Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक उपंयास तीन आयामी इन विट्रो मॉडल, जहां corneal stromal कोशिकाओं और विभेदित न्यूरॉन कोशिकाओं को एक साथ संस्कृति के लिए परीक्षा और दो प्रकार के सेल की बातचीत की समझ में सहायता कर रहे हैं ।
Abstract
ऊतक इंजीनियरिंग काफी एक अनुमान के साथ १०,०००,००० दुनिया भर में corneal दृष्टि हानि से पीड़ित लोगों को मानव कॉर्निया प्रतिस्थापन के लिए उच्च मांग के कारण मांयता प्राप्त की है1। व्यवहार्य मानव कॉर्निया की मांग को संबोधित करने के लिए, तीन आयामी (3 डी) ऊतक इंजीनियरिंग में उल्लेखनीय प्रगति2,3,4बनाया गया है । ये कॉर्निया मॉडल सरल monolayer सिस्टम से लेकर multilayered मॉडल तक, 3d पूर्ण मोटाई corneal समकक्ष2के लिए अग्रणी है ।
हालांकि, एक 3 डी ऊतक के संदर्भ में कॉर्निया के उपयोग के इन विट्रो रोग मॉडल में multilayered 3d corneal ऊतक संरचना, समारोह के लिए सादृश्य का अभाव है, और विभिंन प्रकार के सेल (यानी, तंत्रिका, नेटवर्किंग का अध्ययन उपकला, स्ट्रोमा, और endothelium)2,3. इसके अलावा, इन विट्रो कॉर्निया ऊतक मॉडल के लिए मांग दवा उत्पादों के लिए पशु परीक्षण को कम करने के प्रयास में वृद्धि हुई है । इस प्रकार, और अधिक परिष्कृत मॉडल के लिए आवश्यक है बेहतर प्रणाली मानव शारीरिक आवश्यकताओं के लिए मैच, और एक मॉडल है कि अधिक रोगी जनसंख्या के लिए प्रासंगिक है के विकास बिल्कुल आवश्यक है । यह देखते हुए कि कॉर्निया में एकाधिक कोशिका प्रकार के रोगों और dystrophies, जैसे Keratoconus, मधुमेह Keratopathy, और Fuchs से प्रभावित कर रहे हैं, इस मॉडल से स्वस्थ दानदाताओं और न्यूरॉन्स से प्राथमिक मानव corneal fibroblasts (HCFs) के एक 3 डी सह संस्कृति मॉडल शामिल श-SY5Y सेल लाइन । यह हमें पहली बार मानव corneal ऊतक के भीतर दो सेल प्रकार के बीच बातचीत की जांच करने के लिए अनुमति देता है । हमें विश्वास है कि इस मॉडल संभावित अंतर्निहित टुकड़े corneal रोगों के stromal-तंत्रिका बातचीत के साथ जुड़े तंत्र है कि तंत्रिका क्षति प्रदर्शन कर सकता है । इस 3 डी मॉडल vivo में corneal ऊतक के बुनियादी संरचनात्मक और शारीरिक प्रकृति दर्पण और corneal दोषों की जांच के रूप में अच्छी तरह से पशु परीक्षण से पहले विभिन्न एजेंटों की प्रभावकारिता स्क्रीनिंग के लिए एक उपकरण के रूप में भविष्य में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
मानव शरीर में कॉर्निया सबसे घनी innervated ऊतक है । नसों स्पर्श, दर्द, तापमान की तरह विभिंन उत्तेजना के लिए जिंमेदार हैं, और यह भी घाव भरने में एक आवश्यक भूमिका है, पलक सजगता, आंसू उत्पादन, और स्राव5,6,7। कॉर्निया में, stromal तंत्रिका चड्डी के अंग जाल से उठता है और परिधीय corneal स्ट्रोमा रेडियल दर्ज करें । stromal तंत्रिका संगठन कोलेजन lamellae के समानांतर है और वे छोटे fascicles में आगे शाखा के रूप में वे सतही स्ट्रोमा5,8की दिशा में आगे बढ़ना । तंत्रिका तंतुओं आगे उपकला परत घुसना और इस प्रकार, इन्नेर्वतिओन व्यापक रूप से corneal उपकला और स्ट्रोमा भर में फैल गया है. इसलिए, इन्नेर्वतिओन कॉर्निया की स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्य में एक आवश्यक भूमिका है । इस प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो मॉडल में एक उपन्यास 3d की उन्नति प्रकट करते हैं, जो vivo stromal-तंत्रिका बातचीत में नकल करने के लिए अपनी तरह का पहला है । एसएच-SY5Y सेल लाइन इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में यह सबसे स्थापित, अच्छी तरह से चरित्र के लिए ंयूरॉंस विकास का अध्ययन किया लाइनों में से एक है । एसएच-SY5Y सेल लाइन दोनों सब्सट्रेट अनुयाई (एस प्रकार) और neuroblastic (एन-प्रकार) कोशिकाओं है कि transdifferentiation9से गुजरना कर सकते हैं उत्पादन करने के लिए बताया गया है । एक परिणाम के रूप में, भले ही इस सेल लाइन N-प्रकार की कोशिकाओं के एक ट्रिपल क्रमिक उपक्लोन चयन से व्युत्पंन है, यह भी एस प्रकार की कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में retinoic एसिड और मस्तिष्क के उपयोग के माध्यम से ंयूरॉंस में भिंनता के दौर से गुजर करने में सक्षम-व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर९. यह एक उपकरण है कि मधुमेह रेटिनोपैथी (डीएम) और अंय नेत्र रोगों के साथ जुड़े corneal जटिलताओं का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते है प्रदान करता है । नेत्र रोग के साथ रोगियों से प्राप्त करने और संवर्धन न्यूरॉन्स के साथ जुड़े कठिनाइयों के कारण, इस 3 डी इन विट्रो मॉडल में काफी निहितार्थ प्रदान करता है ंयूरॉन बातचीत का अध्ययन और corneal स्ट्रोमा के साथ संकेत ।
रोगग्रस्त स्थितियों अक्सर एक बहुत बड़े पैमाने पर शरीर के विभिन्न ऊतकों को प्रभावित, जीवन का एक समझौता गुणवत्ता के लिए अग्रणी. नेत्र dystrophies आम अक्सर प्रणालीगत रोगों के साथ जुड़े और दृश्य तीक्ष्णता या भी स्थाई दृष्टि हानि के नुकसान के लिए नेतृत्व कर रहे हैं । व्यापक अध्ययन अक्सर रोग हालत की एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है और साथ ही बेसल सेलुलर स्तर पर प्रभाव । इस तरह के रोगों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, vivo में विभिन्न और इन विट्रो मॉडल ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की मदद से विकसित किया गया है. Corneal ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों विज्ञान के विभिंन क्षेत्रों में बहुत रुचि हुई है10,11,12,13,14, लेकिन वहां अब भी कर रहे है प्रमुख सीमाओं के दौरान वास्तविक आवेदन, corneal भ्रष्टाचार खारिज, संक्रमण सहित, और scarring10,11,12,13,14। वहां कई अध्ययनों कि सफलतापूर्वक विकसित किया है और विभिंन इन विट्रो मॉडल3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. इन विट्रो मॉडल में 3 डी सबसे होनहार और महान वैज्ञानिक हित के हैं । 3 डी मॉडल बेहतर दर्पण के लिए जाना जाता है vivo में सेलुलर और शारीरिक घटनाओं है कि फाइब्रोसिस और घाव भरने के दौरान महत्वपूर्ण हैं15,27,28,29. इन विट्रो में मॉडल corneal जटिलताओं सहित विभिंन रोग की स्थिति के इलाज के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण खोजने में एक अभिंन भूमिका निभाते हैं । corneal कार्यों में इन्नेर्वतिओन की महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, थोड़ा प्रयास करने के लिए corneal ऊतक के भीतर परिधीय तंत्रिका प्रसार को बढ़ावा देने के लिए किया गया है-इंजीनियर2निर्माण,3। हालांकि, प्रस्तावित 3 डी इन विट्रो सेल का निर्माण लक्ष्य ऊतक की नकल के क्रम में वांछित ऊतक कार्यशीलता को प्राप्त करने के लिए ।
जबकि मधुमेह keratopathy मॉडल के लिए एक स्पष्ट आवेदन यहां वर्णित है न्यूरॉन दोषों के कारण, वहाँ कई अन्य corneal रोगों है कि Keratoconus और Fuchs dystrophies सहित एक मानव इन विट्रो मॉडल से लाभ उठा सकते हैं. हमारे 3 डी मॉडल इस संभावना से उभर और corneal ऊतक के एक इन विट्रो प्रतिनिधित्व के विकास का प्रस्ताव दवा वितरण और नई नेत्र दवाओं की सुरक्षा का आकलन करने के लिए ।
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Protocol
यह प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय के ओकलाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र/संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी #4509) के दिशानिर्देशों का पालन करता है । प्रोटोकॉल के सभी भागों हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों से मुलाकात की । Corneal नमूने राष्ट्रीय विकास और अनुसंधान संस्थान (NDRI) और ओकलाहोमा लायंस नेत्र बैंक से प्राप्त किए गए.
1. प्राथमिक कोशिकाओं का अलगाव
- मानव कॉर्निया ऊतक के नमूनों की प्राप्ति पर, एक २१.५ सेमी2 पेट्री डिश में बाँझ Dulbecco की फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) (1x) के 2 मिलीलीटर से युक्त ऊतकों हस्तांतरण ।
- परिमार्जन और स्थिति कॉर्निया डोम चेहरा अप द्वारा corneal उपकला हटा दें । पूरा हटाने सुनिश्चित करने के लिए, अच्छी तरह से एक ४५ डिग्री कोण पर एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर उपकला परत परिमार्जन । अगले, कॉर्निया गुंबद चेहरा नीचे फ्लिप और अच्छी तरह से एक ४५ डिग्री कोण पर एक उस्तरा ब्लेड के साथ स्ट्रोमा से endothelium बंद परिमार्जन को पूरा हटाने सुनिश्चित करते हैं । stromal टिशू को DPBS से धो लें ।
- stromal ऊतकों को छोटे टुकड़ों में काटें, एक नंबर 10 सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग करें, DPBS का प्रयोग करते हुए stromal के टुकड़े गीले रखे । stromal टुकड़ों को बाँझ संदंश के साथ उठाओ और मीडिया के बिना एक T25 संस्कृति कुप्पी में जगह (4 या 5 टुकड़े की कुप्पी प्रति 2 x 2 मिमी ऊतक).
- explants के बारे में 30-40 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी के नीचे का पालन करने की अनुमति दें । एक बार पालन, धीरे ईगल की न्यूनतम आवश्यक माध्यम (EMEM) युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और explants को परेशान किए बिना कुप्पी के लिए 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic शामिल हैं ।
- धीरे ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2पर मशीन में कुप्पी जगह है । जब तक कोशिकाओं को अलग और कुप्पी में पलायन शुरू explants परेशान छोड़ दें । लगभग 2-4 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को १००% संगम तक पहुंचना चाहिए । १००% संगम पर, ऊतक संस्कृति मीडिया को हटाने और DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने से कोशिकाओं बीतने ।
- कोशिकाओं को trypsin जोड़ें और फिर उंहें 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । लगभग 5 मिनट के बाद, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत कोशिकाओं को देखने के लिए पुष्टि करते है कि वे अलग है, और फिर ताजा मीडिया जोड़कर प्रोटियोलिसिस रोक ।
- १,००० x g पर केंद्रापसारक के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण supernatant सावधानी से गोली परेशान बिना निकालें और ताजा EMEM में कोशिकाओं को निलंबित 10% FBS 1% एंटीबायोटिक । कोशिकाओं और बीज के बारे में 1 x 106 कोशिकाओं T75 संस्कृति कुप्पी में ताजा EMEM 1% FBS 1% एंटीबायोटिक के साथ आगे विस्तार के लिए गिनती ।
2. प्राथमिक HCFs कल्चर और 3डी construction Assembly
- explants से 3 डी निर्माण इकट्ठा करने के लिए पहले EMEM 10% FBS 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic, बीतने और गिनती HCFs में उगाया ।
- बीज लगभग 1 x 106 कोशिकाओं/०.४ के साथ पाली कार्बोनेट झिल्ली आवेषण पर प्राथमिक HCFs के µm-3 डी constructs से pores, ताजा EMEM 10% FBS के १.५ मिलीलीटर के साथ-साथ निर्माण के शीर्ष करने के लिए 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic । एक ही मीडिया के एक निर्माण के नीचे करने के लिए एक और १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
- सेल सीडिंग के 24 ज के बाद, संस्कृति EMEM के साथ कोशिकाओं 10% FBS 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic, ०.५ mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic एसिड के साथ उत्तेजित (विटामिन सी) शीर्ष पर १.५ मिलीलीटर और १.५ मिलीलीटर जोड़कर प्रत्येक के निर्माण के तल पर ।
- ३७ ° c, 5% सह पर एक मशीन में संस्कृतियों को बनाए रखने के 3 सप्ताह के लिए2 और पूरे अध्ययन अवधि के दौरान ताजा मीडिया हर दूसरे दिन की आपूर्ति । आगे बीतने की जरूरत नहीं है ।
3. सेल भेदभाव और सह संस्कृतियों
- 3 हफ्तों के बाद, 8 x 103 कोशिकाओं को जोड़ने/पहले इकट्ठे 3 डी के शीर्ष पर SY5Y मानव neuroblastoma कोशिकाओं के १.५ मिलीलीटर युक्त EMEM के 10% FBS, 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic, और ०.५ मिमी 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic एसिड (विटामिन सी) ।
- SH-SY5Y neuroblastoma कक्षों को कक्ष विभेद आरंभ करने से पहले कम से 24 h के लिए कॉर्निया stromal कोशिकाओं के शीर्ष पर बढ़ने की अनुमति दें ।
- EMEM 1% FBS और निर्माण के शीर्ष पर 10 µ एम Retinoic एसिड की मिलीलीटर से युक्त कोशिकाओं उत्तेजक द्वारा एसएच SY5Y सेल भेदभाव शुरू । EMEM के १.५ मिलीलीटर जोड़ें 10% FBS 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic ०.५ mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic एसिड (विटामिन सी) के नीचे करने के लिए निर्माण । ध्यान दें कि Retinoic एसिड कदम अंधेरे में किया जाना चाहिए ।
- संस्कृति के लिए इस भेदभाव मीडिया में 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को जारी रखें ।
- जब कोशिकाएं भिंनता चरण तक पहुंचती हैं, तो कक्षों को सीरम-मुक्त मीडिया के १.५ मिलीलीटर पर स्विच करें जिसमें मस्तिष्क के 2 एनएम-व्युत्पन्न neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ) और 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic को EMEM में जोड़ा गया है, जो निर्माण के शीर्ष पर जोड़कर । EMEM के १.५ मिलीलीटर जोड़ें 10% FBS 1% एंटीबायोटिक/Antimycotic ०.५ mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic एसिड (विटामिन सी) के नीचे करने के लिए निर्माण । ध्यान दें कि बीडीएनएफ कदम अंधेरे में किया जाना चाहिए ।
- किसी भी आगे के विश्लेषण के लिए संसाधित करने से पहले 2 अतिरिक्त दिनों के लिए कक्षों को तालिका 1में दर्शाया गया है ।
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Representative Results
चित्रा 1 इन विट्रो मॉडल में काम कर रहे 3 डी का एक कदम दर कदम प्रतिनिधि छवि है । पहले चरण में, कोशिकाओं को मानव कॉर्निया से अलग कर रहे हैं । फिर, वे एक पाली कार्बोनेट झिल्ली पर बड़े हो रहे है और विटामिन सी के साथ उत्तेजित करने के लिए एक आत्म गुप्त 3 डी मैट्रिक्स इकट्ठा । इस 3 डी का निर्माण प्रणाली vivo-like stromal मैट्रिक्स मेंएक multilayered सेलुलर के संश्लेषण लाती है । इसके बाद, neuroblastoma कोशिकाओं stromal कोशिकाओं के शीर्ष पर बीज बोने की शुरुआत के बाद ंयूरॉन कोशिका विभेद । इस corneal stromal कोशिकाओं और 3 डी में विभेदित न्यूरॉन कोशिकाओं की सह संस्कृति की ओर जाता है इन विट्रो मॉडल. चित्रा 2 उच्च आवर्धन संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) 3 डी स्वयं इकट्ठे निर्माण की छवि (चित्रा 2a) पाली कार्बोनेट झिल्ली और corneal stromal कोशिकाओं शीर्ष पर वरीयता दिखा रहा है, एक स्वयं इकट्ठा मैट्रिक्स द्वारा (चित्रा बी) विभेदित न्यूरॉन कोशिकाओं के बाद एक stromal न्यूरॉन सेल व्यवस्था दिखा शीर्ष पर वरीयता प्राप्त. छवि में तीर न्यूरॉन कोशिकाओं को दिखाते हैं । corneal स्ट्रोमा और न्यूरॉन कोशिकाओं के बीच प्रत्यक्ष crosstalk को देखते हुए, हमारा मानना है कि corneal दोषों के नियमन को प्रभावित करने वाले प्रमुख खिलाड़ी स्ट्रोमा परत में मौजूद हैं । इसलिए, इस मॉडल को प्रस्तुत करता है एक मानव ंयूरॉन इन विट्रो मॉडल में अंतर एसएच SY5Y neuroblastoma कोशिकाओं के साथ संयोजन द्वारा एक स्थाई ंयूरॉन आकृति के हमारे पहले से स्थापित 3d मॉडल के extracellular मैट्रिक्स (ECM) के साथ संवर्धन विभिंन कारकों विभेदन । इस प्रकार, हमें संदेह है कि इस मॉडल रूपात्मक और स्वस्थ और रोगग्रस्त ECM के बीच आणविक मतभेदों के भविष्य के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा । हमें विश्वास है कि इस उपंयास 3 डी इन विट्रो मॉडल में मदद मिलेगी टुकड़े corneal स्ट्रोमा के महत्वपूर्ण पहलुओं-तंत्रिका corneal विकृति के साथ जुड़े बातचीत और नए चिकित्सकीय के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त ।
चित्र 1: एक कदम-वार तरीके से इन विट्रो सह-संस्कृति मॉडल में 3d दर्शाने वाली छवि । इस छवि को मानव कॉर्निया से सेल अलगाव से पता चलता है, और stromal कोशिकाओं एक पाली कार्बोनेट झिल्ली पर वरीयता प्राप्त, 3d निर्माण में स्थित है, EMEM में संस्कृति और विटामिन सी के साथ उत्तेजित । इसके अलावा, विभेदित न्यूरॉन कोशिकाओं stromal कोशिकाओं के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त किया जा करने के लिए दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2:3 डी इन विट्रो प्रणाली में की उच्च आवर्धन उनि छवि । (क) Stromal कोशिकाओं को पाली कार्बोनेट झिल्ली के शीर्ष पर व्यवस्था । (ख) stromal कोशिकाओं के शीर्ष पर विभेदित ंयूरॉंस कोशिकाओं । स्केल बार्स = ५०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
विश्लेषण के लिए तकनीक | संभावित निहितार्थ |
मात्रात्मक रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन | जांच कोलेजन मार्करों (कर्नल मैं, कर्नल III, और कर्नल वी), fibrotic मार्कर अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA), और इंसुलिन विकास फैक्टर-1 (IGF-1) सहित डीएम में प्रमुख मध्यस्थों और यह रिसेप्टर (IGF1-R) है |
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी | संरचनात्मक परिवर्तन ऐसी कोलेजन तंतुओं और सेल-ECM बातचीत के रूप में जांच कर रहे है |
इम्यूनोफ्लोरेसेंस | विशिष्ट एंटीबॉडी का प्रयोग रासायनिक फ्लोरोसेंट डाई को संयुग्मित सेलुलर एंटीजन की जांच करने के लिए |
तालिका 1: विश्लेषण तकनीक ।
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Discussion
कई अध्ययनों विभिंन पशु मॉडल है कि मदद कर सकते है corneal रोगों की एक बेहतर समझ विकसित करने के साथ ही उपचार की खोज के विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया है । हालांकि, इन अध्ययनों से मनुष्यों के लिए एक महत्वपूर्ण मूल्य सत्यापित नहीं किया गया है । तारीख करने के लिए, विभिंन इन विट्रो मॉडल विकसित किया गया है और व्यापक रूप से उनके उल्लेखनीय नैदानिक महत्व के कारण की जांच की । हमारे इन विट्रो मॉडल में पहले से स्थापित 3 डी एक उपंयास प्रणाली है कि महत्वपूर्ण दृष्टि अनुसंधान में चिकित्सा विज्ञान प्रगति के लिए योगदान देता है और vivo घटनाओं में recapitulating के बेदाग क्षमता से पता चलता है इन विट्रो28 , 29 , 30. इस प्रोटोकॉल का उद्देश् य इस इन विट्रो corneal मॉडल की अगली पीढ़ी को विकसित करना है जिससे मधुमेह keratopathy, keratoconus जैसे corneal रोगों से जुड़ी जटिलताओं के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन किया जा सके , और Fuchs । ऐसी उंनति नए उपचार की खोज की दिशा में ठोस आधार प्रदान कर सकती है जो चिकित्सकीय रूप से बहुत आवश्यक है ।
इस मॉडल डीएम और अंय corneal रोगों में जगह लेने के विभिंन संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तन की पहचान करने में मदद कर सकते हैं । यह संभवतः रोग प्रबंधन के साथ मदद करने के लिए एक प्रारंभिक चरण में इन रोगों के लिए स्क्रीनिंग के लिए संभावना सहित पर्याप्त निहितार्थ, प्रदान करता है । यहां प्रस्तावित मॉडल सरल है, लेकिन यह बेहद अभिनव है । सबसे महत्वपूर्ण लाभ में से एक यह है कि corneal stromal कोशिकाओं के बजाय एक कृत्रिम वातावरण पर वरीयता प्राप्त किया जा रहा के अपने ECM को इकट्ठा करने के लिए अनुमति दी जाती है और । इसके अलावा, नसों को और अधिक सही मॉडल corneal stromal तंत्रिका बातचीत में अंतर करने की अनुमति दी है । अत: इस विधि से मानव corneal स्ट्रोमा और तंत्रिका संजाल का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करता है, साथ ही स्ट्रोमा वातावरण के भीतर रहने वाले कोशिकाओं को भी. इस सांस्कृतिक मंच जटिल कोशिका सेल और कोशिका मैट्रिक्स बातचीत की भविष्य की जांच की अनुमति है कि कॉर्निया के रोगग्रस्त राज्यों को प्रभावित करेगा । इन विट्रो मॉडल दृष्टिकोण में इस 3 डी रोग तंत्र में सुधार और उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए प्रत्याशित है, विशेष रूप से जब वर्तमान पारंपरिक संस्कृति प्रणालियों या पशु मॉडल की तुलना में ।
इन विट्रो मॉडल में इस 3d के वर्णित पीढ़ी भविष्य चिकित्सीय उपचार और खोजों के लिए मार्ग प्रशस्त होगा ।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।
Acknowledgments
हम अपने उनि प्रयोगों के साथ तकनीकी मदद के लिए डॉ बेन बहेलिया के लिए हमारी ईमानदारी धंयवाद विस्तार करना चाहते हैं ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
Wax block | VWR | 50-949-027 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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