Summary
糖タンパク質の生化学的および構造解析では、均質な試料の比較的大量を必要とします。反応システイン チオール化合物をターゲットに細菌から精製組換えタンパク質の部位特異的糖鎖の効率的な化学的方法を紹介します。
Abstract
間質相互作用分子 1 (STIM1) は型-私膜貫通型タンパク質は、小胞体 (ER) と膜 (PM) に位置しています。小胞体 STIM1 プリンシパル Ca2 +シグナリング プロセスです免疫反応を駆動する作動させたカルシウム (Ca2 +) のエントリを格納として知られているプロセスの午後 Orai1 チャネルの活性を調節します。STIM1 は、ドメイン内で Ca2 +センサー分子の 2 つの内腔 Asn サイトで翻訳後修飾N- グリコシル化反応を受けます。しかし、生化学、生物物理、 Nグリコ STIM1 の構造生物学的効果が同種のN- 糖タンパク質の高レベルが容易に取得できないのため最近までよくわかっていないと。ここでは、特定の蛋白質サイト該当するタンパク質の構造と機構の糖鎖の根本的な効果を理解するために糖鎖のついた体外化学アプローチの実装について述べる.ソリューションの核磁気共鳴分光法を用いた単一サンプルのブドウ糖添付ファイルの構造の結果だけでなく、変更の両方の効率を評価する.このアプローチは、自然は、無数の糖蛋白質を研究する容易に適合できます。
Introduction
運営のカルシウム (Ca2 +) を格納エントリ (SOCE) が主要な経路で、免疫細胞は、細胞質への細胞外スペースから Ca2 +を取る。T リンパ球の細胞膜 (PM) に位置する T 細胞受容体は抗原蛋白質のチロシンのキナーゼ ( 1,2,3見直し) を有効にするをバインドします。リン酸化カスケード ホスホリパーゼ-γ (PLCγ) その後ジアシルグリセ ロールとイノシトール 1,4,5-三リン酸 (IP3 にホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) 膜の加水分解反応を媒介するの活性化につながる).IP3は、IP3受容体に結合 (IP3R) 小胞体 (ER) にこの受容体チャネルを開くし、Ca2 +を許可に流れる小胞体から濃度勾配を小さな拡散性メッセン ジャー(文献4) 細胞質へルーメン。受容体 G タンパク共役型とさまざまな他の興奮性および非興奮性細胞型鉛の受容体型チロシンキナーゼから IP3の同じ生産し IP3Rs の活性化。
有限 Ca2 +の容量 ER、IP3のため-仲介されたリリースと細胞内 Ca2 +の増加は遷移的です。ただし、この枯渇、小胞体内腔 Ca2 +深く間質相互作用分子 1 (STIM1) 型の効果-私は膜貫通 (TM) タンパク質は小胞体膜5,6,7主発見します。STIM1 にはルーメン指向 Ca2 +センサー ドメイン EF 手ペアと滅菌 α-モチーフ (EFSAM) が含まれています。(文献8) 単一の TM ドメインで EFSAM から 3 つのゾル性細胞質指向コイルド コイル ドメインが分かれています。小胞体内腔 Ca2 +枯渇、時に、EFSAM は TM とコイルド コイル ドメイン10の構造語順換えを引き起こす不安定化共役重合7,9を経る。これらの構造変化の ER PM 接合11,12,13,14 PM イノシトールリン脂質15,との対話を通じて STIM1 のトラップで絶頂に達する16と Orai1 サブユニット17,18。Orai1 タンパクは、フォーム Ca2 +チャンネル19,の20,21,22にアセンブルする PM サブユニットです。ER PM 接合で STIM1 Orai1 の相互作用を容易にする、開いて Ca2 +活性化リリース Ca2 + (クラック) チャネルの構造から高濃度の細胞質への Ca2 +の動きを可能にする、細胞外スペース。免疫細胞の CRAC チャネルを介して持続的なゾル性細胞質の Ca2 +標高は、Ca2 +-カルモデュリン/カルシニューリン依存の脱燐酸化活性化 T 細胞の核に入るその後核因子を誘導してT 細胞活性化1,3を促進する遺伝子の転写調節を開始します。STIM1 23,24アゴニストによる小胞体内腔 Ca2 +の枯渇を経由して結果持続的な細胞内 Ca2 +上昇 CRAC チャネル活性化のプロセスは、SOCE 25総称して呼びます。SOCE T 細胞の重要な役割は、STIM1 の Orai1 変異が重症複合免疫不全症候群3,19,26,を引き起こす可能性を示す研究によって明白である27です EFSAM は最終的に自己会合の不安定化結合7,につながる、正規の EF ハンドで Ca2 +調整の損失を介して小胞体内腔 Ca2 +枯渇を検出後 SOCE を開始。28,29。
グリコシル化反応、キャラクタリゼーションとオリゴ糖構造、小胞体とゴルジ体 ( 30,32,33見直し) の様々 な生合成手順をとして知られている糖鎖の処理です。真核生物における糖鎖の 2 つの支配的なタイプがある: N-リンクとO-リンクすると、特定のアミノ酸とリンケージをブリッジ原子によって。糖鎖、糖鎖を asn、側鎖のアミドに添付し、ほとんどのケースで開始ステップが ER で発生したポリペプチド鎖にルーメン34に移動します。糖鎖の最初のステップはから成っている (Glc) グルコース、マンノース (男) とn-アセチルグルコサミン (GlcNAc) (すなわち Glc3男9GlcNAc2)ER から 14 砂糖コア構造の転送酵素35,36による膜脂質。胸の谷間やグルコース残基の転送など、これ以降の手順は、小胞体の特定のグリコシダーゼと糖転移酵素によって触媒されます。いくつかのタンパク質は小胞体とゴルジ装置に移動は加工37をさらにすることができます。O糖鎖は通常 Ser または Thr の残基の側鎖水酸基に、糖鎖の付加、ゴルジ複合体33,34完全にこの変更が発生します。ガラクトース、フコース、 n-アセチルグルコサミン作ることができるいくつかのO型糖鎖構造があり、各単糖とシアル酸は33を順次追加。
一般的なコンセンサス配列をNに関連付けられている多くの種類O糖鎖修飾のための前提条件として特定の順序が特定されていない中-リンク修正: Asn-X-Ser/木/システインは、X が任意のアミノ酸をすることができます除いてプロ33。STIM1 EFSAM にはコンセンサスN- 糖鎖がこれらの 2 つが含まれています: Asn131-Trp132-Thr133 と Asn171-Thr172-Thr173。確かに、以前の研究では、EFSAM が Asn131、Asn171 38,39,40,41哺乳類細胞における糖鎖のNをすることができますを示しています。しかし、SOCE に糖鎖の結果の前の研究が一致されている、抑制を示唆増強または SOCE 活性化38,のこの翻訳後修飾による影響なし「外部参照」を = > 39,40,41。したがって、EFSAM N糖鎖の基になる生物物理・生化学・構造の影響に関する研究は、この変更の規制の影響を理解することが重要です。これらの in vitro実験の均質な蛋白質の高レベルの要件のため EFSAM に共有結合糖鎖を付けるサイト選択的なアプローチが適用されました。興味深いことに、Asn131 と Asn171 の糖鎖 EFSAM コア内で収束し、STIM1 を介した SOCE 42を促進する生物物理特性を高める構造の変化の原因。
糖グループのシステインのチオール基の化学添付ファイルはまずタンパク質関数43グリコシル化反応のサイト固有の効果を理解するこの酵素無料アプローチの有用性を示した種子の仕事によって確立されています。,44。 最近、STIM1 に関して Asn131 と Asn171 残基がシステインに変異したと共有無料チオール42にグルコースをリンクする glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] が使用されました。ここでは、突然変異誘発を使用して、サイトの変更、特定のシステイン残基を組み込むだけでなく、急速に変更の効率化と構造の両方を評価するためにソリューションの核磁気共鳴 (NMR) 分光法もこのアプローチについて述べる糖付加の結果として摂動。特に、この一般的な方法は、簡単にどちらかのO- の効果を研究に適応またはいずれかのN-グリコシル recombinantly 蛋白質を生産します。
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Protocol
1 ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)-システインの細菌ペット-28 a の発現ベクターへの取り込みのサイト指示された突然変異誘発を介した。
。- 260 0.020 インチ (μ g/mL) cm -1 の紫外線 (UV) 吸光係数を使用してペット-28 a ベクトル (すなわち二重鎖 DNA) の濃度を決定する nm 。
- 合成の各の Cys 変異補完 mutagenic プライマーのペア 私) 一塁のミスマッチや 15 ヌクレオチド後テンプレートを補完する前にテンプレートを補完するもの 15 ヌクレオチドの最小値がある、最終的な基本の不一致、ii) の合計プライマー長さが 45 のヌクレオチドおよび iii を超えない) 各プライマー (表 1) の最初と最後のヌクレオチドの位置に、グアニン、シトシンあります。0.025 μmol スケールとカートリッジ精製を使用してプライマー合成を実行ことを確認します 。
- 高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用して 2 つの 20 μ L の PCR 反応混合物を設定: 前方のプライマーと 2 番目の 1 つを含む逆プライマーを含みます。1.5 mM MgCl 2、0.2 mM dNTPs、0.5 μ M のプライマー、0.4 μ DMSO、1 x PCR バッファーの最終濃度が含まれてそれぞれの混合物を準備 1.25 ng/μ L のテンプレート DNA、0.02 U/μ L 高忠実度 DNA ポリメラーゼ 。
- 熱サイクルの 3 つのステップのプロトコルを使用して別の混合物: 98 ° C、30 秒 (変性)、53-56 ° C、30 s (焼鈍) 30 s kilobase(kb) -1 (拡張) テンプレート DNA のための 72 ° C。5 サイクルの温度プログラムを繰り返し、7.5 分の最後の 72 ° C 拡張ステップを追加
- の個別のチューブの前方および逆のプライマーと初期の PCR 後単管 (すなわち 40 μ L 合計) に製品を組み合わせるし、1.4 の手順で説明されているように同じサイクリング パラメーターを使用して追加の 20 サイクルの PCR 反応を続行します 。
- Electrophorese 15 μ L の PCR 反応混合物 1% (w/v) アガロースゲルのゲルの 0.5 x Tris、酢酸、エチレン ジアミン四酢酸 (EDTA) をバッファー (TAE) を実行しているを使用して。コントロールとテンプレート DNA を PCR で増幅されてされていないの相当額と両方大きく、予想の PCR の製品のサイズ未満のマーカー バンドが含まれている参照 DNA ラダーの因数を electrophorese.
- 40 分の 120 V で電気泳動後 0.5 G/ml エチジウム ブロマイドと室温で 30 分間振ることを含む水でゲルを水没します。フルレングスのテンプレートは、UV 光の下でコントロール テンプレート バンドに比べて増幅バンドの相対エチジウム ブロマイド蛍光強度の増加として mutagenic プライマーによって増幅されていることを確認 (302 nm)。
- 明白な増幅しない場合、53-56 ° C の温度範囲で 0.5 ° C 単位でアニーリング温度を調整した後、PCR を繰り返します 。
- Mutagenic プライマーによってテンプレートの増幅の確認後、メチル化 dna を消化する DpnI の制限の酵素と PCR 反応混合物の残りの ~ 25 μ L を扱います。25 μ L の PCR 反応の混合物と 1 × DpnI 反応バッファーの最終濃度あたり 0.5 μ L (10 単位) で DpnI を使用します。37 ° C で 2.5 時間孵化させなさい
- 1.75 mL 遠心チューブに DH5α おいた大腸菌 の有能なセルに衝撃を与える熱の 100 μ L に消化された混合物の 5 〜 10 μ L を追加次のテンプレート消化。60 分の氷で細胞の DNA の混合物を孵化させなさい
- 熱衝撃 45 42 ° C で遠心管の細胞の DNA の混合物の乾熱ブロック。3 分間氷の上の混合物をインキュベート後セルに室温ルリア ベルターニカミラ スープ (LB) の 900 μ L を追加し、合計細胞懸濁液を滅菌 14 mL 丸底チューブに転送します 。
- 190 rpm で一定の揺れで 90 分の 37 ° C で細胞懸濁液をインキュベートします 。
- その後、1.75 mL 遠心チューブおよび 10,000 × g で遠心する部屋の温度で 5 分間に細胞懸濁液を転送します 。
- 、遠心分離後上澄みの 900 μ L を削除し、残りの 100 μ L のポンドで穏やかなピペッティングによる細菌の細胞を再懸濁します
- は、表現のベクトル (すなわち 60 μ g/mLKanamycin) ために選択的である抗生物質を含んでいる LB 寒天培地プレート上に得られた濃縮細胞懸濁液を転送します。無菌寒天プレート上に均等に懸濁液を広げ、37 ~ 16 h インキュベート ° C
- 次の日は、antiobiotic 選択圧力 (すなわち 60 μ g/mL カナマイシン) を含む液体の LB の 5 mL にプレートから単一コロニーを接種します。37 で一定の揺れで一晩 37 ° C で液体培養を成長 ° C
- を分離し、アルカリ溶解手順 45 に基づく市販のキットを使用して E. 大腸菌 細胞から伝達されたプラスミッドの浄化します 。
- の興味の突然変異が存在し、プラスミド 46 のサンガー DNA の配列によって適切なリーディング ・ フレームで確認します 。
2。制服 15 N 標識タンパク質発現 大腸菌 BL21 ΔE3
。注: 異なった組換え蛋白質の必要条件は異なる表現。次は人間 STIM1 EFSAM タンパク質の発現の最適化プロシージャ
。- BL21 ΔE3 コドン (+) 熱衝撃有能なセルに Cys 変異 (すなわちペット-28 a-EFSAM) 発現ベクターを変換し、1.9 1.14 の手順で説明するように抗生物質の選択圧を含む LB 寒天培地プレート上にプレート) と、次の変更: 直接遠心分離によっての遠心管の細胞の集中を必要とせず LB 寒天培地プレート上 ~ 1,000 μ L 総細胞懸濁液から 150 μ 因数をプレートします 。
- 次の日、無菌に 200 mL 三角フラスコ (すなわちペット 28 a EFSAM の μ g/mL カナマイシンを 60 など) 適切な抗生物質を添加したポンドの 20 mL を含む単一コロニーを転送します。この液体スターター文化一晩 (すなわち ~ 16 h) で一定の揺れで 37 ° c の成長 〜 190 rpm 。
- 2.2 のステップとして同じ日に準備 M9 15 N 標識タンパク質式オートクレーブによる中規模 M9 の 1 L バッファー 4 L 三角フラスコの塩 (42 mM ナ 2 HPO 4、22 mM KH 2 PO 4、8.6 mM の NaCl、pH 7.4)。一度涼しく、1 L 滅菌 M9 塩溶液に 0.2 μ m の滅菌注射器フィルターを通して 20% (w/v) D-グルコース、1 M CaCl 2 1 M チアミン、1 M MgSO 4 ビオチンは 1 mg/mL、0.2 グラム/mL の 15 N NH 4 Cl の混合物にフィルターを適用して、これらのコンポーネントの最終濃度が 0.2% (w/v) D-グルコース、100 μ M CaCl 2, 50 μ M チアミン 1 mM MgSO 4、1 μ g/mL ビオチンと 1 mg/mL 15 N NH 4 Cl.
- 次の日無菌 50 mL 生殖不能の円錐管にセルをペレットに 15 分 2,400 × g で遠心する 20 mL 一晩液体スターター文化を転送します 。
- LB 培地をデキャンティング後 M9 最小媒体の 10 mL の結果細胞ペレットを再懸濁し、抗生物質 (すなわち 60 μ g/mL カナマイシン) M9 最小媒体の 1 リットルに再懸濁のペレット混合物を転送します 。
- 成長の 37 ° C と 600 nm (OD600) に達するとの光学濃度まで揺れ 〜 190 rpm 一定で細菌スターター文化を含む M9 最小媒体の 1 L ~0.6 0.8 。
- Specfified OD600 範囲に達したときは、イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) タンパク質の発現を誘導するための 200 μ M を追加します 。
- IPTG 添加後続行 〜 16 時間 (すなわち一晩) ~ 190 rpm で一定の揺れで周囲温度で蛋白質の表現のための細胞の培養します 。
- 次の日は 4 ° C、30 分 〜 10,000 × g で遠心分離によって細菌を収穫
- は、LB をデカントし、50 mL のコニカル チューブに細胞ペレットを転送します。浄化まで-80 ° C でペレットを格納します 。
3。エシェリヒア属大腸菌 の組換えタンパク質の精製
。注: 異なる組換えタンパク質の精製手順が必要があります。次は 6 ・ #215 のプロトコル;ペット-28 a 構成から表現される封入体からの彼の付けられた EFSAM 浄化
。- は手動で 6 M グアニジン塩酸、20 mM トリス-HCl (pH 8) 冷凍細菌細胞ペレットを均質化し、5 mM β-メルカプトエタノール電動 10 mL 転送ピペットを使用して。このステップのウェット細胞ペレットの 5 mL あたりグアニジン HCl の約 40 mL を追加します 。 ハイブリダイゼーション オーブンで一定回転で周囲温度で
- 次は 90 分インキュベーション 〜 15,000 × g、不溶性細胞の残骸 (すなわち ペレット) を可溶性のタンパク質から分離する 40 分の 8 ° C で混合物を遠心分離機します。混合物 (すなわち上清).
- 50% (v/v) Ni 2 + 追加 750 μ L-ニトリロ三酸 agarose ライセートを明らかにし、スラリーのビーズし、ハイブリダイゼーション オーブンで反転と室温で別の 90 分間インキュベートします 。
- は、その後、重力流タンパク質精製カラムのアガロース ビーズを集めることによって、Ni 2 + 行き 6 × 彼の付けられた蛋白質をキャプチャします。ライセート 3.5 の手順に移動する前に完全に列を通過するを許可します 。
- は洗って 3 回 6 M 尿素、20 mM トリス塩酸 pH 8 と 5 mM β-メルカプトエタノールの 10 mL で収集したビーズです。全体 10 mL が各後続の 10 mL の前に列を通過するようにワシントン州
- 2 mL 分数 20 mM トリス塩酸 pH 8、6 M 尿素を使用して一連の蛋白質を溶離する 300 mM のイミダゾールと 5 mM β-メルカプトエタノール分数の間 90 s の培養時間。全体 2 mL が各後続の溶出のステップの前に列を通過することを確認します 。
- この段階で興味の蛋白質が Coomassie 青いステンド ナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 塩化物イオンと 47 のメソッドを使用して、溶出画分に存在を確認します。両方標準的な分子量マーカー バンドに対して蛋白質のサイズ、量と純度を比較することにより評価する興味の蛋白質の予想される分子量より小さい 。
- カットオフ 3,500 Da 分子量の透析膜への溶出蛋白質画分をプール、4 ° C で 1 L リフォールディング バッファー (20 mM トリス、1 mM DTT、CaCl 2, 5 mM の 300 mM 塩化ナトリウム、pH 8) 孵化させなさい、マニエッティによって攪拌されるバッファー中を一晩c 攪拌します 。
- リフォールディング時間 〜 16 時間後 〜 1 透析バッグに直接蛋白質の mg 当たりトロンビンの U を追加し、, 追加 ~ 24 h の 4 ° C で
- は Coomassie 青い染色 ~ 15 μ L 蛋白質因数トロンビンの孵化前後に透析バッグから撮影 (SDS-PAGE) ポリアクリルアミドゲル使用の変化に electrophoresed を彼タグ胸の谷間 6 × の範囲を確認します。塩化物イオンと 47 の方法。彼の札に裂かれた 6 × の分子量に対応する移行で 2 〜 kDa のシフトが見られる場合は引き続き手順 3.11;場合 - ブルー染色により検出される未消化の蛋白質は残りの分数、透析バッグに直接蛋白質の mg 当たりトロンビンの ~0.2 U を追加し、, 追加 ~ 24 h の 4 ° C で
- さらに蛋白質を浄化するために使用サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィー。EFSAM の陰イオン交換クロマトグラフィー、透析バッグと集中から蛋白質の解決を削除 ~ 10 倍 10,000 Da 分子量カットオフ限外ろ過遠心濃縮器を使用して。その後、ソリューションを再度希釈 〜 20 塩化ナトリウム フリー バッファー (20 mM トリス、CaCl 2, 5 mM 1 mM DTT、pH 8) で 。
- は、3.11 のステップで記述されている塩化ナトリウム フリー バッファーの 10 列ボリュームとプレパックド陰イオン交換カラムを平衡します。平衡滴下方法と終了列ソリューションの着実なストリームが発生回避の注射器圧力で列を使用してソリューションを押すことによって空気泡を含まないルアーロック シリンジに読み込まれたバッファーを使用してください。強陰イオン交換器 (アンモニウム官能基を持つ架橋アガロースなど) を使用します 。
- 3.12 の手順で説明されているように列に塩化ナトリウム フリー バッファー (ステップ 3.11) に希釈タンパク質溶液をロードします 。
- はグラデーションのタンパク質を溶出 [すなわち 0 - 60% (v/v)] nacl のバッファー (20 mM トリス、1 M の NaCl、CaCl 2, 5 mM 1 mM DTT、pH 8) 2 ポンプ タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムを使用しています。~1-1.5 mL の一部分を収集し、紫外 280 nm の吸光度を使用して蛋白質の溶出プロファイルを監視する FPLC システムを設定、流量 0.5 mL/分
- 溶出ピークと同様 Coomassie 青いステンド SDS-PAGE によるタンパク質純度ゲルの塩化物イオンと 47 のメソッドを使用して興味の蛋白質を含有する画分を識別します 。
- プール分数を示す > 95% (すなわち、Coomassie 青いゲルを染色にのみ単一のタンパク質のバンドを示す分数として取られる) 透析バッグと 3.8 の手順で説明されているように透析が興味の実験的バッファーに交換にします 。
4。ブドウ糖 5 mt 透析による蛋白質の化学添付ファイル
。 N--(β-D-glucopyranosyl) - n- 55 ミリメートル
- 準備原液 '-[2-methanethiosulfonyl) エチル] 尿素 (グルコース-5-MTS) 100% (v/v) DMSO の 500 μ l の化合物の 10 mg を溶解します。-20 で DMSO で溶解未使用ブドウ糖 5 MT を格納 ° C
- 準備 〜 60 μ M 蛋白質の修正の 1 L にじん帯 1.5 mL 変更のタンパク質サンプルのバッファーは 20 mM モップ、150 mM の NaCl、CaCl 2 5 mM と 0.1 mM TCEP、pH 8.3 に成ります。変更される蛋白質のサイズより小さいである透析膜の分子量カットオフを使用 (例えば 〜 17,500 Da EFSAM の 3,500 Da カットオフを使用). 4 ° C で
- 後 24 h は、透析バッグから微量遠心チューブにサンプルを転送します。2 mM の最終的な集中に DMSO 溶解グルコース-5 MTS ですを追加します。 。
- は、周囲温度で 1 時間暗闇の中でサンプルをインキュベートします。1 h の潜伏期間中にソリューションをミックス チューブの穏やかなタップして 10 分ごとに
- はその後、タンパク質を還元剤では、4.2 または遠心限外濾過法による手順の説明に従ってに、4 ° C で透析によって含まれていない最後の実験的バッファーに再交換します。限外ろ過のプロシージャの集中に ~1.5 mL 蛋白質のサンプル < 0.5 mL と実験的バッファーと同じコンセントレーターで希薄化後。手順この濃度希釈追加で 2 回、合計交換は 30 × 30 × 30 の最小値 = 27,000-fold。EFSAM、トリス、150 mM の NaCl、5 mM CaCl 2、実験的バッファーとして pH 7.5 20 mM を使用します 。
- 透析または限外ろ過の交換の重炭酸アンモニウム 25 mM または 25 mM 酢酸アンモニウムにそれぞれ、4.2 および 4.5 の手順の説明に従ってエレクトロ スプレー イオン化質量分析用サンプルを準備します。透析を使用して、任意の残留塩化ナトリウムおよび CaCl 2 塩を削除する、少なくとも 3 回を交換するを確認します 。
- は、正確な質量を決定する (すなわち ± 1 Da) エレクトロ スプレー イオン化を使用して興味の蛋白質の質量分析法 48 , 49。タンパク質に 281.3 Da を追加する methanethiosulfonate 化学を介してシステインのチオールに追加される各共有結合のグルコースを期待質量 (すなわちブドウ糖 5 MT 用 360.4 Da 加減算 CH 3 79.1 Da 中に共有結合グループ 2 を残して添付ファイル).
5。Modif の溶液 NMR 評価ication 効率と構造的摂動
。- ことを確認修正の濃度タンパク質である > グルコース添付ファイルと最終バッファー交換後 100 μ M。EFSAM、推定 280 UV 吸光係数を使用して蛋白質の集中の 1.54 (mg mL - 1) cm - 1 nm 。
- シミングとパルスの調整および 10% (v/v) D-4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 酸 (DSS) のサプリメント 60 μ M とタンパク質溶液 2 O 信号ロック。高い信号対雑音使用頻度一致 5 mm NMR チューブで 600 μ L のサンプル、トリプル共鳴 HCN 極低温プローブ搭載最小 600 MHz 分光器に挿入されます 。
- は、以前詳細 50 , 51 温度、1 H と 15 N スイープ幅、過渡およびインクリメントとして標準 1 H - 15 N HSQC スペクトルを収集します。特定のサンプルに適した設定です。EFSAM スペクトル、20 ° C を使用、256 の 1 H トランジェント、64 15 N 寸法の増分および 1 H 15 N 掃引幅はそれぞれ 8,000、1,800 Hz に設定します 。
- ジチオトレイトール (DTT) を 15 mM の最終濃度 1 M 在庫から NMR サンプルに追加糖タンパク質スペクトルの取得します。DTT はジスルフィド結合を介した添付ファイルの低減による蛋白質からブドウ糖部位を削除します 。
- 第二 1 H-15 N HSQC、グルコースの添付ファイルによって引き起こされる変更効率と構造的摂動を評価するために参照スペクトルを提供するこれらの削減/未修正の条件の下でを取得します 。
- は、NMRPipe 詳細以前 52 を使用して NMR データを処理します。最低限の処理は、データの変換、段階的に廃止、溶媒の抑制、フーリエ変換、スペクトルの最初の可視化に含まれていることを確認します 。
- アミド ピーク強度と CARA 53 NEASY プラグインを使用して変更および減らされたスペクトルにおける化学シフト値を測定することによって評価変更効率。システイン アミド ブドウ糖の両方が添付されスペクトルのピーク強度を評価することを確認します。システイン アミドは、両方のスペクトルに確実にあることはできません、読み出しとして残基はシステインに隣接する強度を使用します 。
- システイン変更スペクトルからアミドの強さと効率で割った Cys 減少 (すなわち DTT 処理) スペクトルからアミドの強度計算を乗じた:
、どこ M は Cys 変更スペクトルでアミドの強さ、R は Cys 低減スペクトルでアミドの強度。また、いくつかのアミド ピークに平均効率を評価:
, 効率 i が各計算別に定める効率残渣、i、 および n は計算で使用されている残基の合計数 。
- 計算化学シフト摂動 (CSP) 15 N と各ピークの 1 H 寸法と大きい 15 N 化学シフトの範囲使用のために正規化の 2 つのスペクトルの化学シフトの違いから、方程式に従う:
、どこ ΔH はプロトン次元の ppm の変化、ΔN ppm 窒素ディメンション増減します
、どこ M は Cys 変更スペクトルでアミドの強さ、R は Cys 低減スペクトルでアミドの強度。また、いくつかのアミド ピークに平均効率を評価: 
, 効率 i が各計算別に定める効率残渣、i、 および n は計算で使用されている残基の合計数
、どこ ΔH はプロトン次元の ppm の変化、ΔN ppm 窒素ディメンション増減しますSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このアプローチの最初のステップは、ブドウ糖 5 山地 EFSAM を使用して変更可能なことができるシステイン残基に候補糖残基の変異体には内因性のシステイン残基がないので特別な考慮事項を前に可能にする必要はありません必要があります、突然変異誘発。ただし、ネイティブのシステイン残基は、記述されている化学を実行する前に非変更可能な残基に変異する必要があります。ネイティブ構造体に影響を与える最低限、興味の蛋白質のグローバル配列アラインメントを実行する勧めし、他の残基であるを決定する最も頻繁で内因性システイン位置を発見しました。他の生物の自然発生するこれら他の残基に Cys 変異は蛋白質の構造の影響を最小限があります。内因性の Cys 残基は厳重に保存されている場合は、Cys に最も構造的に類似している Ser に書き換えることをお勧めします。図 1は、典型的な PCR の突然変異誘発ゲル PCR に使用された増幅されていないテンプレート ペット-28 a DNA 量制御よりも数倍高い強度を示す増幅された DNA のサンプルの PCR 反応の成功を評価を示しています。次の手順では、テンプレート DNA 消化エシェリヒア属大腸菌にプラスミドの修理のための変換をご利用など。液体培養、プラスミド分離シーケンスによって遺伝の確認でプラスミドの伝播後、タンパク質発現の変異のベクトルを使用できます。図 2 aは、NaCl 濃度の増加を基準にして陰イオン交換カラムから EFSAM の典型的な溶出プロファイルを示しています。図 2 bは、Coomassie 青いステンド SDS ページのゲルの EFSAM の純度を示しています。
純粋な蛋白質を取得無料のチオールと MTS の反応を通じてブドウ糖部位をアタッチする一連の透析の手順が使用されます。図 3 aは、小さなタンパク質ボリュームの典型的なセットアップのイメージが透析膜による膜クリップで密閉、関心のバッファーを含む大きな 1 L ビーカーに含まれる示しています。質量分析法による変更の成功の最初のチェックが行われます。図 3 bは、単一システインのチオールに変更 EFSAM の代表的なエレクトロ スプレー質量スペクトルを示しています。次の特定の蛋白質のプロトコルの確立、変更効率と構造的摂動を評価する単一から均一に15N 標識サンプル。還元剤 DTT (図 4 a) の付加の後の前後1H-15N HSQC スペクトルを取得します。プロトコル手順 (図 4 b) 5.8 に示すとおり変更および減らされたスペクトルにおけるアミド ピーク強度の比較を介して変更効率の計算が可能です。最後に、とき化学シフト割り当ては蛋白質の構造変化との相関は、の詳細なステップ 5.9 (図 4) として計算できます Csp のため知られています。
図 1: DNA の agarose のゲル mutagenic プライマーとテンプレート ベクトルの増幅チェックを表示します。
1.0% (w/v) agarose のゲルの DNA マーカー (M) 図ベクトル制御 (VC) と PCR 増幅テンプレート (PCR)。DNA は、0.5 x TAE バッファーで 45 分間 120 V で電気泳動によって分離しました。VC の ng が読み込まれた 0.5 の合計は、テンプレートの量に相当する PCR の車線に読み込まれます。ゲルは紫外線の下で可視化する前に 20 分間臭化エチジウム (~0.5 μ g/mL) を使用して染色された (302 nm)。ゲルは、ベクトル (黒矢印) の予想サイズに近い増幅された DNA の高レベルを示しています。バンドの間 1,000 と 1,500 bp マーカー可能性があります実行されている PCR レーンで 2 番目のバンドは、非具体的増幅 PCR の製品を表します。増幅された DNA の濃度レベルは、成功したと見なされるに VC の強さのレベルより高くなければなりません。他のいくつかの DNA の染料は、エチジウム ブロマイド染色 (例えば見なさい57) に少ない変異原性より安全な代替手段として使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 典型的なクロマトグラフィー精製し純度 STIM1 EF-サムをチェックします。
(A)陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイル STIM1 EF-サムの。手動バインド後基本的な pH で注射器で低 NaCl 濃度の陰イオン交換カラム (Q FF) に EF サムと AKTA FPLC (GE ヘルスケア) 塩化ナトリウム勾配をもつタンパク質の溶出とされます。溶出は、1 M の NaCl の 0-60% (v/v) グラデーション上紫外線 280 nm 信号を用いた AKTA によって監視されます。(B) Coomassie SDS-PAGE ブルー染色ゲル (A) から溶出画分の変性タンパク質ゲルでは、EF サムた 〜 250 ミリメートルで 〜 450 mM の NaCl の 2 つの主要なピークのことを明らかにします。浄化のプロトコルが得られます > 95% すべての汚染物質の欠如によって証明されるよう純粋な EF サム バンド Coomassie 青い染色ゲルに表示。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 透析セットアップおよび体外タンパク質糖鎖修飾の確認。
(A)一般的な透析のセットアップが体外への愛着のブドウ糖の MTS 反応によるシステインのチオールに使用します。透析チューブに対してバッファー内に含まれるタンパク質の ~1.5 mL の図 〜 実験的バッファーの 1 L。バッファーを常に完全な交換を確保するため攪拌することが重要です。透析バッグの沈降を防ぎ、回転攪拌棒による損傷の余分な透析チューブにクリップ遠心チューブを図します。変更された Asn171Cys EF サム蛋白(B)エレクトロ スプレー イオン化質量スペクトル。質量分析法は、変更手順が成功したかどうかを評価するために便利で正確な方法です。典型的な質量クロマト グラムは、理論値と実測質量の変更と変更された Asn171Cys EF-サム示されているを示しています。大半のサンプルの質量は ~1.3 予想される理論的な大量のグルコース共役 Asn171Cys EF-サムのダ内にある高分子に対応します。(Bのデータ) replotted は、 42から変更します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 溶液 NMR 評価修正の効率性と構造の摂動単一 NMR サンプルから。
(A)1H-15N HSQC スペクトル オーバーレイ (赤 crosspeaks) 前にグルコース共役 Asn131Cys EFSAM の前後 (黒 crosspeaks) 15 mM DTT を追加。オーバーレイは、明らかにタンパク質と構造的摂動の両方の変更を示すいくつかの残基特異アミド化学シフトの変更を示します。赤いボックスは、Asn131Cys アミドの場所を示しています。(B) Asn131Cys アミドを含む1H-15N HSQC 領域の拡大ビュー。変更されたスペクトル (m) Asn131Cys アミド ピークの強度は、(表示) 効率の計算 (私R) 減少 (非修飾) スペクトルの強度で除算されます。エフェクト残基の平均効率の計算誤差の推定値を含む、効率のよりよい見積もりを提供します。Asn131Cys EFSAM 5 残基 (すなわち 129-133) に基づく平均効率を示します。(C)正規化化学シフト摂動グルコース共役 Asn131Cys EFSAM 蛋白質によって引き起こされます。HSQC の実験セット収集する前に 1 つのサンプルと減水剤を補うだけでなく [ (B)に示すように] ピーク強度解析による改質効率の便利な見積もりを提供し、提供のデータ後変更に伴う構造変化の評価。グルコース共役により位置 131; 付近最大摂動ただし、この分析は、予想されるシーケンスの近さ、この分析の値を示すにもっぱら基づいて摂動を明らかにします。(C) 内のデータは、replotted、 42から変更します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| STIM1 の突然変異、 | 方向b | DNA シーケンスc | |
| Asn131Cys | 楽しみにして | 5'-GTCATCAGAAGTATACTGTTGGACCGTGGATGAGG 3' | |
| Asn131Cys | リバース | 5'-CCTCATCCACGGTCCAACAGTATACTTCTGATGAC 3' | |
| Asn171Cys | 楽しみにして | 5'-CCAAGGCTGGCTGTCACCTGCACCACCATGACAGGG 3' | |
| Asn171Cys | リバース | 5'-CCCTGTCATGGTGGTGCAGGTGACAGCCAGCCTTGG 3' | |
| 、STIM1 アミノ酸番号 NCBI 加盟 AFZ76986.1 に基づいています。 | |||
| b逆のプライマーは、'転送' プライマーの逆の補数シーケンスに対応します。 | |||
| c下線付きのコドン トリプレットは、Cys 変異に対応します。 | |||
表 1。ペット-28 a STIM1 EFSAM 内 Cys 変異する Asn のオリゴヌクレオチド (プライマー) シーケンスのサンプルを構築します。
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Discussion
タンパク質の糖鎖修飾は翻訳後修飾糖が共有結合ポリペプチド アミノ酸側鎖に結合を通して主に接続されています。哺乳類のタンパク質の 50% がグリコ54、どこ糖蛋白質は生体分子結合親和性を変更することから効果の多様な範囲を持つことができますその後、蛋白質折りたたみ、チャネルの利用状況の変更、ターゲットに影響を与える劣化と携帯 (33の見直し) 少数を示すため、人身売買のための分子。哺乳類の生理学における糖鎖の重要な役割は、哺乳類の糖鎖構造33最大限の多様性を構築する進化したタンパク質のいくつかの数百人が明らかです。N- を変更し、 O糖鎖修飾パターンと関連している前立腺の (増加・減少) の乳房 (増加・減少) など多数の病気の状態 (増加) の肝臓、卵巣 (増加)、膵臓 (増加)胃癌 (増加) 55.さらに、huntingtin、タウの糖鎖 α-シヌクレインがアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病の疾患56に関連付けられているこれらのタンパク質の毒性を規制するしており、グリコシル化の先天性疾患のグループがされています。54グリコシル化反応を仲介する酵素の遺伝的欠陥に起因を識別します。したがって、途方もなくタンパク質制御と機能健康と病気の私達の理解に影響する可能性は、グリコシル化反応の正確な生物物理学的, 生化学的および構造的影響を理解すること。
フコース、ガラクトース、グルコース、 n-アセチルガラクトサミン、 n-アセチルグルコサミン、グルクロン酸、イズロン酸、マンノース、哺乳類グライコームは、糖鎖構造の多様性につながる 10 砂糖のビルディング ブロックが含まれますシアル酸、キシロース33。糖鎖可変リンク、 N- アセチルグルコサミン糖タンパク質に直接、 o-グリコシレーションフコース、キシロース、 n-アセチルグルコサミン、 Nacetylgalacotose のいずれかで発生することができます。グルコースやガラクトース ポリペプチドにリンクしました。サイト選択的に糖をタンパク質に取り入れ、チオール基を介してのシステイン残基にアタッチする方法を示すここにこれらの糖蛋白質の表面に隣接が生物的特性に与える影響を理解し始めると、シーケンス。ここは内生グリコ Cys に置き換えられます変更の in vitroによる単純な化学残基。この方法では、単一および複数の糖鎖修飾部位を折り畳みと安定性と同様に、全体構造の累積的な変更と同様、サイトごとの貢献および蛋白質の機能を引き出す評価があります。
最近では、この方法は正常に、個別に累積的 Asn131、Asn171 N- グリコシル化反応サイト42の役割を評価するために EFSAM で使用されました。Cys 変異と Asn131 または Asn171 サイトへのブドウ糖のキャラクタリゼーション、Ca2 +結合親和性の低下を明らかに、安定性を抑制します。2 つのサイトはグルコースの添付ファイルの結合親和性の低下と同時に変更されたときは、強化重合性向体外につながる安定性が増強されました。構造上、記載方法は、Asn131 または Asn171 の変更は、相互に SAM ドメイン、EF ハンド ペアに隣接に位置するコア α8 ヘリックスを摂動を示した。この構造解析についてどのように蛋白質の表面のブドウ糖の変更は EF 内収束と強化構造変化につながる-最終的に蛋白質を不安定化し、SOCE 42を高める手: SAM インターフェイス。
長い炭水化物小胞体に固有の添付する折り畳み式の安定性、構造、この手順の EFSAM の表面に近い単糖の効果の助け小屋ライトが簡単にこのサイト選択的アプローチのアプリケーションを変更しながらゴルジと午後提供するローカリゼーション (異なる満期のすなわち糖状態)、チオール修飾は可逆的を使用してので、山地 MTS が望ましいようにチオールにリンクできる機能グループを含んでいるこれらの炭水化物の信頼性の高いソース、還元剤と参照スペクトルを簡単に取得できます。このアプローチは、脂質などのタンパク質を他の翻訳後修飾の部分をリンクに適応できます。同時に考慮すべきこのアプローチにいくつかの制限があります。最初に、メソッドは構造、安定性、血糖値変更の不在でも折りたたみに影響を及ぼすシステインに糖鎖修飾部位の変異に依存します。同様に、蛋白質のネイティブのシステイン残基は、非糖サイトでグルコース添付ファイルを防ぐためにも変異する必要があります。さらに、多くの場合システイン残基の付加はもっと挑戦的な浄化を行うシステイン架橋と異常折り畳みによる細菌の封入体形成を促進します。それにもかかわらず、記載このサイト選択的なシステイン架橋アプローチは特定の糖鎖の高レベルを必要とする実験のサイトの構造、生化学的および生物物理効果を引き出す制御手段を提供します均一なタンパク質。効果構造に非ネイティブ Cys 残基の安定性とフォールディング単に確認できます変更比較に野生型の不在でタンパク質属性42。蛋白質 (Asn-Ala など) の突然変異体のバージョンを変更ブロックを表現する真核細胞で得られた機能のデータと一緒に撮影した、現在記述されていたアプローチは蛋白質の構造のメカニズムに新しい洞察力を得られません翻訳後修飾による制御。
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Acknowledgments
この研究は、自然科学と工学研究会のカナダ (時は PBS に 05239) のためのカナダの財団によって支えられた革新/オンタリオ研究基金 (する時は PBS)、前立腺がんと戦う財団 - (時は PBS) にお父さんとオンタリオ州の telus 社のソフトウェアに乗る大学院奨学金 (Y.J.C.、n. s.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
| Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
| DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
| Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
| BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
| DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
| 0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
| HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
| 3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
| 5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
| Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
| Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
| HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
| AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
| 600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |
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