Summary
Этот протокол описывает Роман трехмерных в vitro модель, где роговицы стромальные клетки и дифференцированной нейрональные клетки культивировали вместе для оказания помощи в рассмотрении и понимания взаимодействия типов двух клеток.
Abstract
Тканевая инженерия получила значительное признание из-за высокого спроса на человека роговицы замены с примерно 10 миллионов человек во всем мире, страдающих от роговицы зрение потери1. Для удовлетворения спроса на жизнеспособного человека роговицы, значительный прогресс в трехмерной (3D) ткани инженерных сделал2,3,4. Эти роговицы модели варьируются от простых монослоя систем многослойных моделей, ведущих к 3D полный Толщина роговицы эквиваленты2.
Однако использование 3D инженерии тканей роговицы в контексте в vitro модели заболеванием учился дата отсутствует сходство структуры многослойного 3D ткани роговицы, функции и сетей различных типов клеток (то есть, нерв, эпителий, строма и эндотелием)2,3. Кроме того возрос спрос на в vitro модели ткани роговицы в попытке уменьшить животных испытаний фармацевтической продукции. Таким образом чтобы лучше соответствовать систем для физиологических потребностей человека требуются более сложные модели, и развитие модели, которая является более актуальной для популяции пациентов является абсолютно необходимым. Учитывая, что несколько типов клеток роговицы, пострадавших от заболеваний и дистрофии, как кератоконус, диабетическая Кератопатия и Фукс, эта модель включает в себя 3D Сопредседатель культуры модель первичной роговицы фибробластов (HCFs) от здоровых доноров и нейроны от SH-SY5Y линия клетки. Это позволяет нам в первый раз для изучения взаимодействия между типами две ячейки в пределах человеческой ткани роговицы. Мы считаем, что эта модель может потенциально вскрыть основные механизмы, связанные с взаимодействия стромальные нервных заболеваний роговицы, которые демонстрируют повреждения нерва. Эта 3D модель зеркала основных анатомических и физиологических характер ткани роговицы в естественных условиях и может использоваться в будущем как инструмент для расследования роговицы дефектов, а также проверки эффективности различных агентов до животных тестирования.
Introduction
В человеческом теле роговицы является наиболее плотно иннервируемые ткани. Нервы отвечают за различные ощущения, как прикосновение, боль, температура, а также играют важную роль в заживление ран, мерцание рефлексов, слезу производства и секреции5,6,7. В роговицы стромы нервных стволов возникают из послабляющие сплетения и радиально введите периферийных стромы роговицы. Стромальные нерв Организации параллельно с ламелями коллагена и они далее филиала в небольших брошюр, как они приступили к поверхностным стромы5,8. Нервных волокон далее проникать эпителиального пласта и таким образом, иннервация широко разбросаны по эпителия роговицы и стромы. Таким образом иннервации имеет важную роль в здоровых и больных состояние роговицы. В этом протоколе мы выявляем улучшения модели Роман 3D в пробирке , который является первым в своем роде для имитации взаимодействия стромальные нерва в естественных условиях . SH-SY5Y линия клетки была использована для этого исследования, как это один из самых известных, хорошо характеризуется линий, используемых для изучения нейрональных роста. SH-SY5Y клеточная линия была описана производить как сторонник субстрата (S-тип) и neuroblastic (N-тип) клетки, которые могут пройти transdifferentiation9. В результате даже несмотря на то, что эта линия клетки является производным от тройной последовательных subclone выбор N-типа клеток, он также содержит небольшое количество S-тип клеток, способных проходят дифференцировку в нейронах с помощью ретиноевой кислоты и мозга, полученных нейротрофических факторов9. Это представляет собой инструмент, который может привести к более глубокому пониманию роговицы осложнений, связанных с диабетической ретинопатии (DM) и других глазных заболеваний. Из-за трудностей, связанных с получением и культивирования нейроны от пациентов с глазной болезни эта модель 3D в vitro обеспечивает существенные последствия в изучении взаимодействия нейронов и сигнализации с стромы роговицы.
Часто больные условия влияют на различных тканях тела в очень больших масштабах, ведущих к угрозу качеству жизни. Глазной дистрофии являются общие осложнения часто ассоциируется с системными заболеваниями и привести к Потеря остроты или даже постоянного видения. Всеобъемлющие исследования часто необходимы для лучшего понимания состояния болезни, а также воздействие на клеточном уровне базальных. Для изучения последствий таких заболеваний, были разработаны различные модели в естественных условиях и в пробирке с помощью ткани, инженерных приложений. Ткани роговицы инженерных приложений имеют получил большой интерес в различных областях науки10,11,12,13,14, но есть еще крупные ограничения во время практического применения, включая роговицы графт отказов, инфекции и рубцов10,11,12,,1314. Есть несколько исследований, которые успешно разработаны и созданы различные в vitro модели3,,1516,17,18, 19,20,21,,2223,24,25,26. Модели 3D в vitro являются наиболее перспективных и большой научный интерес. 3D модели известны лучше зеркало в vivo сотовой и физиологических событий, которые являются критическими во время фиброз и ранение исцеления15,27,,28-29. Эти модели в vitro играют важную роль в поиске новых терапевтических подходов для лечения различных заболеваний включая роговицы осложнений. Несмотря на решающую роль иннервации роговицы функций был достигнут мало усилий для поощрения распространения периферических нервов в течение роговицы ткани инженерных конструкций2,3. Однако предлагаемые 3D в пробирке клеток конструкции имитировать ткани-мишени для достижения желаемого ткани функциональность.
В то время как диабетическая Кератопатия очевидное применение для модели, описанные здесь из-за дефектов нейронов, существует несколько других заболевания роговицы, которые могут принести пользу от человека в vitro модели, включая кератоконуса и Фукс дистрофии. Наши 3D модель выходит из этой перспективы и предлагает развитие представительства в vitro ткани роговицы оценить доставки лекарств и безопасность новой глазной лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует принципам Наблюдательный Совет университета Оклахомы медицинских наук Центр/институциональный (IRB #4509). Все части протокола встретился с принципами Декларации о Хельсинки. Роговицы образцы были получены от национального развития и научно-исследовательских института (НДРИ) и Ай Банк Оклахома львы.
1. изоляция первичных элементов
- После получения образцов тканей человека роговицы, передача тканей в 21,5 см2 Петри, содержащий 2 мл стерильного Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) (1 x).
- Скрип и удалите эпителия роговицы, позиционирование роговицы купол лицом вверх. Чтобы обеспечить полное удаление, соскрести эпителиального пласта, тщательно с использованием лезвие под углом 45°. Далее флип роговицы купол лицом вниз и тщательно соскрести эндотелия из стромы с лезвием бритвы под углом 45°, чтобы обеспечить полное удаление. Вымойте стромальные ткани с DPBS.
- Стромальные тканей мелко нарежьте, используя номер 10 хирургическое лезвие, сохраняя стромальные штук, мокрой на все время, с помощью DPBS. Забрать стромальные штук с стерильный пинцет и место в колбе T25 культуры без СМИ (4 или 5 кусков ткани 2 x 2 мм в колбу).
- Разрешить эксплантов присоединиться к нижней части колбы при 37 ° C для около 30-40 мин. После того, как соблюдение, медленно добавить минимум основных средних орла (EMEM) содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% антибиотик/противогрибковое на колбе не нарушая эксплантов.
- Осторожно поместите колбу в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2. Оставьте эксплантов нетронутыми до тех пор, пока клетки начинают изоляции и перенос в колбу. После приблизительно 2-4 недель клетки должны достичь 100% слияния. После 100% слияния проход клетки путем удаления средства массовой информации культуры ткани и вымыть клетки с DPBS.
- Добавить трипсина в клетки и инкубировать их в 37° C. После примерно 5 минут Просмотр клетки под световой микроскопии для подтверждения, что они частный, а затем остановить протеолиза, добавляя свежий СМИ.
- Перевести суспензию клеток в 15 мл Конические трубки для центрифугирования в 1000 x g. удалить супернатант тщательно не нарушая гранулы и приостановить клетки в свежих EMEM 10% FBS 1% антибиотиков. Подсчитать количество ячеек и семян около 1 х 106 клеток в T75 культуры Фляга для дальнейшего расширения с свежими EMEM 1% FBS 1% антибиотиков.
2. первичное HCFs культуры и 3D конструкций Ассамблеи
- Чтобы собрать 3D конструкций из эксплантах ранее выращивают в EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое, проход и количество HCFs.
- Семя примерно 1 х 106 клеток/колодец первичных HCFs на поликарбоната вставки мембраны с порами 0,4 мкм из 3D конструкций, наряду с 1,5 мл свежего EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое в верхней части конструкции. Добавьте еще 1,5 мл же средства массовой информации в нижней части каждой конструкции.
- После 24 ч клеток посева, культура клетки с EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое, стимулируется с 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислота (витамин С) добавления 1,5 мл на верхней и 1,5 мл в нижней части каждой конструкции.
- Поддержания культур в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 на 3 недели и поставлять свежие средства массовой информации каждый день в течение всего рассматриваемого периода. Необходимо без дальнейшего прохождения.
3. сотовый дифференциации и Сопредседатель культур
- После 3 недель, добавить 8 x 103 клеток/хорошо клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y на вершине ранее собранный 3D конструкций содержащего 1,5 мл ЕМЕМ, содержащие 10% FBS, 1% антибиотик/противогрибковое и 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислота (витамин С).
- Позволяют клеткам нейробластома SH-SY5Y расти на вершине стромальных клеток роговицы для по крайней мере 24 часа до начала дифференцировки клеток.
- Инициировать SH-SY5Y дифференцировки клеток, стимулируя ячейки с ЕМЕМ, содержащей 1% FBS и 1,5 мл 10 мкм ретиноевой кислоты на верхней части конструкции. Добавьте 1,5 мл EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислоты (витамин C) в нижней части конструкции. Обратите внимание, что шаг ретиноевой кислоты должна быть выполнена в темноте.
- Продолжать культуры клетки в этом дифференциация СМИ на 5 дней.
- Когда клетки достигают стадии дифференцировки, переключитесь в клетки 1,5 мл сыворотки свободных СМИ, содержащий 2 Нм мозга нейротрофического фактора (BDNF) и 1% антибиотик/противогрибковое добавляется ЕМЕМ, путем добавления к верхней части конструкции. Добавьте 1,5 мл EMEM 10% FBS 1% антибиотик/противогрибковое 0,5 мм 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic кислоты (витамин C) в нижней части конструкции. Обратите внимание, что BDNF шаг должен выполняться в темноте.
- Культура клетки для 2 дополнительных дней перед обработкой любого дальнейшего анализа как указано в таблице 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 — шаг за шагом представитель изображение 3D в vitro рабочей модели. На первом шаге клетки изолированы от человеческого роговицы. Затем они выросли на мембране поликарбоната и стимулировали с витамином С собрать самостоятельно секретируемые 3D-матрицы. Эта 3D конструкции системы индуцирует синтеза многослойных сотовых в естественных условиях-как стромальные матрицы. После этого нейробластома клетки являются семенами на вершине стромальные клетки, затем инициировав нейрональных клеток. Это приводит к совместно культуры роговицы стромальных клеток и дифференцированных нейрональных клеток в модели 3D в пробирке . Рисунок 2 – высокое увеличение передачи электронной микроскопии (ТЕА) изображение 3D собственн-собранные конструкции (рисунок 2A) показаны поликарбоната мембраны и роговицы стромальные клетки посеян на вершине, секретирующих собственн-собранные матрица следуют (рис. 2B) дифференцированных нейрональных клеток посеян на вершине показаны механизма стромальные клетки нейронов. Стрелки на рисунке показывают нейрональные клетки. Учитывая прямую перекрестных помех между стромой роговицы и нейронные клетки, мы считаем, что ключевые игроки, которые влияют на регулирование дефектов роговицы существует в строму слой. Таким образом эта модель представляет человека нейронов в vitro модель дифференциации SH-SY5Y нейробластома клетки в устойчивого морфологией нейронов, объединив его с нашей ранее установленных 3D модели внеклеточного матрикса (ECM) культивирования с различные факторы дифференциации. Таким образом мы предполагаем, что эта модель позволит будущие исследования молекулярных и морфологических различий между здоровыми и больными ECM. Мы считаем, что эта модель Роман 3D в vitro поможет вскрыть важнейшие аспекты стромы роговицы-нерва взаимодействий, связанных с патологии роговицы и проложить путь к разработке новых терапии.
Рисунок 1: иллюстративный изображением 3D в пробирке совместно культуры модель на основе поэтапного. Это изображение показывает изоляция клетки от человека роговицы и стромальных клеток посеян на мембране поликарбоната, расположен в 3D конструкции, культивируемых в EMEM и стимулировали с витамином с. Кроме того дифференцированной нейрональные клетки показано посеян на вершине стромальные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Высокое увеличение ТЕА образ системы 3D в пробирке . (A) стромальных клеток договоренности на вершине поликарбоната мембраны. (B) Seeded продифференцировано нейрональные клетки на вершине стромальные клетки. Масштаб баров = 500 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Методы анализа | Потенциальные последствия |
Количественные реального времени полимеразная цепная реакция | Исследовать маркеры коллагена (Col я, коль III и Col V), фиброзных маркер альфа гладких мышц актина (α-SMA) и ключевых посредников в дм, включая инсулин фактор роста-1 (ИФР-1) и он это рецептор (IGF1-R) |
Просвечивающей электронной микроскопии | Структурные изменения рассматриваются как фибрилл коллагена и взаимодействия клеток ECM |
Иммунофлуоресценции | Использование специфических антител, химически конъюгированных Люминесцентную краску расследовать клеточных антигенов |
Таблица 1: Методы анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько исследований были сосредоточены на разработке различных животных моделей, которые могут помочь в разработке более глубокого понимания заболевания роговицы, а также обнаружить лечения. Однако важное значение для людей из этих исследований не была проверена. На сегодняшний день, различные в vitro модели разработаны и широко расследование из-за их замечательные клиническое значение. Наша модель ранее установленных 3D в пробирке является роман системы, что значительно способствует достижений медицинской науки в исследованиях видение и показывает безупречный способность о перечислении в vivo события в vitro28 , 29 , 30. Цель настоящего Протокола заключается в разработке нового поколения в vitro роговицы модели, могут быть использованы для изучения молекулярных и клеточных механизмов осложнений, связанных с роговицы заболеваний, таких как диабетическая Кератопатия, кератоконуса и Фукс. Такие улучшения может обеспечить прочную основу к открытию новых методов лечения, которые столь необходимых клинически.
Эта модель может помочь в выявлении различных структурных и клеточные изменения происходящие в DM и других заболеваниях роговицы. Это обеспечивает существенные последствия, включая возможность для скрининга для этих заболеваний на начальном этапе потенциально помочь с болезнями. Предложена модель здесь прост, но это весьма новаторским. Одним из наиболее значительных преимуществ является, что разрешены роговицы стромальные клетки выделяют и собрать их собственных ECM вместо посеян на искусственной среде. Кроме того нервы могут дифференцировать более точно модель взаимодействия стромы роговицы нерва. Следовательно этот метод обеспечивает возможность изучить человека стромы роговицы и нервные сети, а также клетки, которые находятся в окружающей среде стромы. Этот культурный платформа позволит будущих расследований сложных ячеек и ячеек матрицы взаимодействий, которые влияют больной государства роговицы. Эта модель 3D в vitro подход предполагается обеспечить улучшение и Роман проницательность в механизм болезни, особенно по сравнению с текущими обычными культура систем или Животные модели.
Описанные поколения этой модели 3D в пробирке проложит путь для будущих терапевтического лечения и открытий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить искреннюю признательность д-р Бен Фаулер за его техническую помощь ТЕА экспериментов.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
Wax block | VWR | 50-949-027 | |
SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).