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Cancer Research

乳腺癌细胞系外周血单核细胞破的人前临床模型的建立

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

Summary

该协议描述了一个体外的发展, 从外周血单核细胞中培养的乳癌细胞系破人前模型, 模拟癌细胞-破骨细胞的相互作用。该模型可用于进一步了解骨转移形成和改善治疗方案。

Abstract

骨微环境中肿瘤细胞与骨细胞之间的串扰是了解骨转移形成机制的关键。我们开发了一个体外完全人前模型的乳腺癌细胞共培养和单核化的分化为破骨病。我们优化了一个模型的破开始从一个样本的外周血从健康的捐助者收集。外周血单个核细胞 (PBMCs) 首先通过密度梯度离心分离, 在高密度下播种, 并通过增加两种生长因子诱导分化 (GFs): 核因子-nf-配体 (RANKL) 和巨噬细胞的受体激活剂集激发因子 (MCSF). 细胞被留在培养14天, 然后通过下游分析固定和分析。在骨骨转移, 肿瘤细胞到达骨的影响之一是诱导破。因此, 我们挑战我们的模型与 co-cultures 乳腺癌细胞, 以研究的分化能力的癌细胞与 GFs 有关。一个直接的方法研究癌细胞-破骨细胞相互作用是执行间接 co-cultures 的基础上, 利用条件培养基收集的乳腺癌细胞培养和混合新鲜培养基。这种混合物用于诱导破骨细胞分化。我们还优化了直接共培养的方法, 其中癌细胞和单核细胞的分化分享媒介和交换分泌的因素。这是一个显著的改进, 在原来的间接共培养方法, 因为研究人员可以观察两个细胞类型的相互作用, 并执行下游分析的癌细胞和破骨细胞。这种方法使我们能够研究药物对转移性骨微环境的影响, 以及除乳腺癌以外的种子细胞株。该模型还可用于研究其他疾病, 如骨质疏松症或其他骨骼条件。

Introduction

骨是一种常见的转移为不同类型的原发性肿瘤, 如前列腺癌, 肺癌和乳腺癌, 20-25% 的病人发展骨转移在疾病过程中1,2,3。特别是, 70% 的乳腺癌患者携带骨转移的证据在死亡4。肿瘤和基质细胞的相互作用是癌症进展的主要癌症和继发性病变。在骨骼微环境中, 乳腺癌的骨骨转移依赖于肿瘤细胞、骨细胞和骨微环境之间的病理恶性循环的建立。肿瘤细胞破坏骨平衡, 增加骨吸收5,6,7。

在正常和病理条件下, 破骨细胞是负责骨质吸收的单元, 而骨细胞, 在沉积新的基质, 负责新骨形成8。破骨细胞的活性通过 RANKL 的表达来调节, 这与其受体在 pre-osteoclast 表面的排列有关, 诱导 pre-osteoclast 融合, 这是分化为成熟破骨的必要过程。诱导破增加骨吸收。大量的体内研究显著提高了我们对骨转移形成的认识9,10,11。乳腺癌细胞从原发肿瘤和骨微环境扰乱骨内稳态, 促进破和骨吸收8。在这种情况下, 所有的分子相互作用发生在癌细胞和破骨细胞之间是至关重要的。正如已经提到的, 骨转移形成的机制已在体内小鼠模型中阐明。然而, 除了需要批准的所有在体内动物实验的伦理委员会, 有几个其他缺点, 以执行在体内实验, 包括高成本和耗时的方法。一些作者将临床前的在体内和体外模型的破使用小鼠线的 pre-osteoclasts 称为 RAW246.79,10,11。这个模型的缺点是由于细胞已经致力于成为 pre-osteoclasts, 而不是人类的起源。由于这些原因, 转化研究可以大大受益于体外充分的人前临床模型研究骨肿瘤细胞的相互作用。

我们优化了破体外的方法, 从人外周血样本开始,12,13。破骨细胞来源于单核细胞, 虽然在很小程度上存在于外周血标本中。通过聚密度梯度将单个核细胞从红细胞和粒中分离出来;他们然后选择, 由于他们的能力坚持塑料基板, 不同于淋巴细胞。播种后, 细胞培养14天。MCSF 和 RANKL 是单核细胞所需的 GFs, 以先分化成巨噬, 然后再进入破骨14,15。MCSF 是需要的整个期间的化验, 而 RANKL 是用来诱导分化过程的后期阶段的破。在分化的早期阶段, MCSF 帮助单核细胞增殖并存活14,15。在破的第二部分, 细胞融合并成熟为破骨, 显示了肌动蛋白 F 在环中的特征分布, 并表达了抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 和降钙素受体等特异标记物中心)14,15. 我们的方法包括在实验的前7天将 MCSF 添加到单核细胞培养中, 并结合 MCSF 和 RANKL 从7天到14。在实验结束时, 破通过计数的分化细胞进行分析, 详见下文。

由 GFs 诱导分化的单核细胞培养是我们临床前模型的基础。我们优化了一个没有 GFs 的共培养系统, 以更好地了解乳腺癌细胞的 osteoclastogenic 能力。我们首先开发了一个间接 co-cultures 的模型, 添加了一个培养基 (80% α-最低基本培养基 (α-记忆) 和20% 条件培养基, 从培养的乳腺癌细胞, 约90% 融合到细胞进行分化12.条件培养基 (未在血清剥夺状态下收集) 在24小时后收集, 并与新鲜培养基混合, 比例为1:4。条件培养基诱导的破骨细胞分化与阴性对照有关。然而, 当使用间接 co-cultures 时, 由于癌细胞与骨细胞相互作用的信息丢失, 我们通过直接 co-cultures 来改善我们的系统。我们在0.4 µM 的插入物中植入癌细胞, 并将它们放置在单核细胞被电镀的井中。使用这种方法, 细胞共享相同的培养基和交换分泌的蛋白质。因此, 我们创造了一个完整的人类临床前模型的破诱导肿瘤细胞13。

这个系统是非常多才多艺的, 可以用于不同的研究目的,例如, 在药理研究中的作用, 调查药物在骨转移。我们的模型使得有可能研究骨靶向治疗和/或抗肿瘤药物在肿瘤细胞存在的作用和机制13。用正确的控制方法设计实验,即, 单独培养的癌细胞和破骨细胞, 使人们更容易理解共育对药物活动的影响。当研究的药物靶向癌细胞和破骨细胞时, 这种方法变得更加有趣,例如, 司16。这个模型也可以用来识别癌细胞和骨细胞之间相互作用的新途径。

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Protocol

人破骨细胞与 PBMCs 的健康献血者有区别, 他们书面知情同意参与研究。根据1964《赫尔辛基宣言》中规定的道德标准, 该研究方案得到地方道德委员会的批准.

1. 破骨细胞分化

注意: 在 EDTA 中收集健康的人类捐献者的外周血或棕黄色大衣。不要使用少于20毫升的外周血。巴比大衣更可取, 因为它们有更丰富的单核细胞。在无菌组织培养罩中执行以下步骤.

  1. 稀释 EDTA 全血1:1 与1x 磷酸缓冲盐水 (PBS)。重新挂起.
  2. 淋巴细胞分离培养基上的层 (血液 PBS: 淋巴细胞分离培养基, 2:1) 在50毫升管。
    1. 吸管30毫升血液稀释到50毫升管.
    2. 将15毫升的淋巴细胞分离培养基轻轻地放在50毫升的管子底部.
  3. 757 和 #215 离心机; g 为10分钟的室温 (无刹车).
  4. 收集单个核细胞:
    1. 用5毫升吸管收集单个核细胞的白色层, 无需搅拌, 并将其放入新的50毫升管中.
    2. 用20毫升 PBS 稀释收集的 PBMCs.
  5. 清洗 PBMCs:
    1. 在室温下以 225 x g 离心5分钟。
    2. 通过倒置管丢弃上清。重复一次.
  6. 红细胞裂解:
    注意: 如果细胞颗粒是红色的, 用红细胞溶缓冲液处理细胞 (参见 材料表 )。
    1. 将50毫升的管子放在冰上.
    2. 添加5毫升的红血球溶缓冲.
    3. 等待 3-5 分钟完成红细胞裂解。时间根据红细胞污染程度而变化.
    4. 通过添加20毫升 PBS 来停止反应.
    5. 在室温下离心 225 x g, 5 分钟。通过倒置管丢弃上清.
      注: 可选: 如果进行红细胞裂解, 请按照下面的说明清洗 PBMCs.
  7. 清洗 PBMCs:
    1. 在室温下, 在 225 x g 处添加20毫升 PBS 和离心机, 5 分钟.
    2. 通过倒置管丢弃上清.
  8. 在完全和 #945 中重新挂起单元格;-内存 (补充1% 谷氨酰胺 (初始浓度 100X) 和10% 胎牛血清).
  9. 用 Neubauer 室计数单元格。
    1. 将冰乙酸中的样品1:100 稀释并使用10和 #181; 稀释的 L 以计数细胞.
    2. 计数至少两次并计算复制的平均值以获取所收集的单元格的总平均数量.
  10. 板单元格:
    1. 每 cm 的浓度为 75万 PBMCs 的板单元格 2 。
    2. 在37和 #176 的恒温箱中存储镀膜细胞; C 在 5% CO 2 大气中.
      注: 设计实验, 包括负控制, 这是处理与正常完整和 #945 的单元;-没有 MCSF 或 RANKL GFs. 记住在至少3技术复制中执行每个条件。执行至少3生物复制.
  11. 更改与 GFs 一起补充的介质:
    1. 在单元播种后等待约3小时, 然后移除介质 (200-1000 和 #181; L) 以丢弃碎片、未连接的细胞和红细胞.
      注意: 更换培养基时要小心, 避免细胞脱落.
    2. 添加新的完整 #945;-MCSF (500 和 #181 的 20 ng/毫升) 补充.
      注: 当大块与癌细胞, 种子的癌细胞 PBMC 播种后的一天.
  12. 每隔 2-3 天 (& #945) 更改媒体:
    1. 用 200-1000 和 #181 丢弃介质; L 吸管.
    2. 通过 200-1000 和 #181 添加新的新鲜培养基; L 吸管.
  13. 在单元播种后6-7 天内, 添加 20 ng/毫升的 RANKL 以完成和 #945;-内存 + MCSF.
  14. 每2-3 天更改一次介质 (完整和 #945;-内存 + MCSF + RANKL):
    1. 用 200-1000 和 #181 丢弃介质; L 吸管.
    2. 添加 200-1000 和 #181 的新介质; L 吸管。细胞播种后14天停止诱导分化.
    3. 丢弃介质并使用 PBS 清洗两次.
  15. 使用甲醛修复单元格:
    1. 将单元格保留为干燥.
    2. 添加4% 甲醛 (请参见 材料表 ).
    3. 室温孵育20分钟.
  16. 丢弃甲醛并用500和 #181 清洗两次; PBS 的 L.
    警告: 甲醛有毒;请戴上手套、口罩和眼镜.
  17. 允许单元格干燥.
  18. 根据制造商和 #39 的说明执行陷印着色 (请参阅 材料表 ).
  19. 在放大镜下, 在显微镜下手动计数破骨样细胞 10X;NA 0.30.
    注: 破骨样细胞被定义为具有至少4核的陷阱 + polycarion 细胞.

2。癌细胞培养

注意: 可以使用不同类型的乳腺腺癌细胞系进行实验, 如 SCP2 17 , 这是一个 osteotropic 细胞系, 来源于三重负人乳腺癌细胞系 (MDA-MB-231) 和激素受体阳性细胞系 MCF7.

  1. 将单元格作为单层在75厘米的 2 烧瓶中进行培养。
    1. 种子100万的癌细胞在75厘米的 2 烧瓶中。
    2. 将单元格存储在37和 #176; C 在完整和 #945 中, 在 5% CO 2 大气层中补充1% 谷氨酰胺和10% 胎牛血清.
  2. 将单元格分离到大约 90% 70-100:
    1. 丢弃介质, 用 pbs 进行洗涤, 并在 pbs 中添加 2-3 毫升的胰蛋白酶 1X.
    2. 在37和 #176 孵育细胞3-5 分钟; C.
    3. 从75厘米 2 烧瓶中收集分离的细胞由10毫升吸管, 添加8毫升的完整培养基停止酶反应.
    4. 225 x g 离心5分钟.
  3. 清洗癌细胞:
    1. 添加10毫升的 PBS.
    2. 600 x g 离心5分钟.
  4. 用 Neubauer 室计数癌细胞。
    1. 至少计算两次癌细胞的数量, 并算出复制的平均值, 以获取所收集的细胞总数.

3。癌细胞和单核细胞的直接共培养对破骨干细胞的分化作用

  1. 在插入物上种癌细胞 (孔径0.4 和 #181; m):
    1. 种子癌细胞的浓度为4000细胞每厘米 2 。
    2. 孵育于37和 #176; C 和 5% CO 2 .
      注: 在0.4 和 #181 的共培养实验 PBMC 播种后的一天, 种子的癌细胞; m 插入.
  2. 等待24小时以允许单元格粘附.
  3. 将种子插入区域性置于单核区域性上以开始共培养 (参见协议1.10 节)
  4. 每 2-3 天更改媒体, 并完成 #945;
    1. 丢弃 200-1000 和 #181 的介质; L 吸管.
    2. 添加500和 #181; L 的新鲜培养基.
      注: 共培养的主要目的是了解癌细胞的 osteoclastogenic 能力, 因此, GFs 不会添加到和 #945;在每次共培养实验中, 包括 negative 控制 (见《议定书》步骤1.10 中的说明) 和 RANKL 和 MCSF (无癌细胞) 区分的破骨细胞阳性控制。在未放置于单个核细胞的插入物中的癌细胞被用作对共培养的阴性控制.
  5. 停止共培养并使用肿瘤细胞进行下游分析:
    1. 在 PBMC 播种后13天和癌症细胞播种后12天, 将插入物放在新的盘子上.
    2. 停止癌症细胞培养, 并在此基础上进行下游分析 (请参阅 讨论 ).
  6. 14 天, 停止破骨细胞分化并修复单元格, 如步骤1.15 所述.
  7. 立即或在 14-30 天内执行陷阱染色.
    注: 可选染色: 为了证实陷阱 + polycarion 细胞是破骨, 研究人员可以执行额外的染色检测的中心, 一个破骨特异的标志物。F 肌动蛋白环的检测是另一种破骨细胞特异染色方法 12 , 13 , 14 。

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Representative Results

优化了一种从人外周血单核细胞中易分化破骨的方法。单核细胞培养与癌细胞, 证实 (如文献中所描述的18), 癌细胞能够维持破骨转移。在图 1中显示了与癌细胞和 GFs 区分的破骨细胞。破骨样细胞是具有4或更多核的细胞, 对诱捕染色 (紫色细胞) 是阳性的。用于定义破骨细胞的细胞核数量的被接受的截止值是 318, 但我们决定使用4来减少误报的风险。

该模型显示, 乳腺癌细胞持续破, 因为癌细胞诱导的破骨细胞数量与阳性对照 (图 2) 相似。如图 2A所示, 许多细胞也在负控制中自发地分化成破骨。为了证实该模型的实用性, 该系统受到抗肿瘤药物的挑战12,13。在共培养条件和阳性对照样品中, 破骨细胞数高于阴性对照 (点击率) 样本。破骨细胞的数量在药物 (司) 的存在中明显减少, 在共培养条件和阳性对照 (中心 +)。t 检验用于统计分析。每井细胞计数。破骨细胞表面 areaof 是一个成熟的特征, 可以利用 ImageJ 等开源软件进行分析。从 GFs 中获得的破骨细胞比癌细胞所诱发的高 (图 2B) 大。治疗与抗肿瘤药物 (司) 关闭了 GFs 的影响。该模型提供了有关药物在破抑制作用的有用信息。图 2C显示在药物出现时破减少。这些结果是由共培养诱导的破。如协议部分所述, 可以进行一些其他下游分析, 以调查串扰和/或分析药物的机制。在图 3中总结的模型是高度 versatileand 的, 可以用来研究药物对癌细胞的影响, 特别是破骨细胞。

Figure 1
图1。破化验.细胞在培养后14天染色。在缺乏生长因子的情况下培养的单核细胞;RANKL 和 MCSF 生长因子培养的单核细胞可可, 用癌细胞大块血细胞获得的破骨细胞。10X 放大倍数。破骨样细胞是细胞, 至少有4核是积极的陷阱 (紫色细胞)。细胞通过计数每个井中的细胞进行量化;对每个条件执行4复制, 并计算平均值。刻度条是400µm。下面板 (100X) 中的图像缩放显示了2破骨细胞 (红色圆圈) 的表面积。箭头表明破骨细胞核。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。司对破治疗的影响.(a) 根据药物的存在/缺失而破骨细胞的数量;对每个条件进行了4复制。在缺乏生长因子的情况下培养的单核细胞;RANKL 和 MCSF 生长因子培养的单核细胞可可, 用癌细胞大块血细胞获得的破骨细胞。数据被表示为平均± SE。t 检验评价其意义;* p 和 #60; 0.05。(B) 破骨细胞表面积由 ImageJ 开源软件计算。每个条件至少50破骨细胞测量。在缺乏生长因子的情况下培养的单核细胞;RANKL 和 MCSF 生长因子培养的单核细胞可可, 用癌细胞大块血细胞获得的破骨细胞。(C) 在没有或存在抗肿瘤药物 (司) 的情况下, 在14天内培养细胞的图像。10X 放大倍数;缩放条是400µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。共文化模式.模型的方案及其可能的下游分析和未来的应用。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

临床前体外模型研究肿瘤细胞与骨细胞之间的串扰机制, 需要确定骨转移的机制, 以建立新的治疗策略。我们开发了一个完全人的体外模型的人外周血破 (图 3)。在方法优化过程中, 确定和解决了一些关键点。第一个是关于单个核细胞数量的种子。通过显微镜计数获得的细胞数量只是一个粗略的定量, 因为它很难区分淋巴细胞和单核细胞, 后者是破实验中的靶体细胞。我们能够识别单核细胞, 因为淋巴细胞不坚持塑料基质, 因此大多数被淘汰的第一次改变的培养基。细胞被播种在高密度, 因为它是必要的细胞能够相互作用, 以区别, 特别是在第二阶段的破, 其中 pre-osteoclasts 需要密切结合, 以融合和成为成熟的破骨细胞当有多个实验条件, 因为这些需要大量的细胞和大量的血液时, 就会出现进一步的困难。一个可能的解决方案是使用具有高浓度的 PBMCs,例如, 4 x 105-6 x 106单个核细胞通常从50毫升的棕黄色大衣样本中收集, 而少于 1 x 105 PBMCs 从20毫升血液样本

随着血液样本从不同的志愿者收集, 有一定程度的变异性的破测定。因此, 对每种化验进行至少3-4 技术复制是很重要的。生物复制也需要, 由于使用了不同的健康捐赠者, 我们通常不计算不同实验所获得的值的平均值。我们确保不同的测试的趋势是等价的, 然后选择一个实验从一个健康的捐助者将包括在手稿中。

我们的临床前模型涉及大块的单核细胞与癌细胞分化。正如我们以前所显示的, 癌细胞也可以维持在体外破12,13。该系统可用于测试药物或研究相互作用的机制, 因为它可以对癌细胞和破骨细胞进行多项下游分析。事实上, 有可能对癌细胞和基因表达分析进行增殖化验, 同时也可以对癌症细胞和破骨细胞膜进行免疫测定, 这两种检测都是13。这将是有趣的了解如何在不同的条件下分泌蛋白的差异。我们的模型有许多优点,即, 它是一个完全人类模型, 不依赖于小鼠细胞系, 不同于文献中报道的几个模型。该模型还具有相当的健壮性和重现性, 可以用于其他用途。例如, 其他癌细胞系可以共破骨细胞和他们的 osteoclastogenic 力量的差异研究。此外, 该系统可用于评估其他生理或病理机制, 以提高我们对骨生物学和破骨细胞介导的疾病, 如骨质疏松症的认识。其他细胞因子和细胞类型也可以与破骨共结合, 这取决于实验的目的。

这一模型可以进行一些下游分析。重要的是要决定在设计阶段的研究, 将进行什么分析, 以便有足够数量的水井可以播种。

与破骨细胞的下游化验:

(i) 基因表达分析。计划额外水井的破骨细胞提取总 rna, 因为水井染色的陷阱评估是不可用的 rna 提取。(二) 免疫印迹分析。(iii) 对破骨细胞表面积进行量化。破骨细胞大小是破骨细胞成熟的一个参数, 可以使用 ImageJ 等开源软件进行量化。

癌症细胞的下游化验:

(一) 增殖测定, 如 MTT 3-(45-dimethylthiazol-2-基)-25-diphenyltetrazolium 溴化物。(二) 基因表达分析。(三) 免疫印迹分析。

与破骨细胞和癌细胞 (共培养) 的下游化验:

由于癌细胞和破骨细胞具有相同的培养基, 它们的相互作用可以通过 analyzesthe 分泌特定细胞因子、GFs 和其他分泌蛋白的 ELISA 法进行研究。

这一模式的发展对我们的项目至关重要, 我们计划在不久的将来进一步改进它。一个重要的步骤将是区分单核细胞在3D 矿化胶原支架模拟骨基质。然后可以用骨吸收法直接评估破骨细胞的活动。当我们继续了解破骨细胞在从骨骼重塑到调节骨转移等生理和病理过程中所扮演的不同角色时, 我们的模型将使研究人员能够在体外分离和研究破骨。.

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Disclosures

作者没有利益冲突透露。

Acknowledgments

我们要感谢宜宾康提供 SCP2 细胞系和罗纳尔多佛娜的编辑协助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Euroclone BE12-169F
Glutamine Life-technologies ECB3000D
Fetal bovine serum Life-technologies ECS0180DPR
hMCSF Peprotech 300-25 Storage indications must be respected
hRANKL Peprotech 310-01 Storage indications must be respected
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma Aldrich 387 A
Lymphocyte separation media Biowest L0560-100
Red Blood cell lysing buffer SIgma 11814389001
ROCHE
Trypsin EuroClone COD.
ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
MDA-MB-231 cell line ATCC CRM-HTB-267
MCF7 ATCC HTB-22
Transwell Corning 3470-Clear These inserts are for 24-well plates;
6.5 mm, 0.4 μM;
pore size

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References

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