Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hornhindevæv Engineering: En In Vitro Model af den menneskelige hornhinden stromale-nerve interaktioner

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/56308
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Denne protokol beskriver en ny tre-dimensionelle in vitro- model, hvor hornhinde stromale celler og differentieret neuronale celler dyrkes sammen til at bistå med gennemgang og forståelse af samspillet mellem to celletyper.

Abstract

Vævsmanipulering har fået betydelig anerkendelse på grund af den store efterspørgsel for menneskelige hornhinden udskiftninger med omkring 10 millioner mennesker verden over lider af cornea vision tab1. Til at håndtere efterspørgslen efter bæredygtige menneskelige hornhinder, store fremskridt i tre-dimensionelle (3D) væv er manipulation gjort2,3,4. Disse hornhinden modeller spænder fra simple éncellelag systemer til flerlaget modeller, fører til 3D full-tykkelse hornhinde ækvivalenter2.

Men brugen af en 3D væv-manipuleret hornhinden i forbindelse med in vitro- sygdomsmodeller studerede til dato mangler lighed med flerlaget 3D hornhindevæv struktur, funktion og netværk af forskellige celletyper (dvs., nerve, epitel, stroma og endotelet)2,3. Derudover steget efterspørgslen efter in vitro- hornhinden væv modeller i et forsøg på at reducere dyreforsøg for farmaceutiske produkter. Således mere avancerede modeller er forpligtet til at bedre at matche systemer til menneskets fysiologiske behov, og udviklingen af en model, der er mere relevant for den patientgruppe er absolut nødvendigt. Eftersom at flere celletyper i hornhinden påvirkes af sygdomme og dystrophies, Keratoconus, diabetisk keratopati og Fuchs, omfatter denne model en 3D Co kultur model af primære menneskelige hornhinde fibroblaster (HCFs) fra raske donorer og neuroner fra SH-SY5Y cellelinje. Dette giver os for første gang at undersøge interaktioner mellem to celletyper i den menneskelige hornhindevæv. Vi mener, at denne model potentielt kunne dissekere de underliggende mekanismer forbundet med stromale-nerve interaktioner af cornea sygdomme, der udviser nerve skader. Denne 3D model afspejler den grundlæggende anatomiske og fysiologiske karakter af hornhindevæv i vivo og kan bruges i fremtiden som et redskab til undersøge hornhinde defekter samt screening effekten af forskellige agenter før dyreforsøg.

Introduction

I den menneskelige krop er hornhinden det tættest innerverede væv. Nerverne er ansvarlige for forskellige fornemmelser som berøring, smerte, temperatur, og har også en væsentlig rolle i sårheling, blinke reflekser, rive produktion og sekretion5,6,7. I hornhinden, stromale nerve kufferter opstår fra den limbal plexus og indtaste den perifere hornhindens stroma radialt. Stromale nerve organisation er parallel for kollagen lamellae og de yderligere forgrening ind i mindre fascicles når de går videre mod overfladiske stroma5,8. Nervefibre yderligere trænge epitel lag og således innervation er bredt fordelt i hele hornhindens epitel og stroma. Derfor har innervation en væsentlig rolle i den raske og syge tilstand af hornhinden. I denne protokol afslører vi fremme af roman 3D in vitro- model, som er først af sin art til at efterligne i vivo stromale-nerve interaktioner. SH-SY5Y cellelinje blev brugt til denne undersøgelse, da det er en af de mest etablerede, godt karakteriseret linjer bruges til at studere neuronal vækst. SH-SY5Y cellelinje er blevet beskrevet til at producere både substrat tilhænger (S-type) og neuroblastic (N-type) celler der kan gennemgå transdifferentiation9. Som et resultat, selv om denne cellelinie er afledt fra en tredobbelt successive subclone udvalg af N-type celler, indeholder det også et lille antal S-type celler kan undergå en differentiering af neuroner ved hjælp af retinoid syre og hjerne-afledte neurotrope faktor9. Dette giver et værktøj, der kan føre til en bedre forståelse af cornea komplikationer forbundet med diabetisk retinopati (DM) og andre okulær sygdomme. På grund af vanskelighederne med at opnå og dyrkning neuroner fra patienter med okulær sygdomme giver denne 3D i vitro model store konsekvenser i at studere de neuronale interaktioner og signalering med hornhindens stroma.

Syge betingelser påvirker ofte forskellige væv i kroppen på en meget stor skala, fører til en kompromitteret livskvalitet. Okulær dystrophies er fælles komplikationer ofte forbundet med systemiske sygdomme og føre til tab af synsstyrken eller endda permanent synstab. Omfattende undersøgelser er ofte afgørende for en bedre forståelse af sygdom tilstand samt effekter på basal cellulært niveau. For at studere virkningerne af sådanne sygdomme, er forskellige i vivo og in vitro- modeller blevet udviklet ved hjælp af tissue engineering applikationer. Hornhindevæv ingeniørmæssige anvendelser har vundet stor interesse på tværs af forskellige områder af videnskab10,11,12,13,14, men der er stadig store begrænsninger i løbet faktiske anvendelse, herunder hornhinde pode afvisninger, infektioner og ardannelse10,11,12,13,14. Der er flere undersøgelser, der har med held udviklet og etableret forskellige in vitro- modeller3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. 3D in vitro- modeller er den mest lovende og af stor videnskabelig interesse. 3D-modeller er kendt for at bedre spejl i vivo cellulære og fysiologiske begivenhederne, der kritisk under fibrose og sår healing15,27,28,29. Modellerne i vitro spille en integrerende rolle ved at finde nye terapeutiske tilgange til behandling af forskellige sygdomstilstande, herunder hornhinde komplikationer. Trods den kritiske rolle af innervation i cornea funktioner, er der sket lidt indsats at fremme perifere nerve spredning i hornhinden væv-manipuleret konstruktioner2,3. Dog efterligne cellekonstruktioner foreslåede 3D in vitro- målvæv for at nå den ønskede væv funktionalitet.

Mens diabetisk keratopati er en indlysende ansøgning om modellen beskrevet her på grund af de neuronale defekter, er der flere andre corneal sygdomme, der kan drage fordel af en menneskelig i vitro model herunder Keratoconus og Fuchs dystrophies. Vores 3D model fremgår af dette perspektiv og foreslår udviklingen af en in vitro- repræsentation af hornhindevæv at vurdere medicinafgivelse og sikkerheden af nye okulær lægemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne i University af Oklahoma Health Sciences Center/institutionelle review board (IRB #4509). Alle dele af protokollen mødte grundsætningerne af Helsinki-erklæringen. Hornhinde prøver blev indhentet fra de nationale udvikling og Research Institute (NDRI) og Oklahoma løver Eye Bank.

1. isolering af primærelementer

  1. Ved modtagelsen af menneskelige hornhinden vævsprøver, overføre væv ind i en 21,5 cm2 petriskål indeholdende 2 mL sterilt Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) (1 x).
  2. Skrabe og fjerne hornhindens epitel af positionering hornhinden dome opad. For at sikre fuldstændig fjernelse, skrabe ud epitel lag grundigt ved hjælp af et barberblad i en 45° vinkel. Næste, flip hornhinden dome opad og grundigt skrabe off endotelet fra stroma med et barberblad i en 45° vinkel til at sikre fuldstændig fjernelse. Vask det stromale væv med DPBS.
  3. Skær stromale væv i små stykker, med et nummer 10 kirurgiske kniv, holder de stromale stykker våd på alle tid ved hjælp af DPBS. Afhente stromale stykker med steril pincet og sted i en T25 kultur kolbe uden medier (4 eller 5 stykker af 2 x 2 mm væv pr. flaske).
  4. Tillade explants at holde sig til bunden af kolben ved 37 ° C i om 30-40 min. Når overholdes, langsomt tilføje Eagles mindste afgørende medium (Maibritt VITH) indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotikum/Antimycotic til kolbe uden at forstyrre explants.
  5. Forsigtigt kolben i varmeskab ved 37 ° C, 5% CO2. Lad explants uforstyrret, indtil cellerne begynde at isolere og overflytning i kolben. Efter ca. 2-4 uger, bør celler nå 100% sammenløb. Ved 100% sammenløb, passage cellerne ved at fjerne vævskultur medier og cellerne vaskes med DPBS.
  6. Tilføje trypsin til cellerne og derefter inkuberes dem ved 37° C. Efter ca. 5 min., se celler under lysmikroskopi at bekræfte, at de er skilt, og derefter stoppe proteolyse ved at tilføje friske medier.
  7. Overføre cellesuspension ind i en 15 mL konisk rør til centrifugering ved 1.000 x g. Fjern supernatanten omhyggeligt uden at forstyrre pelleten og suspendere celler i frisk Maibritt VITH 10% FBS 1% antibiotika. Tælle cellerne og frø omkring 1 x 106 celler i T75 kultur kolbe for yderligere ekspansion med friske Maibritt VITH 1% FBS 1% antibiotika.

2. primære HCFs kultur og 3D konstruktioner forsamling

  1. For at samle 3D konstruktioner fra explants tidligere dyrket i Maibritt VITH 10% FBS 1% antibiotikum/Antimycotic, passage og Grev HCFs.
  2. Seed ca 1 x 106 celler/brønd af primære HCFs på polycarbonat membran skær med 0,4-µm porer fra de 3D konstruktioner, sammen med 1,5 mL frisk Maibritt VITH 10% FBS 1% antibiotikum/Antimycotic til toppen af konstruktionen. Tilføj en anden 1,5 mL af de samme medier til bunden af hver konstruktion.
  3. Efter 24 timer af celle såning, kultur celler med Maibritt VITH 10% FBS 1% antibiotikum/Antimycotic, stimuleret med 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syre (C-Vitamin) ved at tilføje 1,5 mL på toppen og 1,5 mL i bunden af hver konstruktion.
  4. Vedligeholde kulturer i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 til 3 uger og levere friske medierne hver anden dag under hele studieperioden. Der kræves ingen yderligere passage.

3. celle differentiering og co kulturer

  1. Efter 3 uger, tilføje 8 x 103 celler/brønd af SH-SY5Y humane neuroblastoma celler på toppen af den tidligere samlet 3D konstruktioner indeholdende 1,5 mL Maibritt VITH, som indeholder 10% FBS, 1% antibiotikum/Antimycotic, og 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syre (C-Vitamin).
    1. Tillad SH-SY5Y neuroblastoma celler til at vokse på toppen af hornhinden stromale celler i mindst 24 timer før indlede Celledifferentiering.
  2. Indlede SH-SY5Y Celledifferentiering ved at stimulere cellerne med Maibritt VITH indeholdende 1% FBS og 1,5 mL 10 µM retinsyre oven på konstruktionen. Der tilsættes 1,5 mL Maibritt VITH 10% FBS 1% antibiotikum/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syre (C-Vitamin) til bunden af konstruktionen. Bemærk at retinsyre trin skal udføres i mørke.
    1. Fortsat kultur celler i denne differentiering medier i 5 dage.
  3. Når cellerne kommer til differentiering fase, skifte cellerne til 1,5 mL serum-gratis medier indeholdende 2 nM af hjerne-afledte neurotrope faktor (BDNF) og 1% antibiotikum/Antimycotic tilføjet til Maibritt VITH, ved at føje til toppen af konstruktionen. Der tilsættes 1,5 mL Maibritt VITH 10% FBS 1% antibiotikum/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic syre (C-Vitamin) til bunden af konstruktionen. Bemærk at BDNF trin skal udføres i mørke.
  4. Kultur cellerne for 2 ekstra dage før behandling for nogen yderligere analyse som angivet i tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 er en trinvis repræsentativt billede af 3D i vitro arbejdsmodel. På det første trin er celler isolerede fra menneskets hornhinder. Derefter, de er dyrket på en polycarbonat membran og stimuleret med C-Vitamin til at samle en selvstændig udskilles 3D matrix. Denne 3D konstruktion system inducerer syntesen af et flerlaget cellulære i vivo-ligesom stromale matrix. Derefter, er neuroblastoma celler seedet på toppen af de stromale celler efterfulgt af indlede neuronal Celledifferentiering. Dette fører til fælles kultur af cornea stromale celler og differentieret neuronale celler i 3D i vitro model. Figur 2 er høj forstørrelse transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billede af 3D selvsamlede konstruktionen (figur 2A) viser polycarbonat membran og de hornhinde stromale celler seedede på toppen, udskiller en selvsamlede matrix efterfulgt af (figur 2B) differentierede neuronale celler seedede på toppen viser en stromale neuronal celle arrangement. Pilene på billedet viser de neuronale celler. Givet direkte krydstale mellem hornhindens stroma og neuronale celler, mener vi, at de centrale aktører, der påvirker forordningen af cornea fejl findes i stroma lag. Derfor, denne model præsenterer en menneskelig neuronal i vitro model differentiering SH-SY5Y neuroblastoma celler ind i en bæredygtig neuronal morfologi ved at kombinere det med vores tidligere etablerede 3D model af ekstracellulære matrix (ECM) dyrkning med forskellige differentiering faktorer. Dermed, vi har mistanke om, at denne model vil give fremtidige studier af de morfologiske og molekylære forskelle mellem raske og syge ECM. Vi mener, at denne nye 3D i vitro model kan dissekere afgørende aspekter af hornhindens stroma-nerve interaktioner forbundet med hornhinde patologi og bane vejen for udvikling af nye lægemidler.

Figure 1
Figur 1: illustrativt billede viser 3D i vitro co kultur model i en trinvis måde. Dette billede viser den celle isolation fra menneskelige hornhinden og stromale celler seedede på en polycarbonat membran, placeret i den 3D konstruktion, kulturperler i Maibritt VITH og stimuleret med c-Vitamin. Derudover er differentieret neuronale celler vist at være seedet på toppen af de stromale celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Høj forstørrelse TEM billede af 3D in vitro- system. (A) stromale celler arrangement på toppen af polycarbonat membran. (B) seedede opdelte neuronale celler på toppen af de stromale celler. Skalere barer = 500 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Teknikker til analyse Potentielle konsekvenser
Kvantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Undersøge kollagen markører (Col jeg, Col III og Col V), fibrotisk markør alpha-glat muskel aktin (α-SMA), og centrale mæglere i DM herunder Insulin vækstfaktor-1 (IGF-1), og det er receptor (IGF1-R)
Transmissions elektronmikroskopi Strukturændringer er undersøgt som kollagen fibriller og celle-ECM interaktioner
Immunfluorescens Brug af specifikke antistoffer kemisk konjugeret med fluorescerende farvestof at undersøge cellulære antigener

Tabel 1: Analyseteknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere undersøgelser har været fokuseret på at udvikle forskellige dyremodeller, der kan hjælpe med at udvikle en bedre forståelse af cornea sygdomme samt finde behandlinger. En betydelig værdi for mennesker fra disse undersøgelser er imidlertid ikke blevet bekræftet. Til dato, er forskellige in vitro- modeller blevet udviklet og udbredt undersøgt på grund af deres bemærkelsesværdige klinisk betydning. Vores tidligere etablerede 3D in vitro- model er en roman system, som væsentligt bidrager til medicinsk videnskab fremskridt i vision forskning og viser ubesmittede evne til recapitulating i vivo begivenheder i vitro28 , 29 , 30. Formålet med denne protokol er at udvikle den næste generation af denne in vitro- hornhinde model, der kan bruges til at studere cellulære og molekylære mekanismer af komplikationer forbundet med hornhinde sygdomme såsom diabetisk keratopati, keratoconus , og Fuchs. Sådanne avancement kunne give solide fundamenter til opdagelsen af nye behandlinger, der er stort behov for klinisk.

Denne model kan hjælpe med at identificere forskellige strukturelle og cellulære ændringer finder sted i DM og andre corneal sygdomme. Dette giver store konsekvenser, herunder muligheden for screening for disse sygdomme i en indledende fase at potentielt hjælpe med sygdomsbehandling. Modellen foreslås her er simpelt, men det er meget nyskabende. En af de væsentligste fordele er, at de hornhinde stromale celler er tilladt at udskille og samle deres egen ECM i stedet for at blive seedet på et kunstigt miljø. Derudover er nerver tilladt at differentiere til mere præcist model hornhindens stroma nerve interaktioner. Derfor giver denne metode mulighed for at studere den menneskelige hornhindens stroma samt nerve netværk og de celler, der bor i stroma-miljøet. Denne kulturelle platform vil tillade fremtidige undersøgelser af komplekse celle-celle og celle-matrix interaktioner, der påvirker de syge stater af hornhinden. Denne 3D i vitro model tilgang forventes for at levere forbedret og roman indsigt i sygdommen mekanisme, navnlig i forhold til nuværende konventionelle kultur systemer eller dyremodeller.

Den beskrevne generation af denne model, der 3D in vitro- vil bane vejen for fremtidig terapeutisk behandling og opdagelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne udvide vores oprigtige tak Dr. Ben Fowler hans teknisk hjælp til TEM eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Healthy corneal tissue NDRI Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) Gibco by Life Technologies 14190-144
Sterile forceps Fischer Scientific 13-812-42 Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor blades Personna 270100
Sterile surgical scalpel blades No.10 Feather Surgical Blade 2976#10
Eagle’s Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550 10% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco by Life Technologies 15240-062 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X) Gibco by Life Technologies 25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores Corning Costar 3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) Sigma-Aldrich SMB00390-14 A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax block VWR 50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cells ATCC SHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic Acid Sigma-Aldrich SRP3014-10UG Final concentration of 10uM needs to be used
BDNF Sigma-Aldrich R2625-100MG Final concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) VWR-Alfa Aesar 67-68-5 Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) Fisher Scientific 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) Fisher Scientific 12-565-349

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 131 hornhinden 3D i vitro model menneskelige hornhinde fibroblaster fælles kultur neuronale celler C-vitamin
Hornhindevæv Engineering: En <em>In Vitro</em> Model af den menneskelige hornhinden stromale-nerve interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharif, R., Priyadarsini, S.,… More

Sharif, R., Priyadarsini, S., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea. J. Vis. Exp. (131), e56308, doi:10.3791/56308 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter