Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/56308
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הרומן תלת מימדי במבחנה מודל, שבו תאי סטרומה הקרנית ואת תאים עצביים מתורבתים יחד כדי לסייע בדיקה והבנה של האינטראקציות של תא שני הסוגים.

Abstract

הנדסת רקמות זכה להכרה משמעותית בשל הביקוש הגבוה החלפת הקרנית האנושית בערך 10 מיליון אנשים ברחבי העולם הסובלים אובדן ראייה הקרנית1. כדי לענות על הביקוש קיימא הקרנית האנושית, התקדמות משמעותית ברקמה תלת מימדי (3D) הנדסה הפך2,3,4. מודלים אלה קרנית נע בין מערכות חד שכבתי פשוטה דגמי מרובה שכבות, שמוביל תלת-ממד מלא-עובי הקרנית ששווי הערך2.

עם זאת, השימוש של הקרנית רקמות מהונדסים 3D בהקשר של במבחנה המחלה מודלים למד עד תאריך חסר דמיון המבנה מרובה שכבות תלת-ממד רקמת הקרנית, פונקציה של הרשתות של סוגי תאים שונים (כלומר, חוצפה, אפיתל stroma, אנדותל)2,3. בנוסף, גדל הביקוש במבחנה מודלים רקמת הקרנית בניסיון להפחית את הניסויים בחיות עבור מוצרים פרמצבטיים. לפיכך, דגמים מתוחכמים יותר נדרשים על מנת שיתאימו יותר מערכות לדרישות הפיזיולוגיות האנושי, הפיתוח של מודל זה יותר רלוונטי האוכלוסייה המטופלת הוא הכרחי. בהתחשב בכך סוגי תאים מרובים הקרנית מושפעים ומחלות dystrophies, כגון קרטוקונוס, Keratopathy סוכרתית, פוקס, מודל זה כולל דגם תלת-ממד תרבות משותפת של ראשי האדם הקרנית fibroblasts (HCFs) תורמים בריא, נוירונים מ הקו תא SH-SY5Y. זה מאפשר לנו לראשונה לחקור את האינטראקציות בין סוגי שני תאים בתוך הרקמה הקרנית האנושית. אנו מאמינים כי מודל זה יכול באופן פוטנציאלי לנתח המנגנונים הבסיסית המשויכת את האינטראקציות סטרומה-עצב של מחלות קרנית כי התערוכה עצב נזקים. דגם תלת-ממד זה מראות הטבע אנטומית, פיזיולוגית בסיסית של ה רקמת הקרנית ויוו , יכול לשמש בעתיד ככלי עבור חוקרים פגמים הקרנית, כמו גם הקרנת את היעילות של סוכנים שונים לפני הניסויים בחיות.

Introduction

בגוף האדם, הקרנית היא הרקמה innervated ביותר. העצבים אחראים על תחושות שונות כמו מגע, כאב, טמפרטורה, ויש גם תפקיד חיוני ריפוי פצעים, ממצמץ רפלקסים, לקרוע הייצור, ועל הפרשת5,6,7. הקרנית, גזעי עצב סטרומה נובעים מקלעת limbal והזן stroma הקרנית היקפיים בצורה רדיאלית. הארגון עצב סטרומה במקביל lamellae קולגן, הם עוד סניף לתוך קטנות fascicles הם התקדמותך לעבר שטחי משתית5,8. סיבי העצב עוד לחדור את שכבת האפיתל, לפיכך, העצבוב נרחב מתפרסת על פני אפיתל הקרנית משתית. לכן, העצבוב יש תפקיד חיוני במדינת בריאים וחולים של הקרנית. ב פרוטוקול זה, אנו חושפים את ההתקדמות של הרומן 3D במבחנה דוגמן, הוא הראשון מסוגו כדי לחקות את האינטראקציות סטרומה-עצב ויוו . שורת התאים SH-SY5Y נעשה שימוש במחקר זה, כי הוא אחד הקווים הוותיקים ביותר, טוב מאופיין המשמשות ללימוד צמיחה עצביים. שורת התאים SH-SY5Y כבר מתואר לייצר שני מחסידי המצע (S-type), neuroblastic (מסוג N) תאים זה יכול לעבור transdifferentiation9. כתוצאה מכך, אף-על-פי קו תא זה נגזר מתוך מבחר טריפל subclone רצופות של תאים מסוג N, הוא מכיל גם מספר קטן של S-type תאים שעברו התמיינות לתוך הנוירונים באמצעות retinoic חומצה, נגזר המוח neurotrophic פקטור9. זה מספק כלי זה עשוי להוביל להבנה טובה יותר של הקרנית הסיבוכים עם רטינופתיה סוכרתית (DM) ומחלות אחרות עינית. בשל הקשיים הקשורים בהשגת culturing נוירונים של חולים עם מחלה עינית, מודל זה 3D במבחנה מספק השלכות משמעותית הלומדים את האינטראקציות עצביים, איתות עם stroma הקרנית.

תנאים חולה לעיתים קרובות משפיעים על רקמות שונות בגוף בקנה מידה גדול מאוד, המוביל אל איכות חיים בסכנה. Dystrophies עינית סיבוכים נפוצים קשורה לעיתים קרובות עם מחלות מערכתיות ולהוביל אובדן של חדות הראייה או אובדן ראייה ואפילו קבע. מחקרים מקיפים חיוניים לעתים קרובות לצורך הבנה טובה יותר של מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות ברמה התאית הבזליים. לחקור את ההשפעות של מחלות כאלה, פותחו מודלים שונים ב- vivo ו- in vitro לקשרי עם העזרה של רקמות יישומי הנדסה. יישומי הנדסת רקמות הקרנית משכו עניין רב ברחבי בתחומים השונים של מדעי10,11,12,13,14, אך ישנן מגבלות הגדולות עדיין במהלך יישום בפועל, לרבות הקרנית להשתיל דחיות, דלקות וצלקות10,11,12,13,14. ישנם מספר מחקרים יש בהצלחה פיתח והקים שונים במבחנה מודלים3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. דגמי תלת-ממד במבחנה הם המבטיחים ביותר עניין מדעי רב. דגמי תלת-ממד ידועים יותר לשקף ויוו הסלולר האירועים ופיזיולוגיים הן קריטיות במהלך פיברוזיס, פצע ריפוי15,27,28,29. מודלים אלה במבחנה לשחק תפקיד חשוב למצוא גישות טיפוליות חדשות לטיפול במצבים למחלות שונות כולל סיבוכים הקרנית. למרות תפקיד קריטי של העצבוב בפונקציות הקרנית, הפך מעט מאמץ כדי לקדם את הפצת במערכת העצבים ההיקפית בתוך הקרנית בונה רקמות מהונדסים2,3. עם זאת, המבנה תא המוצע 3D במבחנה לחקות את רקמת המטרה כדי להשיג את הפונקציונליות הרקמה הרצויה.

בעוד keratopathy סוכרתית הוא יישום ברור עבור המודל המתואר כאן בשל הליקויים עצביים, ישנן מספר מחלות הקרנית אחרות יכולים להפיק תועלת מודל אנושי במבחנה כולל dystrophies קרטוקונוס, פוקס. דגם התלת-ממד שלנו מגיח זה פרוספקט, מציע הפיתוח של ייצוג במבחנה של רקמת הקרנית כדי להעריך תרופות והבטיחות של תרופות חדשות עינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת הבדיקה אוניברסיטת אוקלהומה למדעי הבריאות מרכז/המוסדי (IRB #4509). כל חלקי הפרוטוקול פגש את העיקרים של ההכרזה של הלסינקי. דוגמאות הקרנית התקבלו פיתוח לאומי, מכון מחקר (NDRI) והגדה העין אריות אוקלהומה.

1. בידוד תאי ראשי

  1. עם קבלת דגימות רקמות הקרנית האנושית, להעביר את הרקמות 21.5 ס מ2 פטרי המכילות 2 מ ל תמיסת סטרילית של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) (1 x).
  2. לגרד ולהסיר את אפיתל הקרנית על-ידי הצבת את הקרנית כיפת פנים כלפי מעלה. כדי להבטיח הסרה מלאה, לגרד את השכבה אפיתל ביסודיות בעזרת סכין גילוח בזווית של 45°. בשלב הבא, הפוך את הקרנית הכיפה, הפנים כלפי מטה, ביסודיות שתגרד אנדותל מ stroma עם סכין גילוח בזווית של 45° כדי להבטיח הסרה מלאה. לשטוף את הרקמה סטרומה עם DPBS.
  3. חותכים את רקמות סטרומה לחתיכות קטנות, באמצעות להב כירורגי מספר 10, שמירה על החלקים סטרומה רטוב כל הזמן באמצעות DPBS. להרים חתיכות סטרומה עם מלקחיים סטרילי ומקום לתוך בקבוקון תרבות T25 ללא מדיה (4 או 5 חתיכות של 2 x 2 מ"מ רקמות לאדם את הבקבוק).
  4. אפשר את explants לדבוק בתחתית הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 30-40 דקות. ברגע דבקה, להוסיף לאט המינימום חיוני בינוני רשנה (EMEM) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic את. הבקבוק מבלי להפריע את explants.
  5. הנח בעדינות את הבקבוק בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. להשאיר את explants ללא הפרעה עד והתאים מתחילים בידוד ושל העברת בתוך הבקבוק. לאחר כ- 2-4 שבועות, תאים כדאי להגיע למפגש 100%. על 100% הנהרות, המעבר את התאים על ידי הסרת התקשורת תרביות רקמה, לשטוף את התאים עם DPBS.
  6. להוסיף טריפסין לתאים ולאחר מכן דגירה אותם ב 37 º C. לאחר כ 5 דקות, הצג את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי הם יש תלושים, אז לעצור את proteolysis על-ידי הוספת מדיה טריים.
  7. העברת התליה תא לתוך צינור חרוטי 15 mL עבור צנטריפוגה-1,000 x g... להסיר את תגובת שיקוע בזהירות מבלי להפריע בגדר והשהה את התאים EMEM טריים 10% FBS 1% לאנטיביוטיקה. לספור את התאים ואת זרע על עונה 1 פרק 106 תאים T75 הבקבוק תרבות להרחבה נוספת עם EMEM טרי 1% FBS 1% לאנטיביוטיקה.

2. ראשי HCFs תרבות, מכלול מבנים תלת-ממד

  1. להרכיב 3D מבנים מן explants EMEM בעבר מבוגר ב 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic, מעבר, הרוזן HCFs.
  2. זרע כ עונה 1 פרק 106 תאים/טוב של HCFs ראשי-פוליקרבונט מוסיף קרום עם נקבוביות 0.4-מיקרומטר מן המבנה התלת-ממד, יחד עם 1.5 מ של טרי EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic לחלק העליון של הבונה. להוסיף עוד כ- 1.5 מ ל אותה מדיה לתחתית של כל המבנה.
  3. לאחר 24 שעות של התא זריעה, התרבות התאים עם EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic, מגורה בחומצה 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 0.5 מ מ (ויטמין C) על ידי הוספת 1.5 mL בחלק העליון ו- mL 1.5 על החלק התחתון של כל המבנה.
  4. לשמור על התרבויות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 3 שבועות והענק מדיה טריים בכל יום במהלך תקופת המחקר כולו. אין מעבר נוספת נדרשת.

3. תא בידול ותרבויות שיתוף

  1. לאחר 3 שבועות, להוסיף 8 x 103 תאים/טוב של תאים נוירובלסטומה האנושי SH-SY5Y בראש 3D בעבר שהורכב בונה המכילה 1.5 מ ל EMEM המכיל 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic, ו- 0.5 מ מ 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic חומצה (ויטמין C).
    1. אפשר לגדול על גבי תאי סטרומה קרנית לפחות 24 שעות לפני ביצוע תאית התמיינות התאים נוירובלסטומה SH-SY5Y.
  2. ליזום SH-SY5Y תאית התמיינות על ידי גירוי התאים עם EMEM המכיל 1% FBS ו 1.5 מיליליטר 10 מיקרומטר חומצה Retinoic מעל הבונה. להוסיף 1.5 מ ל מהל EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic 0.5 מ מ 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (ויטמין C) לתחתית של הבונה. שימו לב כי יש לבצע את הצעד חומצה Retinoic בחושך.
    1. להמשיך התרבות התאים בתקשורת בידול זה במשך 5 ימים.
  3. כאשר התאים מגיעים לשלב בידול, להחליף את התאים 1.5 מ של מדיה ללא סרום המכיל 2 nM של neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic להוסיף EMEM, על-ידי הוספת לחלק העליון של הבונה. להוסיף 1.5 מ ל מהל EMEM 10% FBS 1% אנטיביוטיקה/Antimycotic 0.5 מ מ 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (ויטמין C) לתחתית של הבונה. שימו לב כי יש לבצע את הצעד BDNF בחושך.
  4. התרבות התאים 2 ימים נוספים לפני עיבוד עבור כל ניתוח נוסף כמצוין בטבלה1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 היא תמונה מייצגת שלב אחר שלב של דגם תלת-ממד in vitro לקשרי עבודה. בשלב הראשון, תאים מבודדים מן הקרנית האנושית. לאחר מכן, הם גדל על קרום פוליקרבונט, גירוי עם ויטמין C להרכיב עצמית על ידי מטריצה תלת-ממד. מערכת זו לבנות 3D גורם הסינתזה של יישום מרובה שכבות הסלולר ויוו-כמו מטריקס סטרומה. לאחר מכן, נוירובלסטומה תאים הם נזרע על גבי תאי סטרומה ואחריו מתחילה התמיינות תאים עצביים. זה מוביל תרבות משותפת של הקרנית סטרומה תאים תאים עצביים במודל תלת-ממד במבחנה . איור 2 תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) שידור בהגדלה של 3D עצמית שהורכב הבונה (איור 2 א) מציג את הקרום פוליקרבונט, תאי סטרומה הקרנית נזרע עליון, מפריש מטריצה שהורכב עצמית ואחריו (איור 2B) תאים עצביים נזרע על גבי מציג סידור סטרומה תאים עצביים. החיצים בתמונה מראים על תאים עצביים. בהתחשב crosstalk ישיר בין הקרנית משתית תאים עצביים, אנו מאמינים שחקני המפתח המשפיעות על ההוראה של הליקויים הקרנית קיים בשכבה משתית. לכן, מודל זה מציג האדם עצביים במבחנה דגם המבדילים SH-SY5Y נוירובלסטומה תאים מורפולוגיה עצביים בר קיימא על ידי שילוב עם שלנו דגם התלת-ממד שנקבעו קודם של מטריצה חוץ-תאית (ECM) culturing עם גורמים שונים המבדילים. לפיכך, אנו חושדים כי מודל זה יאפשר מחקרים עתידיים של ההבדלים מולקולרית מורפולוגיים בין ECM בריאים וחולים. אנו מאמינים כי מודל זה הרומן 3D במבחנה יעזור לנתח היבטים קריטיים של אינטראקציות משתית הקרנית-העצבים הקשורים עם פתולוגיה הקרנית, לסלול את הדרך לפיתוח של הרפוי חדש.

Figure 1
איור 1: תמונת המחשה מציג את המודל תרבות משותפת 3D במבחנה באופן הדרגתיים. תמונה זו מציגה את הבידוד תא מן הקרנית האנושית, סטרומה תאים נזרע על קרום פוליקרבונט, ממוקם הבונה תלת-ממד, תרבותי ב EMEM, גירוי עם ויטמין c. יתר על כן, תאים עצביים מוצגים כדי להיות נזרע על גבי תאי סטרומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תמונת TEM בהגדלה של מערכת תלת-ממד במבחנה . (א) הסדר סטרומה תאים על גבי קרום פוליקרבונט. (B) Seeded הבדיל תאים עצביים על גבי תאי סטרומה. גודל ברים = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טכניקות לניתוח השלכות אפשריות
תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותיים לחקור את סמני קולגן (Col אני, Col III ו- Col V), סמן שהותירה אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA), וכן מפתח ב- DM כולל growth factor אינסולין 1 (IGF-1) וזה הוא קולטן (IGF1-R)
במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים שינויים מבניים נחקרות כגון קולגן הסיבים ואינטראקציות תא-ECM
Immunofluorescence השימוש של נוגדנים ספציפיים מצומדת כימי כדי הפלורסנט לחקור אנטיגנים הסלולר

טבלה 1: ניתוח טכניקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר מחקרים התמקדו על פיתוח מודלים בבעלי חיים שונים יכולים לעזור לפתח הבנה טובה יותר של מחלות הקרנית וכן לגלות טיפולים. עם זאת, ערך משמעותי לבני ממחקרים אלה לא אומת. עד כה, מודלים שונים במבחנה יש כבר שפותחו ונחקרו נרחב עקב שלהם משמעות קלינית יוצא מן הכלל. המודל שלנו שנקבעו קודם 3D במבחנה הוא מערכת הרומן משמעותית תורם התקדמות מדע הרפואה מחקר חזון, מציג יכולת ללא רבב של recapitulating ויוו אירועים במבחנה28 , 29 , 30. המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח הדור הבא של במבחנה הקרנית מודל זה יכול לשמש כדי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית של סיבוכים הקשורים הקרנית מחלות כגון סוכרת keratopathy, קרטוקונוס , פוקס. קידום כזה יכול לספק יסודות מוצקים לקראת הגילוי של טיפולים חדשים הנחוצים הרבה קלינית.

מודל זה עשוי לסייע בזיהוי שינויים מבניים הסלולר שונה לוקח מקום ב- DM ומחלות אחרות הקרנית. זה מספק השלכות משמעותית, כולל האפשרות להקרנה למחלות אלה בשלב הראשוני פוטנציאל לעזור עם ניהול המחלה. המודל המוצע כאן הוא פשוט, אבל זה חדשניים ביותר. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר הוא כי תאי סטרומה הקרנית מותר להפריש ולהרכיב ECM משלהם במקום להיות נזרע על סביבה מלאכותית. בנוסף, העצבים מותר להבדיל כדי באופן מדויק יותר דגם עצב סטרומה הקרנית אינטראקציות. לפיכך, שיטה זו מספקת את היכולת ללמוד stroma הקרנית האנושית רשת העצבים, כמו גם את התאים הנמצאים בתוך הסביבה משתית. פלטפורמה תרבותית זו תאפשר חקירות עתידי האינטראקציות תא התא, התא-מטריקס מורכבים המשפיעים על המדינות החולני של הקרנית. זו גישה דגם תלת-ממד במבחנה צפוי לספק שיפור של הרומן תובנה מנגנון המחלה, במיוחד בהשוואה הנוכחית קונבנציונאלי תרבות מערכות או בבעלי חיים.

הדור המתואר של מודל זה 3D במבחנה יסלול את הדרך לעתיד טיפולית, תגליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להרחיב שלנו כנה בזכות ד ר בן פאולר לעזרה טכנית שלו עם הניסויים TEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Healthy corneal tissue NDRI Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) Gibco by Life Technologies 14190-144
Sterile forceps Fischer Scientific 13-812-42 Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor blades Personna 270100
Sterile surgical scalpel blades No.10 Feather Surgical Blade 2976#10
Eagle’s Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550 10% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco by Life Technologies 15240-062 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X) Gibco by Life Technologies 25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores Corning Costar 3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) Sigma-Aldrich SMB00390-14 A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax block VWR 50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cells ATCC SHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic Acid Sigma-Aldrich SRP3014-10UG Final concentration of 10uM needs to be used
BDNF Sigma-Aldrich R2625-100MG Final concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) VWR-Alfa Aesar 67-68-5 Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) Fisher Scientific 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) Fisher Scientific 12-565-349

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  3. Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
  4. Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
  5. Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
  6. Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
  7. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  8. Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
  9. Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
  10. Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
  11. Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
  12. Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
  13. Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
  14. Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
  15. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  16. Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
  17. Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
  18. Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
  19. Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
  20. Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
  21. Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
  22. Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
  23. Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
  24. Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
  25. Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
  26. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
  27. Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
  28. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
  29. Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
  30. Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 131 קרנית דגם תלת-ממד במבחנה fibroblasts הקרנית האנושית תרבות משותפת תאים עצביים ויטמין C
הנדסת רקמות הקרנית: <em>במבחנה</em> מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharif, R., Priyadarsini, S.,… More

Sharif, R., Priyadarsini, S., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea. J. Vis. Exp. (131), e56308, doi:10.3791/56308 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter