; t-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Na vivo deteção de mitophagy em c. elegans. (A) nematoides transgênicas expressando mtRosella em células de músculo do corpo-parede foram tratadas com paraquat de 8 mM. Mitophagy estimulação é representada pela diminuição da relação entre GFP sensíveis ao pH para diferenciação de pH DsRed (n = 50; * * *p < 0,001; t-teste). Pontas de seta apontam autofluorescência intestinal. Barras de escala denotam 20 µm. detalhes de aquisição: tempo de exposição, 200 ms; Contraste, médio. Imagens foram adquiridas utilizando um 10 X da lente objetiva. Dados quantitativos são mostrados em média ± no MEV mostrou valores. (B) nematoides transgênicas expressando co mitophagy receptor que DCT-1 fundido com GFP juntamente com a proteína autophagosomal que IgG-1 fundido com DsRed em células musculares de corpo-parede foram expostos ao paraquat de 8 mM. Mitophagy indução é representada pela localização co de GFP e DsRed sinais (para cada grupo de imagens DCT-1 é mostrado em verde no topo, autophagosomes em vermelho abaixo e uma imagem mesclada no fundo; n = 30; * * *p < 0,001; t-teste). Barras de venda denotam 20 µm. detalhes de aquisição: resolução, 1.024 X 1.024; Ganho de mestre, Track1: 562 e Track2: 730; Filtros de emissão, Track1 Channel1: 639 nm e Track2 Channel2: 519 nm; Intensidade, Track1 a laser (543 nm): 12,9% e Track2 (488 nm): 39,4%. Imagens foram adquiridas utilizando uma lente de objetiva X 40. Dados quantitativos são mostrados em média ± no MEV mostrou clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Na vivo deteção de mitophagy em ratos transgénicos mt-Keima. Imagens representativas de sinais mt-Keima no fígado (superior) e área de cerebelo (incluindo células de Purkinje, painel inferior) de um rato de mt-Keima (458 nm, verde; 561 nm, vermelho). Barra de escala denota 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Medição de mitophagy é tecnicamente exigente. Aqui, apresentamos várias técnicas robustas que permitem ambos detecção qualitativa de mitophagy e quantificação dos níveis de mitophagy nos modelos experimentais de laboratório mais comuns.

Para adquirir dados replicáveis, um projeto experimental com pelo menos três repetições biológicas é necessário. Todos os pesquisadores envolvidos em experimentação e análise devem ficar cego para identidades de grupo experimental. Além disso, campos de imagem deve ser escolhido aleatoriamente durante a aquisição de imagens. Para cultura de células e estudos de c. elegans , devem ser realizadas pelo menos três repetições biológicas. Para estudos de rato mt-Keima, é recomendável usar um número suficiente de ratos para alcançar significância estatística. Para células de mamíferos, analisar 30-100 células para cada experimento e executar pelo menos 3 diferentes experiências. Controle de qualidade nestas etapas permite que resultados replicáveis. Deteção de mitophagy no fermento foi recentemente resumiu em outro lugar25.

Existem várias etapas críticas das técnicas de deteção de mitophagy em vitro . Eficiência de transfeccao, que depende da qualidade dos reagentes e o DNA usado, é vital durante a transfeccao da proteína mt-Keima. Assim, a otimização da eficiência do transfection em condições diferentes (por exemplo, usando linhas celulares diferentes) é necessária. Para o método de luz2/COXII, especificidade do anticorpo e dobra de diluição do anticorpo primário afetam a qualidade das imagens e devem ser testados antes de iniciar os experimentos. O mesmo se aplica ao método de imagem de alto teor, onde a qualidade de anticorpos e de diluição são cruciais. O sistema de microscopia automatizada e o protocolo de análise personalizada permite a geração de imagens e análise de pelo menos 1.500 células/condição, o que torna os resultados extremamente robustos, em comparação com outras na vivo baseado em métodos de imagem. Além disso, o protocolo de análise fornece dados sobre mais mitocondriais parâmetros como comprimento e total de área em uma base de célula por célula, que é altamente útil na investigação de mitophagy.

Em alguns casos, não se recomenda a ensaiar o colocalization de luz2 com proteínas da membrana mitocondrial externa, como TOMM20. A fase inicial de mitophagy envolve ubiquitination Parkin-mediada das proteínas de membrana mitocondrial externa, incluindo TOMM20 e Mitofusin 1 (MFN1). Pereira Barbosa conjuga vários vínculos de cadeia ubiquitin diferentes sobre essas proteínas incluindo cadeias de ubiquitina K48-lig, que promovem a degradação da proteína pela Proteassoma 26S. Portanto, estas proteínas da membrana mitocondrial externa ubiquitinated ainda podem ser degradadas, apesar de mitophagy bloqueados6. Isto pode distorcer os dados, resultando em falsos positivos na interpretação geral dos dados. Além disso, a eliminação do DNA mitocondrial (mtDNA nucleoids) é um segundo indicador de mitophagy, e pode ser quantificado por imunofluorescência usando um de anticorpos anti-ADN6.

Alguns passos críticos para monitoramento na vivo mitophagy em c. elegans estão listados abaixo:

1. transferência de animais transgénicos para novas placas que cada 24 – 48 h é recomendável evitar a consequência natural de progênie, o que leva a uma população mista ou fome, o que por si só pode provocar mitophagy. Portanto, não de fome nematoides devem ser usadas.

2. levamisol é um anestésico suave que é usado para imobilizar a nematoides. Evite anestésicos que possam afetar a atividade mitocondrial, tais como azida de sódio. Azida de sódio bloqueia componentes da cadeia respiratória mitocondrial e perturba a geração de energia, levando ao estresse oxidativo e mitocondrial. Assim, a azida de sódio é susceptível de provocar mitophagy.

3. as amostras não deverá estar a secar durante o exame microscópico. Portanto, recomenda-se o uso de M9 buffer em vez de água, para garantir condições favoráveis osmóticos.

4. intestinal autofluorescência aumenta com a idade em c. elegans. Assim, células de músculo do corpo-parede perto do intestino devem ser evitadas durante o exame microscópico.

5. se o paraquat não induzir mitophagy: r. aumentar o tempo de exposição o paraquat sobre vermes, b. aumento de concentração de paraquat, ou c. preparar uma solução de trabalho fresco do paraquat desde sua eficiência diminui ao longo do tempo.

6. se aumentou para incubação informante é observada em vermes expostos ao paraquat, também: r. reduzir o período de tratamento o paraquat, b. reduzir a concentração de paraquat, c. placas de suplemento com fluorodeoxyuridine (FUdR) (final concentração de 100-400 μM), um inibidor da síntese de DNA que impede a eclosão do ovo, ou d. realizar o experimento em worms mais velhos (por exemplo, worms 4 dias de idade).

Este procedimento descreve as etapas para imagem mitophagy no fígado usando os mt-Keima ratos transgênicos, como mostrado na Figura 3. Tecidos e não o cérebro e o fígado foram analisados usando o sistema de mt-Keima14. Imagem de relação Dual-excitação nos tecidos do fígado é obtida através de duas excitações sequenciais. Todas as imagens devem ser obtidas recém extraídos órgãos. Tecidos examinados devem ser mantidos frio e processadas mais rapidamente possível. Fatias de fígado podem ser obtidas em qualquer idade. Quando mitophagy de imagem, otimize tempos de poderes e exposição do laser para cada órgão durante a análise microscópica. Poder do laser deve ser definido na saída mais baixa que permite a visualização clara do mt-Keima sinal14. No entanto, existem algumas limitações para os mt-Keima de ratos transgênicos. Devido à instabilidade do Keima, bem como a perda de um gradiente de pH através da membrana dos lisossomos sob fixação, este modelo de rato não é adequado para cryo-seccionamento e imuno-histoquímica. Outra limitação é que mt-Keima, ou agregados de matriz desta proteína, podem afetar funções celulares ou mitocondriais desconhecidas, mesmo que isso não muda de taxa de consumo de oxigênio mitocondrial14. Além disso, o tempo e o custo associado com ratos mt-Keima torná-lo menos desejável para análise do elevado-throughput do que a cultura de pilha acima mencionados e métodos de c. elegans . Os métodos mencionados aqui, além de outras maneiras de estudar quantitativamente mitophagy em camundongos mt-Keima incluem borrão ocidental ou FACS. Notar que, além do mt-Keima ratos transgênicos, há um outro modelo de rato mitophagy, o "mito-QC", um modelo de rato geneticamente modificado com um pH sensíveis fluorescente mitocondrial sinal26. Devido à complexidade e dinâmica da mitophagy, recomendamos que combina os métodos de fluorescência acima com outros métodos de detecção de mitophagy comuns, tais como a microscopia eletrônica e mancha, para reforçar as conclusões ocidental.

O desenvolvimento de novas técnicas de detecção de mitophagy, tais como aqueles mencionados aqui terá aplicações amplas, de estudos mecanicistas de mitophagy para telas de drogas de alto rendimento. Note-se que mitophagy é facilmente afetado por flutuações endógenas e exógenas (por exemplo, condições de cultura celular, tais como densidade celular, fome, hipóxia, etc.) 1 , 5 , 8. por conseguinte, é fundamental que as mesmas condições experimentais são mantidas para todos os experimentos. É importante usar uma combinação de métodos de deteção de mitophagy diferentes em estudos tanto in vitro e in vivo para verificar a correta interpretação do status mitophagy. Ainda mais a compreensão dos mecanismos de mitophagy, obtidas através de técnicas mencionadas neste documento, permitirá o desenvolvimento de novos e mais precisos métodos de detecção de mitophagy.

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Disclosures

O laboratório de Bohr tem arranjos de CRADA com ChromaDex e GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Podemos agradecer ao Dr. Atsushi Miyawaki e Dr. Richard J. Youle o plasmídeo mt-Keima e mt-Keima integrado as células Hela. Agradecemos a Raghavendra A. Shamanna e Dr. Deborah L. Croteau para a leitura crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa Intramural de NIH (VAB), o Instituto Nacional sobre envelhecimento, bem como um 2014-2015 e 2016-2017 NIA intralaboratório concedem (FEP, VAB). FEP foi apoiado por HELSE SOR-OST RHF (projeto n: 2017056) e o Conselho de pesquisa da Noruega (projeto n: 262175).

CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR:

FEP projetado o manuscrito e elaborou o projecto; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH e ED escreveram seções diferentes do papel; NT, JP, HN e VAB revisto o manuscrito e fornecido a perícia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar		 #CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

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References

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Medicina edição 129 Mitophagy envelhecimento c. elegans rato autofagia rosella doença de Alzheimer doença de Parkinson longevidade
<em>In Vitro</em> e <em>In Vivo</em> de deteção de Mitophagy em células humanas,<em> C. Elegans</em>e os ratos
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Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

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