Summary
Denne protokol beskriver udviklingen af en in vitro- humane prækliniske model af osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter kulturperler med bryst kræft cellelinjer til at efterligne kræft celle-osteoklast interaktion. Modellen kan bruges til at fremme vores forståelse af metastaser knogledannelse og forbedre terapeutiske muligheder.
Abstract
Krydstale mellem tumorceller og knogleceller i knoglen mikromiljø er afgørende for at forstå mekanismen af knogledannelse metastaser. Vi udviklede en in vitro- fuldt humane prækliniske model af en fælles kultur af brystkræftceller og monocytter gennemgår differentiering mod osteoklaster. Vi optimeret en model af osteoclastogenesis med udgangspunkt i en stikprøve af perifert blod indsamlet fra raske donorer. Perifert blod mononukleære celler (PBMC) først blev adskilt af tæthed gradient centrifugering, seedet på en høj densitet og tilskyndet til at differentiere ved at tilføje to vækstfaktorer (GFs): receptor aktivator af nuklear factor-κB ligand (RANKL) og makrofag koloni-stimulerende faktor (MCSF). Cellerne blev efterladt i kultur i 14 dage og derefter fastsættes og analyseret af downstream analyse. I osteolytiske knoglemetastaser er en af virkningerne af kræft celle ankomst i knoglen induktion af osteoclastogenesis. Vi udfordrede dermed vores model med co kulturer af brystkræftceller at studere kræftceller med hensyn til GFs differentiering magt. En enkel måde at studere kræft celle-osteoklast interaktion er at udføre indirekte Co kulturer baseret på brugen af aircondition medium indsamlet fra bryst kræft cellekulturer og blandet med frisk medium. Denne blanding er derefter anvendes til at fremkalde osteoklast differentiering. Vi har også optimeret en metode til direkte Co kultur i hvilke kræft celler og monocytter gennemgår differentiering del medium og udveksle udskilles faktorer. Dette er en betydelig forbedring over den oprindelige indirekte Co kultur metode som forskere kan observere de gensidige interaktioner af to celletyper og udføre downstream analyser for både kræftceller og osteoklaster. Denne metode gør det muligt for os at studere effekten af lægemidler på metastatisk knogle mikromiljø og frø cellelinjer end dem, der stammer fra brystkræft. Modellen kan også bruges til at studere andre sygdomme såsom osteoporose eller andre knogler betingelser.
Introduction
Knoglen er et fælles websted for metastaser til forskellige typer af primære tumorer såsom prostata-, lunge- og brystkræft kræft, med 20-25% af patienter, der udvikler knoglemetastaser i løbet af sygdommen1,2,3. 70% af brystkræftpatienter bære navnlig tegn på knogle metastaser død4. Tumor og stromale celle interaktion er afgørende for kræft progression i både primær kræft og sekundære læsioner. I knogle mikromiljø afhænge osteolytiske knoglemetastaser fra brystkræft af oprettelsen af en patologisk ond cirkel mellem kræftceller, knogleceller og knogle mikromiljø. Kræftceller forstyrre knogle balance, øge knogle resorption5,6,7.
Under normale og patologiske forhold er osteoklaster de celler der er ansvarlig for knogleresorption, mens osteoblaster, i deponeringen nye matrix, er ansvarlig for ny knogle dannelse8. Osteoklast aktivitet er reguleret af osteoblaster gennem udtryk af RANKL, som binder sig til sin receptor rang på pre osteoklast overflade, inducerende pre osteoklast fusion, en nødvendig proces for differentiering af modne osteoklaster. Induktion af osteoclastogenesis øger knogleresorption. Et stort antal i vivo undersøgelser har markant forbedret vores forståelse af knogle metastaser dannelse9,10,11. Brystkræftceller fra den primære tumor, knoglen mikromiljø forurolige knogle homøostase, fremme osteoclastogenesis og knogle resorption8. I dette scenario er alle de molekylære vekselvirkninger der sker mellem kræftceller og osteoklaster af afgørende betydning. Som allerede nævnt, er mekanismen af metastaser knogledannelse klarlagt i i vivo mus modeller. Men ud over behovet for godkendelse af alle i vivo dyreforsøg ved den etiske komité, der er flere andre ulemper til at udføre i vivo forsøg herunder høje omkostninger og tidskrævende metoder. Flere forfattere har kombineret prækliniske i vivo og in vitro- modeller af osteoclastogenesis ved hjælp af en murine linje af pre osteoklaster kaldet RAW246.79,10,11. Ulemperne ved denne model skyldes, at cellerne er allerede forpligtet til at blive pre osteoklasterne og der ikke er af menneskelig oprindelse. Af disse grunde kunne Translationel forskning stor gavn af tilgængelighed af in vitro- fuldt humane prækliniske modeller at studere knogle kræft celle interaktioner.
Vi optimeret en metode af osteoclastogenesis in vitro- startende fra humant perifert blod prøver12,13. Osteoklaster stammer fra monocytter, som er til stede, omend i en lille grad i perifert blodprøver. Mononukleære celler er først adskilt fra erytrocytter og granulocytter i fuldblod af Ficoll tæthed farveforløb; de er derefter valgt takket være deres evne til at overholde plastunderlag, i modsætning til lymfocytter. Efter såning, er celler dyrkes i 14 dage. MCSF og RANKL er GFs kræves af monocytter at differentiere først i makrofager og derefter ind i osteoklaster14,15. MCSF er nødvendig for den samlede varighed af analysen, hvorimod RANKL bruges til at inducere differentiering proces i de sene stadier af osteoclastogenesis. I den tidlige fase af differentiering hjælper MCSF monocytter formere sig og overleve14,15. Under anden del af osteoclastogenesis celler smelter sammen og modne som osteoklaster, viser den karakteristiske distribution af Actin F i ringe og udtrykke specifikke markører som tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) og calcitonin receptor (CTR) 14 , 15. vores metode består i at føje MCSF til monocyt kultur for de første 7 dage for forsøget, og en kombination af MCSF og RANKL fra dage 7 til 14. I slutningen af forsøget, er osteoclastogenesis analyseret ved at tælle de differentierede celler, som beskrevet nedenfor.
Monocyt kulturer induceret differentiering af GFs danner grundlag for vores prækliniske model. Vi optimeret en fælles kultur system uden GFs til bedre at forstå osteoclastogenic effekt af brystkræftceller. Vi først udviklet en model af indirekte Co kulturer ved at tilføje et medium (80% α-Minimal afgørende Medium (α-MEM) og 20% aircondition medium indsamlet fra en kultur af brystkræftceller at var omkring 90% sammenflydende celler under differentiering12 . Konditioneret medium (ikke indsamlet på serum afsavn betingelser) blev indsamlet efter 24 timer og blandet med frisk medium på en del af 1:4. Konditioneret medium induceret betydelig osteoklast differentiering med hensyn til den negative kontrol. Men som information om den gensidige interaktion mellem kræftceller og knogleceller går tabt, når ved hjælp af indirekte Co kulturer, vi forbedret vores system ved at gennemføre direkte Co kulturer. Vi seedede kræftceller i 0,4 µM indsætter og placeret dem i brønde hvor mononukleære celler blev forgyldt. Brug denne metode, celler deler samme medium og udveksle udskilles proteiner. Vi har således skabt et fuldt humane prækliniske model af osteoclastogenesis induceret af kræft celler13.
Dette system er meget alsidig og kan anvendes til forskellige formål, fxi farmakologiske undersøgelser undersøger rollen, narkotika i knogle metastaser. Vores model gør det muligt at studere den effekt og virkningsmekanisme af knogle-målrettede behandlinger og/eller antitumor narkotika i knoglen mikromiljø i overværelse af kræft celler13. Designe eksperimenter med den korrekte kontrol, gør dvs., kræftceller og osteoklaster kulturperler individuelt, det lettere at forstå konsekvenserne af fælles kultur på stof aktivitet. Denne fremgangsmåde bliver endnu mere interessante når stoffet undersøges mod både kræft-celler og osteoklaster, fxeverolimus-16. Denne model kan også bruges til at identificere nye veje i vekselvirkning mellem kræftceller og knogleceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
menneskelige osteoklaster blev differentieret fra PBMC af raske donorer, der gav skriftlig informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det lokale etiske udvalg, i overensstemmelse med de etiske normer af Helsinki-erklæringen fra 1964.
1. osteoklast differentiering
Bemærk: indsamle perifert blod eller buffy frakker fra sunde menneskelige donorer i EDTA. Brug ikke mindre end 20 mL af perifert blod. Buffy frakker er at foretrække, fordi de har en større overflod af mononukleære celler. Udfør følgende trin i en steril vævskultur hætte.
- Fortyndes EDTA fuldblod 1:1 med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Genopslæmmes godt.
- Lag på lymfocyt adskillelse medier (blod PBS: lymfocyt adskillelse medier, 2:1) i 50 mL rør.
- 30 mL blod fortyndes i PBS i en 50 mL tube afpipetteres.
- Forsigtigt underlag 15 mL af lymfocyt adskillelse medier ind i bunden af 50 mL tube.
- Centrifugeres ved 757 × g i 10 min. ved stuetemperatur (uden bremser).
- Indsamling af mononukleære celler:
- indsamle det hvide lag af mononukleære celler med 5 mL pipette uden agiterer og placere det i en ny 50 mL tube.
- Fortyndes de indsamlede PBMC med 20 mL PBS.
- Vask PBMC:
- centrifugeres ved 225 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten ved at vende røret. Gentag engang.
- RBC lysis:
Bemærk: Hvis den celle pellet er rød, behandle celler med røde blodlegemer lysing bufferopløsning (Se Tabel af materialer).- Sætte 50 mL tube på ice.
- Tilsættes 5 mL af røde blodlegemer lysing buffer.
- Vente 3-5 min for at fuldføre erytrocyt lysering. Tid varierer afhængigt af graden af erytrocyt kontaminering.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 20 mL PBS.
- Centrifuge på 225 x g i 5 min ved stuetemperatur. Supernatanten ved at vende røret.
Bemærk: Valgfri: Hvis RBC lysis udføres, vaske PBMC som beskrevet nedenfor.
- Vask PBMC:
- tilsættes 20 mL PBS og centrifugeres ved 225 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten ved at vende røret.
- Genopslæmmes celler i komplet α-MEM (suppleret med 1% glutamin (begyndelseskoncentration 100 X) og 10% føtal bovint serum).
- Tælle celler med en Neubauer kammer.
- Fortynd prøven 1: 100 i iseddike og bruge 10 µL af fortynding tælle celler.
- Tæller mindst to gange og beregne middelværdien af flergangsbestemmelser at få det samlede gennemsnitlige antal celler indsamlede.
- Plade celler:
- plade celler i en koncentration på 750.000 PBMC per cm 2.
- Gemme forgyldt celler i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO 2 atmosfære.
Bemærk: Design eksperiment til at omfatte negative kontroller, der er celler, der er behandlet med normal komplet α-MEM uden MCSF eller RANKL GFs. Husk at udføre hver tilstand i mindst 3 tekniske replikater. Udføre mindst 3 biologiske replikater.
- Ændre medium suppleret med GFs:
- vente omkring 3 h efter celle såning og derefter fjerne medium med pipette (200-1.000 µL) at kassere vragrester, løstliggende celler og erytrocytter.
Bemærk: Vær forsigtig, når skiftende medium for at undgå celle detachement. - Tilføje nye komplet α-MEM suppleret med 20 ng/mL af MCSF (500 µL/brønd).
Bemærk: Når Co dyrkning med kræftceller, frø kræft celler dagen efter PBMC seeding.
- vente omkring 3 h efter celle såning og derefter fjerne medium med pipette (200-1.000 µL) at kassere vragrester, løstliggende celler og erytrocytter.
- Ændre medierne hver 2-3 dage (α-MEM suppleret med 20 ng/mL MCSF):
- kassere medium med 200-1.000 µL pipette.
- Tilføj nye friske medium med 200-1.000 µL pipette.
- 6-7 dage efter celle såning, tilføje 20 ng/mL af RANKL til komplet α-MEM + MCSF.
- Ændre medium (komplet α-MEM + MCSF + RANKL) hver 2-3 dage:
- kassere medium med 200-1.000 µL pipette.
- Tilføje nye medie med en 200-1.000 µL pipette. Stop induktion af differentiering 14 dage efter celle Seedning.
- Kassere medium og vaskes to gange med PBS.
- Fix celler med PARAFORMALDEHYD:
- forlade celler tørre.
- Tilføje 4% PARAFORMALDEHYD (Se Tabel of Materials).
- Incubate i 20 min. ved stuetemperatur.
- Kassere PARAFORMALDEHYD og vaskes to gange med 500 µL af PBS.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; Venligst bære handsker, maske og briller. - Tillade celler tørre.
- Udføre TRAP farvning ifølge producenten ' s instruktioner (Se Tabel of Materials).
- Tæller osteoklast-lignende celler manuelt under lup med forstørrelse 10 X; NA 0,30.
Bemærk: Osteoklast-lignende celler er defineret som FÆLDE + polycarion celler med mindst 4 kerner.
2. Kræft cellekulturer
Bemærk: forsøgene kan udføres med forskellige typer af bryst adenocarcinom cellelinjer som SCP2 17, en osteotropic cellelinje med oprindelse fra den triple negative menneskelige Breast cancer cellelinie (MDA-MB-231), og de hormonelle receptor-positiv cellelinie MCF7.
- Kultur cellerne som en éncellelag i 75 cm 2 kolber.
- Frø 1.000.000 kræftceller i en kolbe på 75 cm 2.
- Gemme celler ved 37 ° C i komplet α-MEM medium suppleret med 1% glutamin og 10% føtal bovint serum i en 5% CO 2 atmosfære.
- Frigør celler på en confluency på omkring 90%:
- kassere mediet, vask med PBS og tilføje 2-3 mL trypsin 1 X i PBS.
- Ruger celler for 3-5 min. ved 37 ° C.
- Indsamle de fritliggende celler fra 75 cm 2 kolben med 10 mL pipette, tilføjer 8 mL af komplet medium til at stoppe den enzymatiske reaktion.
- Der centrifugeres ved 225 x g i 5 min.
- Vaske kræftcellerne:
- tilsættes 10 mL PBS.
- Der centrifugeres ved 600 x g i 5 min.
- Tælle kræftceller med en Neubauer kammer.
- Tælle kræftceller mindst to gange og beregne middelværdien af flergangsbestemmelser at få det samlede gennemsnitlige antal celler indsamlede.
3. Direkte Co kulturer af kræftceller en nd monocytter gennemgår differentiering mod osteoklaster
- frø kræftceller på skær (pore diameter 0,4 µm):
- frø kræftceller i en koncentration på 4.000 celler pr. cm 2.
- Inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2.
Bemærk: Frø kræft celler dagen efter PBMC Seedning til fælles kultur eksperiment i 0,4 µm skær.
- Vente 24 timer at tillader cellerne til at overholde.
- Sted de seedede indsætte kultur over mononukleære kulturer at starte fælles kultur (Se afsnit 1.10 i protokollen).
- Ændre medierne hver 2-3 dage med komplet α-MEM.
- Kassere medium med 200-1.000 µL pipette.
- Tilføje 500 µL af friske medium.
Bemærk: Det primære formål med fælles kultur er forstå osteoclastogenic effekt af kræftceller, derfor GFs føjes ikke til α-MEM. I hvert forsøg af fælles kultur, omfatte negative kontrol (se note i trin 1.10 i protokollen) og positive kontroller af osteoklasterne differentieret ved RANKL og MCSF (ingen kræftceller). Kræftceller seedede i indsætter ikke placeret over mononukleære celler bruges som en negativ kontrol af fælles kultur.
- Stoppe fælles kultur og bruge kræftceller downstream analyse:
- 13 dage efter PBMC såning og 12 dage efter kræft celle såning, Placer skæret på en ny plade.
- Stoppe kræft cellekultur som downstream analyser der skal udføres (Se diskussion).
- Dag 14, stoppe osteoklast differentiering og løse celler, som rapporteret i trin 1.15.
- Udføre TRAP farvning straks eller inden 14-30 dage.
Bemærk: Valgfri farvning: for at bekræfte, at FÆLDE + polycarion celler osteoklaster, forskere kan udføre yderligere farvning for at opdage CTR, en osteoklast-specifikke markør. Påvisning af F-actin rings er en anden osteoklast-specifik farvning assay 12 , 13 , 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En metode blev optimeret til at let skelne osteoklaster fra humant perifert blod monocytter. Monocyt kultur var kulturperler med kræftceller, bekræfter (som beskrevet i litteraturen18), at kræftceller er i stand til at opretholde osteoclastogenesis i knoglemetastaser. Osteoklaster differentieret fra kræftceller og GFs er vist i figur 1. En osteoklast-lignende celle er en celle med 4 eller flere kerner og er positive for FÆLDE farvning (lilla celler). De accepterede cut-off for antallet af kerner bruges til at definere en osteoklast er 318, men vi besluttede at bruge 4 til at reducere risikoen for falske positiver til et minimum.
Modellen viser at bryst kræft celler vedvarende osteoclastogenesis, fordi antallet af osteoklasterne i brøndene induceret af kræftceller var lignende til der opnås i den positive kontrol (figur 2). Som vist i figur 2A, et antal celler også opdelte spontant i osteoklaster i den negative kontrol. For at bekræfte nytten af modellen, blev systemet udfordret med en antitumor drug12,13. Osteoklast tal var højere i co dyrkningsbetingelserne og positiv kontrol (CTR +) prøver end i negativ kontrol (CTR-) prøver. Osteoklast tal faldt betydeligt i overværelse af narkotika (everolimus) i både Co dyrkningsbetingelserne og positive kontroller (CTR +). T-test blev anvendt til statistiske analyser. Celler blev talt i hver brønd. Den overflade areaof osteoklast er karakteristisk for modning og kan analyseres ved hjælp af open source software som ImageJ. Osteoklaster afledt af GFs var større end de inducerede af kræftceller (figur 2B). Behandling med en antitumor stof (everolimus) slået fra virkningerne af GFs. Modellen givet nyttige oplysninger om rollen, narkotika i osteoclastogenesis hæmning. Figur 2 c viser, at osteoclastogenesis faldt i overværelse af stoffet. Disse resultater blev opnået ved co-culture-induceret osteoclastogenesis. Som forklaret i afsnittet protokollen, kan en række andre downstream analyser udføres for at undersøge mekanismerne af krydstale og/eller af de analyserede stoffer. Den model, der er sammenfattet i figur 3 er meget versatileand kan bruges til at studere effekten af lægemidler på kræftceller, navnlig osteoklaster.
Figur 1. Osteoclastogenesis assay. Celler farves efter 14 dage i kultur. CTR-monocytter kulturperler i mangel af vækstfaktorer; CTR + monocytter kulturperler med RANKL og MCSF vækst faktorer; COCO, osteoklaster opnået ved co dyrkning af blodlegemer med kræftceller. 10 X forstørrelse. Osteoklast-lignende celler blev celler med mindst 4 kerner, der var positivt at FÆLDE (lilla celler). Celler var kvantificeres ved at tælle cellerne i hver brønd; 4 flergangsbestemmelser for hver betingelse blev udført og gennemsnitlige blev beregnet. Skalalinjen er 400 µm. Image zoom i det nederste panel (100 X) illustrerer areal af 2 osteoklaster (røde cirkler). Pilene angiver osteoklast kerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Effekten af everolimus på osteoclastogenesis behandling. (A) antallet af osteoklasterne ifølge tilstedeværelse eller mangler et stof; 4 flergangsbestemmelser for hver betingelse blev udført. CTR-monocytter kulturperler i mangel af vækstfaktorer; CTR + monocytter kulturperler med RANKL og MCSF vækst faktorer; COCO, osteoklaster opnået ved co dyrkning af blodlegemer med kræftceller. Data er udtrykt som gennemsnit ± SE. Betydning blev evalueret af t-testen; * p < 0,05. (B) osteoklast areal blev beregnet ved at ImageJ open source-software. Mindst 50 osteoklaster pr. betingelse blev målt. CTR-monocytter kulturperler i mangel af vækstfaktorer; CTR + monocytter kulturperler med RANKL og MCSF vækst faktorer; COCO, osteoklaster opnået ved co dyrkning af blodlegemer med kræftceller. (C) billeder af celler efter 14 dage i kultur i fravær eller tilstedeværelse af en antitumor stof (everolimus). 10 X forstørrelse; skalalinjen er 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fælles kultur model. Ordningen af modellen og dens mulige downstream analyser og fremtidige anvendelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prækliniske undersøgelser in vitro- modeller at studere mekanismerne af krydstale mellem kræftceller og knogleceller er nødvendige for at identificere mekanismer af knogle metastaser, der kan bruges til at skabe nye terapeutiske strategier. Vi udviklede en fuldt humane i vitro model af osteoclastogenesis fra humant perifert blod (figur 3). Under optimering af metoden, blev en række kritiske punkter identificeret og løst. Først angår mængden af mononukleære celler til frø. Antallet af celler fremstillet ved optællingen mikroskop er kun et groft kvantificering som det er vanskeligt at skelne mellem lymfocytter og monocytter, hvor sidstnævnte er målceller til frø til osteoclastogenesis eksperiment. Vi var i stand til at identificere monocytter, fordi lymfocytter ikke overholder plastunderlag og dermed fleste blev elimineret i den første ændring af medium. Cellerne var seedet på en høj tæthed, da det er uomgængeligt for cellerne til at være i stand til at interagere med hinanden for differentiering, især i anden fase af osteoclastogenesis, før osteoklaster skal være tæt sammen for at smelte og blive modne osteoklaster. Et yderligere problem opstår, når der er flere forsøgsbetingelser, fordi disse kræver et højt antal celler og en stor mængde af blod. En mulig løsning er at bruge buffy frakker, der har en høj koncentration af PBMC, f.eks., 4 x 105-6 x 106 mononukleære celler, der normalt indsamles fra en 50 mL buffy coat prøve sammenlignet med mindre end 1 x 105 PBMC indsamlet fra en 20 mL blodprøve.
Som blodprøver blev indsamlet fra forskellige frivillige, var der en vis grad af variabilitet i osteoclastogenesis assay. Det var derfor vigtigt at udføre hvert assay med mindst 3-4 tekniske replikater. Biologiske replikater var også behov for og som forskellige raske donorer blev brugt, vi normalt beregner ikke gennemsnittet af værdier opnået ved de forskellige eksperimenter. Vi sørget for, at tendenserne i de forskellige tests blev tilsvarende og derefter valgte et eksperiment fra en af de raske donorer skal medtages i håndskriftet.
Vores prækliniske model indebærer den Co dyrkning af monocytter gennemgår differentiering med kræftceller. Som vi tidligere viste, kan kræftceller også opretholde in vitro- osteoclastogenesis12,13. Dette system kan bruges til at teste medicin, eller til at undersøge mekanismerne for interaktion, som det er muligt at udføre flere downstream analyser på både kræftceller og osteoklaster. Faktisk er det muligt at udføre spredning assays på kræftceller og gen expression analyser/Western skamplet assays på både kræft celler og osteoklaster13. Det ville være af interesse at forstå hvordan udskilles proteiner er forskellige i de forskellige betingelser. Vores model har en række fordele, dvs., det er en fuldt ud menneskelig model, der ikke er afhængige af murine cellelinjer, i modsætning til flere modeller rapporteret i litteraturen. Modellen er også temmelig robust og reproducerbar, og kan bruges til andre formål. For eksempel, kan andre kræft cellelinjer være co kulturperler med osteoklasterne og forskellen i deres osteoclastogenic magt studerede. Dette system kan desuden bruges til at evaluere andre fysiologiske eller patologiske mekanismer til at forbedre vores forståelse af knogle biologi og osteoklast-medierede sygdomme som knogleskørhed. Andre cytokiner og celle typer kan også være co kulturperler sammen med osteoklasterne afhængigt af formålet med forsøget.
Flere downstream analyser er mulige med denne model. Det er vigtigt at beslutte under designfasen af undersøgelsen hvad analyser udføres således at et tilstrækkeligt antal brønde kan være seedet.
Downstream Assays med osteoklasterne:
a gen expression analyser. Planlæg supplerende wells af osteoklasterne at udtrække total RNA, som brøndene farves til FÆLDE evaluering ikke er tilgængelige for RNA udvinding. (ii) Western blot analyser. (iii) kvantificering af osteoklast areal. Osteoklast størrelse er en parameter til osteoklast modning og kan kvantificeres ved hjælp af open source software som ImageJ.
Downstream Assays med kræftceller:
(i) spredning assays såsom MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium methylbromid. (ii) gen expression analyser. (iii) Western blot analyser.
Downstream Assays med osteoklasterne og kræftceller (fælles kultur):
Som kræftceller og osteoklaster deler den samme dyrkningsmedium, kan deres interaktion studeres med ELISA assay som analyzesthe sekretion af specifikke cytokiner, GFs og andre udskilles proteiner.
Udvikling af denne model var afgørende for vores projekt, og vi planlægger at forbedre det yderligere i den nærmeste fremtid. Et vigtigt skridt ville være at differentiere monocytter i 3D mineraliseret kollagen stilladser at efterligne knoglematrix. Det ville så være muligt at direkte evaluere osteoklast aktivitet med en knogle resorption assay. Da vi fortsætter med at lære mere om de forskellige roller spilles af osteoklasterne i fysiologiske og patologiske behandling spænder fra knogle remodellering til regulering af knoglemetastaser, vores model vil gøre det muligt for forskere at isolere og studerer osteoklasterne in vitro- .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Yibin Kang for at give SCP2 cellelinje og Cristiano Verna for redaktionelle bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
