Summary
Questo protocollo descrive un romanzo tridimensionale in vitro modello, cui sono coltivate cellule stromal corneale e cellule neuronali differenziate insieme per assistere nell'esame e nella comprensione delle interazioni tra i due tipi cellulari.
Abstract
Ingegneria tissutale ha guadagnato riconoscimento sostanza a causa della forte domanda per le sostituzioni di cornea umana con circa 10 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di perdita di visione corneale1. Per rispondere alla domanda di cornee umane vitali, progressi significativi nel tessuto di tridimensionale (3D) ingegneria è stato fatto2,3,4. Questi gamma di modelli di cornea da sistemi monostrato semplice ai modelli multilivello, che conduce a 3D equivalenti corneale di pieno-spessore2.
Tuttavia, l'uso di una cornea tessutale 3D nel contesto dei modelli di malattia in vitro studiato per data non ha somiglianza con la struttura multistrato 3D tessuto corneale, funzione e la messa in rete di diversi tipi di cellule (cioè, nervo, epitelio, stroma ed endotelio)2,3. Inoltre, la domanda per i modelli di tessuti in vitro cornea è aumentata nel tentativo di ridurre la sperimentazione animale per i prodotti farmaceutici. Così, modelli più sofisticati sono tenuti a corrispondere meglio sistemi ai requisiti fisiologici umani e lo sviluppo di un modello che è più rilevante per la popolazione di pazienti è assolutamente necessario. Dato che più tipi di cellule nella cornea sono colpiti da malattie e distrofie, quali cheratocono, cheratopatia diabetica e Fuchs, questo modello include un modello 3D co-coltura di fibroblasti corneali umani primari (HCF) da donatori sani e neuroni da la linea di cellule SH-SY5Y. Questo ci permette per la prima volta studiare le interazioni tra i due tipi cellulari all'interno del tessuto cornea umano. Crediamo che questo modello potrebbe potenzialmente sezionare i meccanismi di fondo connessi con le interazioni di stromal-nervo di patologie corneali che presentano danni del nervo. Questo modello 3D rispecchia la natura di base anatomica e fisiologica del tessuto corneale in vivo e utilizzabile in futuro come uno strumento per indagare i difetti corneali così come l'efficacia di vari agenti di screening prima sperimentazione animale.
Introduction
Nel corpo umano, la cornea è il tessuto più densamente innervato. I nervi sono responsabili di varie sensazioni come touch, dolore, temperatura e hanno anche un ruolo essenziale nella guarigione delle ferite, lampeggiano i riflessi, tear produzione e secrezione5,6,7. Nella cornea, tronchi del nervo stromal derivano dal plesso limbal e immettere lo stroma cornea periferico radialmente. L'organizzazione di stromal del nervo è parallelo le lamelle collagene e ulteriore diramazione in fasci più piccoli come si procede verso il stroma superficiale5,8. Le fibre nervose ulteriormente penetrare lo strato epiteliale e così, lo stimolo è ampiamente sparso attraverso l'epitelio corneale e lo stroma. Di conseguenza, lo stimolo ha un ruolo essenziale nello stato sano e malato della cornea. In questo protocollo, riveliamo l'avanzamento di un modello di romanzo 3D in vitro , che è il primo del suo genere per simulare le interazioni di stromal-nervo in vivo . La linea di cellule SH-SY5Y era utilizzata per questo studio, in quanto è una delle linee più affermate, ben caratterizzate utilizzate per studiare la crescita neuronale. La linea di cellule SH-SY5Y è stato descritta per produrre sia aderente di substrato (S-type) e neuroblastic (tipo N) che le cellule possono subire transdifferenziazione9. Di conseguenza, anche se questa linea cellulare è derivata da una selezione di triple consecutive subclone di cellule di tipo N, che contiene anche un piccolo numero di cellule di tipo S in grado di subire il differenziamento in neuroni attraverso l'uso di retinoico acido e cervello-derivato neurotrophic factor9. Questo fornisce uno strumento che può portare a una migliore comprensione delle complicazioni corneale connesse con retinopatia diabetica (DM) e altre malattie oculari. A causa di difficoltà associate all'ottenimento e coltura neuroni da pazienti con malattia oculare, questo modello 3D in vitro fornisce notevoli implicazioni nello studio delle interazioni neuronali e segnalazione con lo stroma corneale.
Circostanze malate spesso colpiscono vari tessuti del corpo ad una scala molto grande, che porta ad una qualità della vita compromessa. Le distrofie oculare sono complicazioni comuni spesso associate a malattie sistemiche e portare alla perdita dell'acuità visiva o anche permanente della vista. Studi completi sono spesso essenziali per una migliore comprensione della condizione di malattia, come pure gli effetti a livello cellulare basale. Per studiare gli effetti di tali malattie, sono stati sviluppati vari modelli in vivo e in vitro con l'aiuto di applicazioni di ingegneria tissutale. Applicazioni di ingegneria del tessuto corneale hanno raccolto grande interesse in vari settori della scienza10,11,12,13,14, ma ci sono ancora notevoli limitazioni durante effettiva applicazione, tra cui corneale dell'innesto respingimenti, infezioni e cicatrici10,11,12,13,14. Ci sono diversi studi che hanno sviluppato con successo e stabilite varie in vitro modelli3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. I modelli 3D in vitro sono i più promettenti e di grande interesse scientifico. Modelli 3D sono noti per meglio rispecchiare il in vivo eventi cellulari e fisiologiche che sono critici durante la fibrosi e ferita guarigione15,27,28,29. Questi modelli in vitro giocano un ruolo fondamentale nella ricerca di nuovi approcci terapeutici per il trattamento di diverse patologie tra cui le complicazioni corneali. Nonostante il ruolo critico dell'innervazione nelle funzioni corneale, piccoli sforzi compiuti per promuovere la proliferazione di nervo periferico all'interno di costrutti tessutale corneale2,3. Tuttavia, i costrutti di cella proposto 3D in vitro imitano il tessuto bersaglio al fine di conseguire la funzionalità del tessuto desiderato.
Mentre keratopathy diabetica è un'applicazione evidente per il modello descritto qui dovuto i difetti di un neurone, ci sono parecchie altre malattie corneali che possono beneficiare di un modello umano in vitro compreso le distrofie cheratocono e Fuchs. Il nostro modello 3D emerge da questa prospettiva e propone lo sviluppo di una rappresentazione in vitro del tessuto corneale per valutare la somministrazione di farmaci e la sicurezza dei nuovi farmaci oculari.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida del Comitato di revisione di Università di Oklahoma Health Sciences Center/istituzionale (IRB n. 4509). Tutte le parti del protocollo ha incontrato i principi della dichiarazione di Helsinki. Campioni corneali sono stati ottenuti dallo sviluppo nazionale e Research Institute (NDRI) e la banca degli occhi Lions di Oklahoma.
1. isolamento di cellule primarie
- Al ricevimento dei campioni di tessuto cornea umana, trasferire i tessuti in un 21,5 cm2 capsula di Petri contenente 2 mL di soluzione tampone fosfato sterile di Dulbecco (DPBS) (1x).
- Raschiare e rimozione dell'epitelio corneale posizionando la cornea cupola a faccia in su. Per garantire la rimozione completa, grattare via lo strato epiteliale accuratamente con una lama di rasoio ad un angolo di 45°. Successivamente, capovolgere la cornea cupola a faccia in giù e raschiare accuratamente l'endotelio dallo stroma con una lama di rasoio ad un angolo di 45° per garantire la rimozione completa. Lavare il tessuto stromal con DPBS.
- Tagliare i tessuti stromali in piccoli pezzi, usando una lama chirurgica del numero 10, tenere i pezzi stromali bagnati a tutti i tempi con DPBS. Raccogliere pezzi stromal con pinze sterili e posto in un matraccio di cultura T25 senza mezzi di comunicazione (4 o 5 pezzi di tessuto di 2 x 2 mm per fiaschetta).
- Consentire gli espianti di aderire al fondo del matraccio a 37 ° C per circa 30-40 min. Una volta aderito, aggiungere lentamente il mezzo essenziale minimo di Eagle (EMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico/Antimycotic al pallone senza disturbare gli espianti.
- Posizionare delicatamente il pallone nell'incubatore a 37 ° C, 5% CO2. Lasciare gli espianti indisturbato fino a quando le cellule iniziano a isolare e la migrazione nel pallone. Dopo circa 2-4 settimane, le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza di 100%. Sulla confluenza di 100%, le cellule del passaggio rimuovendo i mezzi di coltura del tessuto e lavare le cellule con DPBS.
- Aggiungere tripsina alle cellule e quindi li Incubare a 37° C. Dopo circa 5 minuti, Mostra le cellule nell'ambito di microscopia per confermare che hanno staccato e poi fermare la proteolisi aggiungendo media fresco.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL per centrifugazione a 1.000 x g. eliminare il surnatante con attenzione senza disturbare il pellet e sospendere le cellule in EMEM fresco 10% FBS 1% antibiotico. Contare le celle e seme circa 1 x 106 cellule nel matraccio di cultura T75 per un'ulteriore espansione con EMEM fresco 1% FBS 1% antibiotico.
2. primaria HCF cultura e costrutti 3D Assembly
- Per assemblare 3D costrutti da espianti EMEM precedentemente coltivate in 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic, corridoio e conteggio HCF.
- Semi di circa 1 x 106 cellule/pozzetto di HCF primario su inserti di membrana in policarbonato con pori 0,4 µm dai costrutti 3D, insieme con 1,5 mL di EMEM fresco 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic nella parte superiore del costrutto. Aggiungere un altro 1,5 mL di stesso supporto nella parte inferiore di ogni costrutto.
- Dopo 24 h di semina delle cellule, della coltura delle cellule con EMEM 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic, stimolato con 0,5 mM acido 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamina C) da aggiungere 1,5 mL in alto a sinistra e 1,5 mL sul fondo di ogni costrutto.
- Mantenere le colture in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 per 3 settimane e fornire mezzi freschi ogni altro giorno durante l'intero periodo di studio. Nessun passaggio ulteriore è necessaria.
3. differenziazione e co-colture delle cellule
- Dopo 3 settimane, aggiungere 8 x 103 cellule/pozzetto di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sulla cima il 3D precedentemente assemblato costruisce contenente 1,5 mL di EMEM contenente 10% FBS, 1% antibiotico/Antimycotic e 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acido (vitamina C).
- Consentire le cellule di neuroblastoma SH-SY5Y a crescere sopra le cellule stromal di cornea per almeno 24 ore prima dell'inizio della differenziazione cellulare.
- Avviare la differenziazione delle cellule SH-SY5Y stimolando le cellule con EMEM contenente 1% FBS e 1,5 mL di 10 µM acido retinoico in cima il costrutto. Aggiungere 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acido (vitamina C) alla parte inferiore del costrutto. Nota che l'acido retinoico va effettuata al buio.
- Continuare a coltivare le cellule in questa media di differenziazione per 5 giorni.
- Quando le cellule raggiungono la fase di differenziazione, passare le cellule a 1,5 mL di terreno privo di siero contenente 2 nM di fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF) e 1% antibiotico/Antimycotic aggiunto ai EMEM, aggiungendo alla parte superiore del costrutto. Aggiungere 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acido (vitamina C) alla parte inferiore del costrutto. Si noti che il passo BDNF deve essere eseguito nel buio.
- Coltura delle cellule per 2 giorni aggiuntivi prima dell'elaborazione per qualsiasi ulteriore analisi come indicato nella tabella 1.
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Representative Results
Figura 1 è una dettagliata immagine rappresentativa del modello di lavoro 3D in vitro . Nella prima fase, le cellule sono isolate dalle cornee umane. Quindi, sono cresciuti su una membrana di policarbonato e stimolati con vitamina C per assemblare una matrice 3D auto-secreta. Questo sistema di costrutto 3D induce la sintesi di un multistrato cellulare in vivo-come matrice stromale. Successivamente, le cellule di neuroblastoma sono seminate in cima le cellule stromal seguite avviando la differenziazione delle cellule neuronali. Questo porta alla co-coltura delle cellule stromale corneale e cellule neuronali differenziate nel modello 3D in vitro . Figura 2 è l'immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione ad alto ingrandimento del costrutto 3D auto-assemblato (Figura 2A) mostrando la membrana di policarbonato e le cellule stromal corneale seminato sulla parte superiore, che secernono una matrice auto-assemblata seguita da (Figura 2B) cellule neuronali differenziate seminato in alto mostra una disposizione stromal delle cellule neuronali. Le frecce nell'immagine mostrano le cellule neuronali. Dato il crosstalk diretto tra lo stroma cornea e cellule neuronali, crediamo che i giocatori chiavi che influenzano la regolazione dei difetti corneali presenti nello strato di stroma. Pertanto, questo modello presenta un neuroblastoma differenziazione SH-SY5Y umano neuronale in vitro modello cellule in una morfologia neuronale sostenibile attraverso la combinazione con il nostro modello 3D precedentemente stabilito di matrice extracellulare (ECM) coltura con vari fattori discriminanti. Così, abbiamo il sospetto che questo modello consentirà futuri studi delle differenze morfologiche e molecolari tra ECM sani e malati. Crediamo che questo modello di romanzo 3D in vitro aiuterà dissezionare aspetti cruciali delle interazioni stroma corneale-nervo associate a patologia corneale e spianare la strada per lo sviluppo di nuove terapie.
Figura 1: immagine illustrativo Mostra il modello di co-coltura 3D in vitro in maniera graduale. Questa immagine mostra l'isolamento delle cellule dalla cornea umana e cellule stromali seminate su una membrana di policarbonato, situato nel costrutto 3D, coltivate in EMEM e stimolato con vitamina c. Inoltre, le cellule neuronali differenziate sono indicate per essere seminato in cima le cellule stromal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine TEM di alto ingrandimento del sistema 3D in vitro . (A) disposizione di cellule stromali in cima la membrana in policarbonato. (B) Seeded differenziato cellule neuronali in cima le cellule stromal. Scala bar = 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tecniche per l'analisi | Potenziali implicazioni |
| Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale | Indagare i marcatori del collagene (Col, Col III e Col V), marcatore fibrotica actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) e mediatori chiave nel DM come fattore di crescita insulino-1 (IGF-1) e si è ricevitore (IGF1-R) |
| Microscopia elettronica a trasmissione | Cambiamenti strutturali sono studiati come fibrille collagene e le interazioni cellula-ECM |
| Immunofluorescenza | Uso di anticorpi specifici chimicamente coniugato alla tintura fluorescente per indagare gli antigeni cellulari |
Tabella 1: Tecniche di analisi.
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Discussion
Diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di vari modelli animali che possono aiutare a sviluppare una migliore comprensione delle malattie della cornea così come scoprire i trattamenti. Tuttavia, un notevole valore agli esseri umani da questi studi non è stato verificato. Ad oggi, vari modelli in vitro sono sviluppati e ampiamente studiati a causa della loro notevole importanza clinica. Il nostro modello precedentemente stabilito 3D in vitro è un innovativo sistema significativamente contribuisce agli avanzamenti della scienza medica nella ricerca sulla visione e Mostra Immacolata capacità di ricapitolare in vivo eventi in vitro28 , 29 , 30. l'obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare la prossima generazione di questo in vitro corneale modello che può essere utilizzato per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari delle complicazioni connesse con patologie corneali quali diabetici keratopathy, cheratocono e Fuchs. Tale avanzamento potrebbe fornire solide fondamenta verso la scoperta di nuovi trattamenti che sono molto necessari clinicamente.
Questo modello può aiutare nell'identificazione di diverse alterazioni strutturali e cellulari che si svolgono in DM e altre malattie della cornea. Questo fornisce notevoli implicazioni, tra cui la possibilità per lo screening per queste malattie in una fase iniziale di potenzialmente aiutare con gestione della malattia. Il modello proposto qui è semplice, ma è altamente innovativo. Uno dei vantaggi più significativi è che le cellule stromal corneale sono autorizzate a secernere e assemblare le proprie ECM anziché essere seminate su un ambiente artificiale. Inoltre, i nervi sono consentiti per differenziare più accuratamente interazioni di nervo stromal corneale di modello. Quindi, questo metodo fornisce la possibilità di studiare lo stroma cornea umano e rete del nervo, come pure le cellule che si trovano all'interno dell'ambiente di stroma. Questa piattaforma cultura permetterà le indagini future delle complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che influenzano gli stati malati della cornea. Questo approccio di modello 3D in vitro è previsto per fornire migliorato e romanzo spaccato meccanismo di malattia, soprattutto se paragonato ad corrente convenzionale cultura sistemi o modelli animali.
La generazione descritta di questo modello 3D in vitro spianerà la strada per il futuro trattamento terapeutico e scoperte.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Vorremmo estendere il nostro sincero grazie a Dr. Ben Fowler per il suo aiuto tecnico con gli esperimenti TEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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