Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Inriktning cystein tioler för in Vitro platsspecifika Glycosylation av rekombinanta proteiner

Published: October 4, 2017 doi: 10.3791/56302
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1, 1
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario
* These authors contributed equally

Summary

Biokemiska och strukturella analyser av glykosylerat proteiner kräver relativt stora mängder homogena prover. Här presenterar vi en effektiv kemisk metod för platsspecifika glycosylation av rekombinanta proteiner renas från bakterier genom att rikta reaktiva Cys tioler.

Abstract

Stromaceller interaktion celladhesionsmolekyl-1 (STIM1) är en typ-jag transmembrane protein ligger på endoplasmatiska nätverket (ER) och plasma membran (PM). ER-resident STIM1 reglerar aktiviteten av PM Orai1 kanaler i en process som kallas lagra manövrerade kalcium (Ca2 +) inträde som är huvudsakliga Ca2 + signalering processen som driver immunsvaret. STIM1 genomgår posttranslationella N- glycosylation på två luminala Asn platser inom Ca2 + fjärranalys domänen av molekylen. Dock den biokemiska, biofysiska, och struktur biologiska effekter av N- glykosylerat STIM1 förstods dåligt tills nyligen på grund av en oförmåga att lätt få höga halter av homogena N- glykosylerat protein. Här, beskriver vi genomförandet av ett in vitro- kemiska tillvägagångssätt som tillmäter specifikt protein platser gäller att förstå underliggande inverkan på Proteiners struktur och mekanism av N- glycosylation glukosenheter. Med hjälp av lösning kärnmagnetisk resonansspektroskopi bedöma vi både effektiviteten av ändringen samt de strukturella konsekvenserna av glukos tillbehöret med ett enda prov. Detta tillvägagångssätt kan lätt anpassas för att studera de otaliga glykosylerat proteiner som finns i naturen.

Introduction

Lagra manövrerade kalcium (Ca2 +) post (SOCE) är den huvudsakliga vägen som immunceller tar upp Ca2 + från extracellulära i cytosolen. I T-lymfocyter binder T-cellreceptorer ligger på plasmamembranet (PM) antigenerna som aktivera proteinet tyrosinkinas (ses i 1,2,3). En fosforylering kaskad leder till aktivering av fosfolipas-γ (PLCγ) som därefter förmedlade hydrolys av membran fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) till diglyceridolja och inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3 ). IP3 är en liten diffusible budbärare som binder till IP-3 receptorer (IP3R) på det endoplasmatiska retiklet (ER) därmed öppna denna receptor kanal och tillåter Ca2 + att rinna ner koncentrationsgradient från akuten lumen till cytosolen (ses i 4). Receptorn signalering från G-protein kopplade och tyrosin Kinas receptorer i en mängd andra hetsiga och icke-retbara cell typer bly på samma produktion av IP3 och aktivering av IP3Rs.

På grund av ändliga Ca2 + lagringskapaciteten av ER, IP-3-medierad release och resulterande ökning cytosoliska Ca2 + är endast övergående; emellertid, denna utarmning av den ER luminala Ca2 + djupt effekter stromal interaktion celladhesionsmolekyl-1 (STIM1), en typ-jag transmembrana (TM) protein som mestadels finns på ER membran 5,6,7. STIM1 innehåller en lumen-orienterade Ca2 + fjärranalys domän består av en EF-hand par och sterila α-motiv (EFSAM). Tre cytosoliska-orienterade dubbeltvinnade domäner skiljs från EFSAM genom den enda TM domänen (över 8). Vid ER luminala Ca2 + utarmning genomgår EFSAM en destabilisering-kopplade oligomerisering 7,9 som orsakar strukturella rearrangements av TM och dubbeltvinnade domäner 10. Dessa strukturella förändringar kulminera i en svällning av STIM1 ER-PM korsningar 11,12,13,14 genom interaktioner med PM phosphoinositides 15, 16 och Orai1 subenheter 17,18. Orai1 proteiner är PM subunitsna som monterar till form Ca2 + kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 interaktioner i ER-PM korsningar underlätta en öppen Ca2 + release aktiveras Ca2 + (CRAC) kanal konformation som möjliggör förflyttning av Ca2 + till cytosolen från de höga koncentrationerna av den extracellulära. I immunceller, den ihållande cytosoliska Ca2 + förhöjt via CRAC kanaler inducera de Ca2 +- calmodulin/kalcineurin beroende Defosforylering av nuclear factor av aktiverade T-celler som därefter in i kärnan och börjar Transkriptionsreglering av gener att främja T-cells aktivering 1,3. Processen för CRAC kanal aktivering av STIM1 23,24 via agonist-inducerad ER luminala Ca2 + utarmning och den resulterande ihållande cytosoliska Ca2 + höjden kallas kollektivt SOCE 25. SOCE i T-cellerna vitala roll framgår av studier som visar att ärftliga mutationer i både STIM1 och Orai1 kan orsaka svår kombinerad immunbrist syndrom 3,19,26, 27. EFSAM initierar SOCE efter avkänning ER-luminala Ca2 + utarmning via förlust av Ca2 + samordning på den kanoniska EF-handen, vilket slutligen leder till destabilisering-kopplade själv association 7, 28,29.

Glycosylation är kovalent fastsättning och bearbetning av oligosackarid strukturer, även känd som glycans, genom olika biosyntetiska stegen i ER och Golgi (över 30,32,33). Det finns två dominerande typer av glycosylation i Eukaryoter: N-länkade och O-kopplad, beroende på specifik aminosyra och atom överbrygga kopplingen. I N- glycosylation, glycans är kopplade till den side chain amiden av Asn, och i de flesta fall uppstår det inledande steget i ER som polypeptiden kedjan flyttar in i lumen 34. Det första steget av N- glycosylation är överföring av en fjorton-socker kärna struktur består av glukos (Glc), mannos (Man) och N- acetylglukosamin (GlcNAc) (dvs Glc3Man9GlcNAc2) från en ER membran lipider av en oligosaccharyltransferase 35,36. Ytterligare steg, exempelvis klyvning eller överföring av glukos rester, är katalyseras i ER av specifika glycosidases och glykosyltransferaser. Vissa proteiner som lämnar ER och flytta in i Golgi kan finnas ytterligare bearbetade 37. O- glycosylation avser tillägg av glycans, oftast till side chain hydroxylgruppen Ser eller Thr resthalter, och denna ändring sker helt i den Golgi komplex 33,34. Det finns flera O- glycan strukturer som kan bestå av N- acetylglukosamin, fukos, galaktos och sialic acid med varje monosackarid lagt till sekventiellt 33.

Medan ingen specifik sekvens har identifierats som förutsättning för många typer av O- glycosylation, en gemensam samsyn sekvens har associerats med N-länkade modifiering: Asn-X-Ser/Thr/Cys, där X kan vara någon aminosyra Förutom Pro 33. STIM1 EFSAM innehåller två av dessa samförstånd N- glycosylation platser: Asn131-Trp132-Thr133 och Asn171-Thr172-Thr173. Tidigare studier har faktiskt visat att EFSAM kan vara N- glykosylerat i däggdjursceller vid Asn131 och Asn171 38,39,40,41. Men tidigare studier av konsekvenserna av N- glycosylation på SOCE har inkonsekvens, vilket tyder på undertryckt, betablockerare eller ingen effekt av denna posttranslationella modifieringen på SOCE aktiveringen 38,= ”xref” > 39,40,41. Forskning om underliggande biofysiska, biokemiska och strukturella konsekvenser av EFSAM N- glycosylation är således mycket viktigt att begripa de rättsliga effekterna av denna ändring. På grund av kravet på för höga nivåer av homogena proteiner i dessa in vitro- experiment tillämpades en webbplats-selektiv strategi att fästa kovalent glukosenheter EFSAM. Intressant, orsakade Asn131 och Asn171 glycosylation strukturella förändringar som konvergerar inom den EFSAM kärnan och öka biofysiska egenskaper som främjar STIM1-medierad SOCE 42.

Kemisk fastsättning av glycosyl grupper till Cys tioler har varit väl etablerade av ett banbrytande arbete som först visat nyttan av detta enzym-fri sätt att förstå glycosylation platsspecifika effekter på protein funktion 43 , 44. mer nyligen och med avseende på STIM1, Asn131 och Asn171 rester var muterat till Cys och glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] användes kovalent länka glukos till gratis tioler 42. Här, beskriver vi detta synsätt som inte bara använder mutagenes för att införliva specifika Cys restmängder för modifiering, men gäller även lösning kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi för att snabbt bedöma både modifiering effektivitet och struktur störningar till följd av glycosylation. Noterbart här allmän metod är lätt anpassningsbar för att studera effekterna av antingen O- eller N- glycosylation någon recombinantly produceras protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. polymeras-kedjereaktion (PCR)-medierad webbplats riktad mutagenes för införlivandet av Cys i en bakteriell pET-28a uttryck vektor.

  1. Bestämma koncentrationen av pET-28a vektorn (dvs dubbel stranded DNA) med en ultraviolett (UV) extinktionskoefficient 0,020 (μg/mL) cm -1 vid 260 nm.
  2. Syntetisera ett par kompletterande mutagena primers för varje Cys mutation sådan att jag) finns det minst 15 nukleotider kompletterar mallen innan första bas obalansen och 15 nukleotider kompletterar mallen efter den slutliga bas obalans, ii) totala primer längden överstiger inte 45 nukleotider, och iii) en guanin eller cytosin ligger på första och sista nukleotid positionen för varje grundfärg (tabell 1). Säkerställa primer syntesen utförs med hjälp av en 0,025 μmol skala och patron rening.
  3. Med en naturtrogen DNA-polymeras, ställa in två 20 µL PCR-reaktion blandningar: innehåller framåt primer och andra som innehåller omvänd primer. Förbered varje blandning att innehålla slutliga koncentrationer på 1 x PCR buffert med 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP, 0,5 μM primer, 0.4 μL DMSO, 1,25 ng/μl mall DNA, 0,02 U/μL HiFi DNA-polymeras.
  4. Termiskt cykel separat blandningar med en tre-stegs-protokollet: 98 ° C i 30 s (denaturing), 53-56 ° C i 30 s (glödgning), 72 ° C under 30 s kilobase(kb) -1 (förlängning) av mallen DNA. Upprepa programmet temperatur för 5 cykler och lägga till en slutlig 72 ° C förlängning steg för 7,5 min.
  5. Efter den inledande PCR med framåt och bakåt grundfärger i separata rör, kombinera produkterna till ett enda rör (dvs. 40 μl totalt) och fortsätta PCR-reaktionen för en ytterligare 20 cykler med samma cykel parametrar som beskrivs i steg 1.4.
  6. Electrophorese 15 μL PCR-reaktionsblandningen på en 1% (w/v) agaros gel med 0,5 x Tris, ättiksyra, etylendiamin tetra ättiksyra acid (EDTA) kör buffert (TAE). Som kontroller, electrophorese motsvarande mängd templat-DNA som inte har förstärkts med PCR och en alikvot av referens DNA stege som innehåller markör band både större och mindre än den beräknade PCR produkten storleken.
  7. Efter elektrofores vid 120 V för 40 min, sänk gelen i vatten innehållande 0,5 μg/mL etidiumbromid och skaka om under 30 minuter vid rumstemperatur. Bekräfta mallen hellång har kompletterats av mutagena primrar som en ökning i relativa etidiumbromid bromid fluorescerande intensiteten av förstärkta bandet jämfört med kontroll mallen bandet under UV-ljus (302 nm).
    1. Om ingen amplifiering framgår, upprepa PCR efter justering glödgning temperatur i steg om 0,5 ° C mellan 53-56 ° C temperaturområde.
  8. Vid bekräftelse av förstärkning av mallen av mutagena primrar, behandla de återstående ~ 25 μl av PCR-reaktionsblandningen med enzymet DpnI begränsning att smälta den metylerade templat-DNA. Använd DpnI på 0,5 µL (10 enheter) per 25 μL PCR-reaktionsblandningen och en slutlig koncentration på 1 × DpnI reaktion buffert. Inkubera i 2,5 timmar vid 37 ° C.
  9. Efter mallen matsmältning, lägga till ~ 5-10 μL av smält blandningen till 100 µL av värme chock behöriga DH5α Esherichia coli celler i ett 1.75 mL mikrocentrifug rör. Inkubera cell-DNA blandningen på is för 60 min.
  10. Värme chock cell-DNA blandningen i mikrocentrifug tuben vid 42 ° C i 45 s på en torr värme block. Efter inkubation blandningen på is för 3 min, tillsätt 900 μl av rumstemperatur Luria-Bertani buljong (LB) till cellerna och överföra totala cellsuspensionen i ett sterilt 14 mL runda-botten rör.
  11. Inkubera cellsuspension vid 37 ° C i 90 minuter under ständig skakning vid 190 rpm.
  12. Därefter överför cellsuspensionen tillbaka i en 1.75 mL mikrocentrifug rör och centrifugera vid 10 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
  13. Efter centrifugeringen, ta bort 900 μL av supernatanten och återsuspendera bakteriecellerna av mild pipettering i de resterande 100 μL av LB.
  14. Överför den resulterande koncentrerad cellsuspensionen på en LB-agarplatta som innehåller antibiotika som är selektiv för uttryck vektorn (dvs 60 μg/mLKanamycin). Aseptiskt sprida fjädringen jämnt på en agarplatta och Inkubera under ~ 16 timmar vid 37 ° C.
  15. Följande dag, Inokulera en enda koloni från plattan i 5 mL flytande LB som innehåller antiobiotic urvalstrycket (dvs 60 μg/mL Kanamycin). Växa de flytande kulturen över natten vid 37 ° C under ständig skakning vid 37 ° C.
  16. Isolera och rena förökade plasmiden från E. coli celler använder en kommersiellt tillgänglig kit baserat på den alkaliska lysis förfarande 45.
  17. Bekräfta mutationen av intresse är närvarande och i ramen korrekt tolkning av Sanger DNA-sekvensering plasmid 46.

2. Enhetlig 15 N-märkt proteinuttryck i BL21 ΔE3 Escherichia coli.

Obs: olika rekombinanta proteiner kräver olika uttryck villkor. Följande är optimerad förfarandet för uttryck av proteinet mänskliga STIM1 EFSAM.

  1. Omvandla uttryck vektorn härbärgerat Cys mutationer (dvs. pET-28a-EFSAM) i BL21 ΔE3 kodon (+) värme chock behöriga celler och plattan på LB-agarplattor som innehåller antibiotika urvalstrycket enligt beskrivningen i steg 1,9-1,14) med den följande ändringar: direkt tallrik en 150 μl alikvot av ~ 1000 μl totala cellsuspension på LB-agar plattan utan att behöva koncentrera cellerna i en mikrocentrifug rör genom centrifugering.
  2. Följande dag, överför aseptiskt en enda koloni till en 200 mL Erlenmeyerkolv, innehållande 20 mL LB kompletteras med lämpliga antibiotika (dvs 60 μg/mL kanamycin för pET-28a-EFSAM). Växer denna flytande förrätt kultur över natten (dvs ~ 16 h) vid 37 ° C under ständig skakning på ~ 190 rpm.
  3. Samma dag som steg 2.2, förbereda M9 medium för 15 N-märkt proteinuttryck i autoklav 1 L av M9 buffra salter (dvs 42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH 2 PO 4, 8.6 mM NaCl, pH 7,4) i en 4 L Erlenmeyer-kolv. När cool, filtrera en blandning av 20% (w/v) D-glukos, 1 M CaCl 2, 1 M tiamin, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL biotin och 0,2 g/mL 15 N-NH 4 Cl genom ett 0,2 μm steril spruta filter i 1 L sterila M9 salt lösning så att den slutliga koncentrationer av dessa komponenter är 0,2% (w/v) D-glukos, 100 μM CaCl 2, 50 μM tiamin, 1 mM MgSO 4, 1 μg/mL biotin och 1 mg/mL 15 N-NH 4 Cl.
  4. Nästa dag, överför aseptiskt 20 mL övernattning flytande förrätt kultur till en 50 mL sterilt koniska rör och centrifugera vid 2400 × g i 15 min till pellet cellerna.
  5. Efter dekantering LB medium, Omsuspendera resulterande cellpelleten i 10 mL M9 minimalmedium och överföra återsuspenderad pellet blandningen i 1 L av M9 minimalmedium med antibiotikum (dvs 60 μg/mL kanamycin).
  6. Växer den 1 L av M9 minimalmedium innehåller den bakteriella förrätt kulturen vid 37 ° C och ~ 190 rpm konstant skakning tills den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) når ~0.6-0.8.
  7. När specfified OD600 intervallet uppnås lägga till 200 μM av isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) för att inducera proteinuttryck.
  8. Efter IPTG dessutom fortsätta ruvning cellerna för proteinuttryck vid omgivande temperatur under ständig skakning vid ~ 190 rpm för ~ 16 h (dvs. över natten).
  9. Nästa dag, skörda bakterierna genom centrifugering vid ~ 10 000 × g, 4 ° C i 30 min.
  10. Dekantera LB och överföra cellpelleten i en 50 mL konisk tub. Lagra pelleten vid-80 ° C tills rening.

3. Rening av rekombinant protein från E. coli.

Obs: olika rekombinanta proteiner kräver skilda rening förfaranden. Följande är protokollet för 6 & #215; Hans-taggade EFSAM rening från inkludering organ uttryckt från den pET-28a konstruktion.

  1. Manuellt homogenisera den frysta bakteriecell pelleten i 6 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) och 5 mM β-merkaptoetanol med motoriserad 10 mL överföring pipett. Tillsätt cirka 40 mL guanidin-HCL per 5 mL våt cell pellet för det här steget.
  2. Följande ett 90 minuters inkubation vid omgivningstemperatur med konstant rotation i hybridisering ugn, Centrifugera blandningen på ~ 15 000 × g, 8 ° C i 40 min att avskilja de olösliga cellfragment (dvs. pellets) från det lösligt proteinet blandning (dvs supernatant).
  3. Lägg till 750 µL av en 50% (v/v) Ni 2 +-nitrilotriacetic acid agaros granulum flytgödsel till den klargj橬一j lysate och inkubera i en annan 90 min i rumstemperatur med inversion i hybridisering ugn.
  4. Fånga därefter 6 × hans-märkta proteinet bunden till den Ni 2 + genom att samla agaros pärlor i en gravitation flöde protein rening kolumn. Tillåt den lysate att flöda genom kolonnen helt innan du flyttar till steg 3.5.
  5. Tvätta tre gånger med 10 mL 6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 8 och 5 mM β-merkaptoetanol insamlade pärlorna. Säkerställa att hela 10 mL passerar genom kolumnen före varje efterföljande 10 mL wash.
  6. Eluera proteinerna i en serie av 2 mL fraktioner med 6 M urea, 20 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM Imidazol och 5 mM β-merkaptoetanol med en 90 s inkubationstiden mellan fraktioner. Se till att de hela 2 mL passerar genom kolumnen före varje efterföljande eluering steg.
  7. i detta skede bekräfta proteinet av intresse är närvarande i de eluerade fraktionerna av Coomassie blå-färgade sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) genom metoden med Laemmli 47. Bedöma protein storlek, kvantitet och renhet i jämförelse mot standard molekylvikt markör band som båda mindre än och större än de förväntade molekylvikten av proteinet sevärdheter.
  8. Pool de eluerade protein fraktionerna i en dialys membran med en 3500 Da molekylvikt cutoff och inkubera i 1 L vika buffert (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl 2, pH 8) vid 4 ° C över natten medan bufferten rörs av en magneti c omrörare.
  9. Efter ~ 16 h vika tid, lägga till ~ 1 U av trombin per mg protein direkt till dialys påsen och inkubera vid 4 ° C för en ytterligare ~ 24 h.
  10. Kontrollera omfattningen av det 6 × hans tag klyvning av Coomassie-blå färgning ~ 15 μL protein alikvoter tas från dialys påsen före och efter inkubation med trombin som är electrophoresed på denatureringen polyakrylamidgeler (SDS-PAGE) med hjälp metoden av Laemmli 47. Om en ~ 2 kDa Skift i migreringen observeras motsvarar molekylvikten för den klyvs 6 × hans tagg, Fortsätt till steg 3.11; om en bråkdel av osmält protein kvarstår som detekteras av Coomassie-blå färgning, lägga till ~0.2 U av trombin per mg protein direkt till dialys påsen och inkubera vid 4 ° C för en ytterligare ~ 24 h.
  11. Användning storlek uteslutning eller jonbyte kromatografi att ytterligare rena proteinet. För anjon exchange kromatografi av EFSAM, ta bort protein lösningen från dialys väska och koncentrat ~ 10-faldig med en ultrafiltrering centrifugal koncentrator med en 10.000 Da molekylvikt cutoff. Därefter åter späd lösningen ~ 20-fold i en NaCl-fri buffert (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8).
  12. Jämvikta en färdigförpackade anjon Jonbytarkolonnen med 10 kolumn volymer av NaCl-fri bufferten beskrivs i steg 3.11. Jämvikta med buffert laddas in en luer-lock spruta innehåller inga luftbubblor genom att trycka lösningen genom kolumnen i ett droppvis sätt och undvika sprutan tryck som orsakar stadig strömmar av lösning spännande kolumnen. Använd en stark anjonbytaren (e.g. tvärbundna agaros med Kvartära ammoniumsalter funktionella grupper).
  13. Laddar i protein lösning utspädd i NaCl-fri buffert (steg 3.11) på kolumnen som beskrivs i steg 3.12.
  14. Eluera proteinerna i en övertoning [dvs 0 - 60% (v/v)] öka NaCl buffert (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8) använder en två-pump snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) system. Ställa in FPLC systemet att samla in ~1-1.5 mL fraktioner och övervaka protein eluering profilen med UV-280 nm absorbans och en flödeshastighet 0,5 mL/min.
  15. Identifiera eluering toppar och fraktioner som innehåller proteinet av intresse liksom protein renhetsgrad Coomassie blå-färgade SDS-PAGE geler genom metoden med Laemmli 47.
  16. Pool fraktioner visar > 95% (dvs tagit som fraktioner som visar endast ett enda protein band på Coomassie-blå färgade geler) i dialys säck med exchange in experimentella buffert av intresse av dialys som beskrivs i steg 3.8.

4. Kemisk fastsättning av glukos-5-MTS till protein genom dialys.

  1. Förbered en 55 mM stamlösning av N-(β-D-glucopyranosyl)-N '-[2-methanethiosulfonyl) etyl] urea (glukos-5-MTS) genom upplösning 10 mg av föreningen i 500 μl av 100% (v/v) DMSO. Förvara oanvända glukos-5-MTS solubilized i DMSO vid -20 ° C.
  2. Förbered protein provet för ändring av dialyzing 1,5 mL ~ 60 μM protein till 1 L modifiering buffert som består av 20 mM moppar, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 och 0,1 mM TCEP, pH 8,3. Använda en dialys membran molekylvikt cutoff som är mindre än storleken på protein ändras (t.ex. använda en 3500 Da cutoff för de ~ 17500 Da EFSAM).
  3. Efter 24 h vid 4 ° C, överföra provet från dialys påsen i en mikrocentrifug rör. Lägg till DMSO-solubilized glukos-5-MTS till en slutkoncentration av 2 mM.
  4. Inkubera provet i mörkret för 1 h vid rumstemperatur. Under inkubationstiden 1 h blanda lösningen genom skonsam avlyssning av röret varje 10 min.
  5. Därefter åter utbyta proteinet in i slutliga experimentella bufferten innehåller inga reduktionsmedel genom dialys vid 4 ° C som beskrivs i steg 4.2 eller av centrifugal ultrafiltrering. För förfarandet för ultrafiltrering koncentrera ~1.5 mL protein provet < 0,5 mL och späd därefter i samma anrikningsverket med experimentella bufferten. Upprepa detta koncentration-utspädning två extra gånger så att det totala utbytet är minst 30 × 30 × 30 = 27,000-fold. Använd 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7.5 som experimentella bufferten för EFSAM,.
  6. Förbereda provet för elektrospray masspektrometri jonisering av dialys eller ultrafiltrering utbyte enligt beskrivningen i steg 4.2 och 4.5, respektive i hjorthornssalt 25 mM eller 25 mM ammoniumacetat. Om du använder dialys, säkerställa du byta minst tre gånger för att avlägsna resterande NaCl och CaCl 2 salter.
  7. Bestämma den exakta massan (dvs ± 1 Da) av proteinet sevärdheter med elektrospray jonisering mass spectrometry 48 , 49. Räkna varje kovalent glukos tillägg till en Cys thiol via den methanethiosulfonate kemiskt att lägga 281.3 Da till proteinet massa (dvs lägga till 360.4 Da för glukos-5-MTS och subtrahera 79,1 Da för CH 3 så 2 lämnar gruppen under kovalent bifogad fil).

5. Lösning NMR bedömning av modifing effektivitet och strukturella störningar.

  1. Se till att koncentrationen av den modifierade protein är > 100 μM efter glukos fastsättning och slutligt buffertvärde exchange. För EFSAM, uppskatta proteinkoncentration med en UV extinktionskoefficient vid 280 nm 1,54 (mg mL – 1) cm – 1.
  2. Tillägg protein lösningen med 60 μM av 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syra (DSS) för mellanlägg och puls kalibrering och 10% (v/v) D 2 O för signal lås. För hög signal-brus-användning 600 μL prover i frekvens-matchade 5 mm NMR rör, infogas en minsta 600 MHz spektrometer utrustad med en trippel resonans HCN kryogen sond.
  3. Samla standard 1 H - 15 N HSQC spectra som tidigare detaljerade 50 , 51 på temperatur, 1 H och 15 N sopa bredder, övergående och öka inställningar som är lämpliga för det särskilda provet. För EFSAM spectra, användning 20 ° C, 256 1 H transienter, 64 15 N dimension steg och 1 H och 15 N sopa bredder ställa till 8.000 och 1 800 Hz, respektive.
  4. Efter förvärvet av glykosylerat protein spektrumet, tillsätt Ditiotreitol (DTT) NMR från en 1 M lager till en slutlig koncentration på 15 mM. DTT raderar glukosenhet proteinet genom minskning av disulfid-medierad kvarstad.
  5. Skaffa en andra 1 H - 15 N HSQC enligt dessa minskas/omodifierad villkor, som tillhandahåller en referens spektrum för att bedöma modifiering effektivitet och strukturella störningar orsakade av glukos tillbehöret.
  6. Bearbeta NMR data med hjälp av NMRPipe som tidigare närmare 52. Säkerställa att bearbetning minimalt innefattar datakonvertering, fasa, lösningsmedel förtryck, Fouriertransform och inledande visualisering av spectrana.
  7. Bedöm modifiering effektivitet genom att mäta amide peak stödnivåer och kemisk förskjutning värden i modifierad och minskad spektra med NEASY plugin på CARA 53. Se till att utvärdera peak intensiteten av den Cys amide både i glukos fäst och minskad spectra. Om den Cys amiden kan inte tillförlitligt i båda spektra, använda rester intill Cys stödnivåerna som en avläsning.
  8. Beräkna effektiviteten som intensiteten av amiden från Cys-modifierade spectrumen dividerat med intensiteten av amiden från Cys-reducerad (dvs DTT-behandlade) spektrumet, multiplicerat med 100:
    Equation 1, där m är intensiteten av amiden i Cys-modifierade spektrum och jag R är intensiteten i amiden i Cys-reducerad spektrumet. Alternativt, utvärdera genomsnittliga effektiviteten över flera amide topparna:
    Equation 2, där effektiviteten i är separat fastställda verkningsgrad beräknas för varje rester, i, och n är det totala antalet restprodukter som används i beräkningen.
  9. Beräkna Kemisk förskjutning störningar (CSP) från kemisk förskjutning skillnader mellan två spektra observeras i 15 N och 1 H mått av varje topp och normalisera för större 15 N kemiska förskjutningen utbud med den följande ekvation:
    Equation 3, där ΔH är ppm förändringen i dimensionen proton och ΔN är ppm förändringen i dimensionen kväve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det första steget i detta tillvägagångssätt kräver mutagenicitet av kandidat glycosylation rester till Cys resthalter som kan vara modifierbara använder den glukos-5-MTS. EFSAM har inga endogena Cys-rester, så inga särskilda överväganden måste göras före den mutagenes. Infödda Cys rester måste dock vara muterat till icke-ändringsbara rester innan du utför beskrivs kemi. För att minimalt effekt infödda struktur, föreslår vi att utföra en global ordning justering av proteinet av intresse och att bestämma vilka andra restprodukter är hittade de flesta ofta på den endogena Cys läge lägen. CYS mutation till dessa andra restsubstanser som förekommer naturligt i andra organismer kan ha minst påverkan på proteinstruktur. Om det endogena Cys-rest är strikt bevarad, föreslår vi muterar till Ser som den mest strukturellt liknar Cys. Figur 1 visar en typisk PCR mutagenes gel utvärdering av framgången av PCR-reaktionen, med de amplifierade DNA-prov som visar several-fold högre intensitet än en kontroll oförstärkta mall pET-28a DNA som används för PCR. Nästa steg inkluderar mallen DNA nedbrytning och omvandling till E. coli för plasmid reparation. Efter plasmid förökning i flytande kultur, plasmid isolering och bekräftelse av Function"-mutation(er) av sekvensering, kan muterade vektorn användas för proteinuttryck. Figur 2A visar en typisk eluering profil av EFSAM från kolumnen anjon utbyte i förhållande till ökande NaCl koncentrationer. Figur 2B visar renheten av EFSAM på Coomassie blå-färgade SDS-PAGE geler.

Efter att förvärva rent protein, är en serie dialys steg används för att fästa glukosenhet via MTS reaktionen med den gratis thiol. Figur 3A visar en bild av den typiska setup av ett litet protein volym förseglade i dialysen membran av membran klipp och som ingår i en stor 1 L bägare som innehåller bufferten av intresse. En inledande kontroll av framgången av ändringen kan utföras av masspektrometri. Figur 3B visar representativa elektrospray masspektrum av EFSAM modified på en enda Cys-thiol. Efter etableringen av protokollet för ett specifikt protein, modifiering effektivitet och strukturella störningar kan bedömas utifrån ett enda enhetligt 15N-märkt provet. 1H -15N-HSQC spektrumet är förvärvat före och efter tillsats av reduktionsmedel DTT (figur 4A). Beräkningar av modifiering effektivitet kan göras via en jämförelse av Amid peak stödnivåerna i modifierad och minskad spektra som beskrivs i protokollet steg 5,8 (figur 4B). Slutligen, när Kemisk förskjutning uppdrag är kända för ett protein, landstrategidokument som korrelerar med strukturella förändringar kan beräknas enligt beskrivning i steg 5,9 (figur 4 c).

Figure 1
Figur 1: DNA agarosgel visar förstärkning kontroll av mallen vektor med mutagena grundfärger.
Bilden visar en 1,0% (w/v) agarosgel med DNA-markör (M), vector kontroll (VC) och PCR-förstärkta mall (PCR). DNA separerades genom elektrofores vid 120 V för 45 min i 0,5 x TAE buffert. Totalt 0,5 ng av VC lästes, motsvarar mängden mall laddas in PCR körfältet. Gelen var målat med etidiumbromid (~0.5 μg/mL) för 20 min före visualisering i UV-belysning (302 nm). Gelen visar en hög nivå av amplifierade DNA nära den förväntade storleken på vektorn (svart pil). Andra bandet i PCR-körfält kör mellan 1.000 och 1.500 bp markör banden sannolikt representerar ett icke-specifikt amplifierade PCR-produkten. Intensitetsnivån amplifierade DNA måste vara högre än VC intensitetsnivå anses vara framgångsrika. Flera andra DNA-färgämnen kan användas som mindre mutagena, säkrare alternativ till etidiumbromid bromid färgning (se till exempel 57). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Typiska kromatografisk rening och renhet kontrollera för STIM1 EF-SAM.
(A) anjon exchange kromatografi eluering profil av STIM1 EF-SAM. Efter manuell bindning används EF-SAM att anjon Jonbytarkolonnen (Q FF) vid grundläggande pH och låg NaCl koncentration med en spruta och AKTA FPLC (GE Healthcare) för att eluera proteinet med NaCl lutning. Elueringen övervakas av den AKTA med UV-280 nm signalen via en 0-60% (v/v) gradient av 1 M NaCl. (B) Coomassie blå-färgade SDS-PAGE gel av eluering fraktioner från (A). Denatureringen protein gelen avslöjar att EF-SAM eluerar i två stora toppar på ~ 250 mM och ~ 450 mM NaCl. Rening protokollet ger > 95% ren EF-SAM vilket bevisas av avsaknaden av eventuella föroreningar bandet visar i Coomassie blå-färgade gel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Dialys setup och bekräftelse av in vitro- protein glycosylation.
(A) typiska dialys installationsprogrammet används för in vitro- fastsättning av glukos till den Cys thiol via MTS reaktivitet. Bilden visar ~1.5 mL protein som finns i dialys slangar buffrad mot ~ 1 L av experimentella buffert. Det är viktigt att bufferten är ständigt rörs för att säkerställa fullständig exchange. Bilden visar en mikrocentrifug rör klippt till överskott dialys slangar att förhindra förlisningen av dialys påsen och skada genom den roterande rör bar. (B) elektrospray jonisering masspektrum av proteinet modifierade Asn171Cys EF-SAM. Masspektrometri är en bekväm och exakt metod att bedöma huruvida förfarandet för ändring var framgångsrik. Ett typiskt kromatogram av massa visas med de teoretiska och uppmätta massorna av oförändrad och modifierade Asn171Cys EF-SAM anges. Majoriteten av provet massa motsvarar en makromolekyl som ligger inom ~1.3 Da av beräknade teoretiska massan av glukos-konjugerad Asn171Cys EF-SAM. Data i (B) är ombyggt och modifierad från 42. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Lösning NMR bedömning av modifiering effektivitet och strukturella störningar från en enda NMR-provet.
(A) 1 H -15N-HSQC spektrala överlagring av glukos-konjugerad Asn131Cys EFSAM innan (röd crosspeaks) och efter (svart crosspeaks) tillägg av 15 mM DTT. Överlägget visar tydligt flera rester-specifika amide kemiska skiftbyten vägledande båda modifiering av de protein- och strukturella störningar. Den röda rutan visar platsen för den Asn131Cys amiden. (B) zoomad bild av regionen 1H -15N-HSQC som innehåller de Asn131Cys amiden. Intensiteten i den Asn131Cys amide toppen i det modifierade spektrumet (IM) delas av intensiteten i reducerad (oförändrad) spektrum (IR) för beräkning av effektivitet (visas). En beräkning av genomsnittlig effektiviteten av flera verkställda rester ger en bättre uppskattning av effektivitet, inbegripet en fel uppskattning. Genomsnittliga effektiviteten visas Asn131Cys EFSAM baserat på 5 rester (dvs 129-133). (C) Normalized Kemisk förskjutning störningar orsakade av glukos konjugering till proteinet Asn131Cys EFSAM. Uppsättningen av HSQC experiment samlat på ett enda prov innan och efter komplettering med reduktionsmedel inte bara ger en bekväm uppskattning av modifiering effektivitet genom peak intensitet analys [visas i (B)], men ger också data för utvärdering av de strukturella förändringar i samband med ändringen. Glukos konjugation orsakar de största störningar lokaliserade nära position 131; analysen visar dock att störningar som är oväntade enbart baserat på sekvens närhet, som anger värdet i denna analys. Data i (C) är ombyggt och modifierad från 42. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

STIM1 mutationen riktningb DNA sekvensc
Asn131Cys framåt 5'-GTCATCAGAAGTATACTGTTGGACCGTGGATGAGG-3'
Asn131Cys omvänd 5'-CCTCATCCACGGTCCAACAGTATACTTCTGATGAC-3'
Asn171Cys framåt 5'-CCAAGGCTGGCTGTCACCTGCACCACCATGACAGGG-3'
Asn171Cys omvänd 5'-CCCTGTCATGGTGGTGCAGGTGACAGCCAGCCTTGG-3'
en STIM1 aminosyra numrering baseras på NCBI anslutning AFZ76986.1.
b 'Omvända' primern motsvarar sekvensen omvänd komplement grundfärgens 'framåt'.
c Understrukna kodon triplett motsvarar Cys mutationen.

Tabell 1. Exempel oligonukleotiden (primer) sekvenser för Asn till Cys mutagenes inom den pET-28a STIM1 EFSAM konstruera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein glycosylation är en post-translationella ändring där socker är kovalent kopplade till polypeptider främst genom kopplingar till aminosyra sida kedjor. Så många som 50% av protein från däggdjur är glykosylerat 54, där glykosylerat proteinerna kan därefter ha ett varierat utbud av effekter från att ändra Biomolekylär affinitet, påverka protein vikning, att ändra kanal verksamhet, inriktning molekyler för nedbrytning och cellulära människohandel, för att nämna några (över33). Den viktiga rollen som glycosylation i däggdjur fysiologi framgår av de flera hundratals proteiner som utvecklats för att bygga hela mångfalden av däggdjur glycan strukturer 33. Förändrade N- och O- glycosylation mönster har associerats med talrika sjukdom anges inklusive prostata (ökad och minskad), bröst (och minskade), lever (ökat), cystor (ökat), bukspottskörteln (ökat) och gastric cancer (ökad) 55. Dessutom glycosylation Tau, huntingtin, α-synuclein har konstaterats för att reglera toxicitet av dessa proteiner som är associerad med Alzheimers, Huntingtons, Parkinsons sjukdomar 56, och en grupp av medfödda störningar av glycosylation har varit identifierat som härrör från ärftliga defekter i enzymer som medlar glycosylation 54. Således har förstår exakt biofysiska, biokemiska och strukturella effekter för glycosylation potential att påverka enormt vår förståelse av protein reglering och funktion vid hälsa och sjukdom.

De tio socker byggstenarna som leder till mångfalden av glycan strukturer i de däggdjur glycome inkluderar fukos, galaktos, glukos, N- acetylgalaktosamin, N- acetylglukosamin, glukuronsyra, iduronic syra, mannos, sialic acid och xylos 33. Medan N- glycosylation länkar invariably en N- acetylglukosamin socker direkt till proteinet, kan O- glycosylation resultera från någon av N- acetylgalacotose, N- acetylglukosamin, xylos, fukos, glukos eller galaktos kovalent länkade till polypeptiden. Till att börja med att förstå hur dessa sockerarter omedelbart intill protein ytan påverkar de biofysiska och strukturella egenskaperna beskriver vi häri en strategi för att webbplats-selektivt bifoga sockerarter till Cys rester via de tioler som byggts in i proteinet sekvens. Här, dessa som är endogent glykosylerat ersättas med Cys och ändrades i vitro via en enkel kemisk metod. På detta sätt, får och flera glycosylation platser bedömas för att locka fram bidrag varje specifik webbplats samt de kumulativa ändringarna vikningen och stabilitet samt den övergripande struktur och funktion av protein.

Denna metod användes nyligen, framgångsrikt med EFSAM individuellt och kumulativt bedöma de Asn131 och Asn171 N- glycosylation platser 42roll. Mutation till Cys och kovalenta fastsättning av glukos till Asn131 eller Asn171 platser avslöjade en minskad Ca2 + affinitet och undertryckta stabilitet. När de två platserna samtidigt ändrades med glukos bilagan, minskningarna i bindande samhörighet och stabilitet var förstärkte leder till förbättrad oligomerisering benägenhet in vitro. Strukturellt, visade det tillvägagångssätt som beskrivs häri att ändringarna som Asn131 eller Asn171 ömsesidigt stör den core α8 helix ligger på domänen SAM, direkt anslutning till paret EF-hand. Denna strukturella analys utlägger hur glukos ändringar på ytan av protein leder till en konvergerande och potentierade strukturell förändring inom EF-hand: SAM gränssnitt som i slutändan destabiliserar proteinet och förbättrar SOCE 42.

Även om tillämpningen av denna webbplats-selektiv metod hjälpte belyser på hur en monosackarid nära ytan av EFSAM effekter vikning, stabilitet och struktur, detta förfarande kan enkelt modifieras för att bifoga längre kolhydrater specifika för ER, Golgi och PM lokalisering (dvs glycosylation staterna olika mognad), förutsatt att det är en tillförlitlig källa för dessa kolhydrater som innehåller funktionella grupper som kan länka till tioler såsom MTS. MTS är att föredra eftersom den thiol-ändringen är vändbar med en reduktionsmedel och en referens spektrum kan förvärvas lätt. Detta synsätt kan också anpassas till länka andra posttranslationella beståndsdelarna till proteinet såsom lipider. Samtidigt finns det flera begränsningar för detta tillvägagångssätt som bör övervägas. Första bygger metoden på mutation av glycosylation platser till Cys som kan påverka struktur, stabilitet och fällbara även i avsaknad av alla ändringar av glukos. Likaså måste infödda Cys rester i proteinet också vara muterade för att förhindra glukos tillbehöret på icke-glykosylerad platser. Dessutom finns tillägg av Cys rester ofta, som främjar inkludering kroppen bildas bakterier på grund av Cys crosslinking och Skellefteåsjukan, att göra rening mer utmanande. Dock ger denna webbplats-selektiv Cys-crosslinking metod beskrivs häri ett kontrollerad sätt att locka fram de strukturella, biokemiska och biofysiska effekterna av särskilda glycosylation platser i experiment som kräver höga nivåer av homogen protein. Effekterna av icke-infödda Cys rester på struktur, stabilitet och vikning kan enkelt fastställas i avsaknad av några ändringar i jämförelse till vildtyp protein attribut 42. Tillsammans med funktionella uppgifter som erhållits i eukaryota celler som uttrycker ändring-blockerande mutant versioner av proteinet (e.g. Asn-till-Ala), kommer att den för närvarande beskrivs strategin ge nya insikter i de strukturella mekanismerna av protein förordning av post-translationella modifieringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada (05239 till PBS), kanadensiska Institutet för Innovation/Ontario forskningsfond (till PBS), prostata Cancer slåss Foundation - Telus Ride för pappa (till PBS) och Ontario Graduate stipendium (till Y.J.C. och N.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), Epub 2005 May 2002 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L. Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. Agostinis, P., Afshin, S. , Bristol-Myers Squibb. Syracuse, NY. 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Immunologi fråga 128 glycosylation methanethiosulfonate cystein thiol modifiering stromal interaktion molekyl-1 EFSAM lösning kärnmagnetisk resonansspektroskopi masspektrometri
Inriktning cystein tioler för <em>in Vitro</em> platsspecifika Glycosylation av rekombinanta proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S.,… More

Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter