Summary
פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.
Abstract
Crosstalk בין תאים סרטניים ותאים עצם ב- microenvironment העצם חיוני להבנת מנגנון היווצרות גרורות העצם. פיתחנו במבחנה אנושית לחלוטין פרה מודל של תרבות משותפת של תאים סרטניים בשד ומונוציטים שעברו התמיינות לכיוון osteoclasts. אנחנו אופטימיזציה מודל של osteoclastogenesis החל מדגימת דם היקפיים שנאספו מתורמים מאוד בריאים. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) היו הראשונים המופרדים באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות, נזרע על צפיפות גבוהה, המושרה להבדיל על-ידי הוספת שני גורמי גדילה (GFs): קולטן activator ושל הפקטור הגרעיני-κB ליגנד (רנקל) מקרופאג המושבה-מגרה גורם (MCSF). התאים היו עזב בתרבות למשך 14 ימים קבוע ואז נותחו על ידי ניתוח במורד הזרם. גרורות בעצמות osteolytic, הוא אחד מאפקטי ההגעה התא סרטן בתוך עצם אינדוקציה של osteoclastogenesis. אנחנו ובכך לערער את המודל שלנו עם תרבויות המשנה של תאים סרטניים בשד ללמוד את הכוח התמיינות של תאים סרטניים ביחס של GFs. דרך פשוטה של הלומדים סרטן התא-אוסטאוקלסט אינטראקציה היא לבצע עקיפה תרבויות שיתוף המבוסס על שימוש בינוני ממוזגים שנאסף תרביות תאים של סרטן השד, מעורב בינוני טריים. תערובת זו משמש לאחר מכן לזירוז אוסטאוקלסט בידול. אנחנו גם אופטימיזציה שיטה ישירה תרבות משותפת שבה סרטן תאים ומונוציטים שעברו התמיינות לשתף המדיום ולהחליף גורמים המופרש. זהו שיפור משמעותי על פני השיטה תרבות שותף עקיף המקורי כמו חוקרים ניתן לצפות את האינטראקציות הדדיים של תא שני סוגי ולבצע ניתוחים במורד הזרם עבור תאים סרטניים והן osteoclasts. שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את השפעת הסמים על microenvironment את עצם גרורתית, לקווים תא זרע מלבד אלה נגזר מסרטן השד. המודל יכול לשמש גם כדי לחקור מחלות אחרות כגון אוסטאופורוזיס או תנאים אחרים העצם.
Introduction
העצם הוא אתר משותף של גרורות של סוגים שונים של גידולים ראשי כמו סרטן הערמונית, ריאות, שד, עם 20-25% מהחולים לפתח גרורות בעצמות במהלך המחלה1,2,3. בפרט, 70% של חולי סרטן השד לשאת עדות עצם גרורות מוות4. הגידול ותא סטרומה האינטראקציה הוא חיוני עבור התקדמות סרטן סרטן ראשוני והן נגעים משניים. ב- microenvironment העצם, גרורות בעצמות osteolytic מסרטן השד תלויים הקמת מעגל קסמים פתולוגיים המתרחשים בין תאים סרטניים, תאים עצם microenvironment של העצם. תאים סרטניים לשבש את איזון עצמות, הגדלת העצם resorption5,6,7.
בתנאים נורמליים ופתולוגיים, osteoclasts הם תאים האחראי על ספיגת עצם, ואילו תאי העצם, תוך הפקדת מטריצה חדש, אחראים על עצם חדשה היווצרות8. אוסטאוקלסט פעילות מוסדר על ידי תאי העצם דרך הביטוי של רנקל, אשר נקשר לקולטן שלו דרגה על פני אוסטאוקלסט קדם, גרימת אוסטאוקלסט שלפני היתוך, תהליך הכרחי עבור בידול לתוך osteoclasts בוגרת. אינדוקציה של osteoclastogenesis מגביר ספיגת עצם. מספר רב של מחקרים ויוו השתפרו באופן משמעותי את ההבנה שלנו של עצם גרורות היווצרות9,10,11. תאים סרטניים בשד הגידול העיקרי, microenvironment את עצם perturb עצם הומאוסטזיס, קידום osteoclastogenesis, העצם resorption8. בתרחיש זה, כל מולקולרית האינטראקציות המתרחשות בין תאים סרטניים של osteoclasts בעלות חשיבות מכרעת. כאמור לעיל, מנגנון היווצרות גרורות בעצם יש כבר מבואר בדגמים העכברים ' ויוו . עם זאת, בנוסף, את הצורך באישור כל ויוו ניסויים בבעלי חיים על ידי ועדת האתיקה ישנם מספר חסרונות אחרים לביצוע ויוו ניסויים כולל עלויות גבוהות ושיטות גוזלת זמן. מספר סופרים שילבו במודלים פרה ויוו , במבחנה של osteoclastogenesis באמצעות קו מאתר של osteoclasts מראש הנקרא RAW246.79,10,11. החסרונות של מודל זה נובעות מהעובדה כי התאים כבר מחויבים להיות osteoclasts קדם, אינם ממקור אנושי. מסיבות אלו, המחקר translational יפיקו במידה רבה הזמינות של במבחנה אנושית לחלוטין במודלים פרה ללמוד אינטראקציות התא סרטן העצם.
אנחנו אופטימיזציה שיטה של osteoclastogenesis במבחנה החל מ-12,דגימות דם היקפיים אנושי13. Osteoclasts שואבים ומונוציטים, אשר נמצאים, גם אם במידה קטנה, בדגימות דם היקפיים. תאי תאי מופרדות הראשון אריתרוציטים, גרנולוציטים נוכח דם מלא על-ידי Ficoll צפיפות הדרגתי; הם נבחרו אז בזכות היכולת שלהם לדבוק המצע פלסטיק, בניגוד לימפוציטים. לאחר זריעה, תאים מתורבתים למשך 14 ימים. MCSF רנקל GFs הנדרש על-ידי ומונוציטים להבדיל קודם לתוך מקרופאגים ולאחר מכן לתוך osteoclasts14,15בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. MCSF יש צורך לכל משך וזמינותו, ואילו רנקל משמש לזירוז תהליך התמיינות בשלבים המאוחרים של osteoclastogenesis. בשלב מוקדם של בידול, מסייעת MCSF ומונוציטים להתרבות ולשרוד14,15. במהלך החלק השני של osteoclastogenesis, תאים מתמזגים, בוגר כמו osteoclasts, מציג להתפלגות האופיינית של אקטין F בטבעות ולבטא סמני ספציפיים כגון פוספטאז tartrate חסיני חומצה (השמנה) ו קלציטונין קולטן (CTR) 14 , 15. שיטת שלנו מורכב של הוספת MCSF התרבות מונוציט במשך 7 הימים הראשונים של הניסוי, שילוב של MCSF רנקל ימים 7 עד 14. בסוף הניסוי, osteoclastogenesis ניתוח על ידי ספירת תאי הבדיל, כפי שיפורט להלן.
התרבויות מונוציט המושרה להבדיל מאת GFs יוצרות את הבסיס של המודל פרה שלנו. אנחנו אופטימיזציה מערכת תרבות משותפת ללא GFs כדי להבין טוב יותר את הכוח osteoclastogenic של תאים סרטניים בשד. לראשונה פיתחנו מודל של תרבויות שותף עקיף על-ידי הוספת בינוני (80% α-בינונית מזערי חיוניים (α-מ) ו- 20% ממוזגים בינוני שנאספו מתרבות של תאים סרטניים בשד כי היו confluent כ 90% תאים שעברו התמיינות12 . המדיום ממוזגים (לא נאסף בתנאים מניעת סרום) נאספה לאחר 24 שעות, מעורב בינוני טריים-שיעור של 1:4. המדיום ממוזגים המושרה בידול אוסטאוקלסט משמעותית ביחס הפקד שלילי. עם זאת, כל המידע על האינטראקציה הדדית בין תאים סרטניים ותאים עצם אובדים בעת שימוש עקיף תרבויות המשנה, אנחנו שיפור המערכת שלנו על-ידי ביצוע ישיר תרבויות המשנה. אנחנו נזרע תאים סרטניים 0.4 מיקרומטר מוסיף והניח אותם בבארות שבו תאי תאי מצופים. באמצעות שיטה זו, תאים לשתף המדיום אותו ולהחליף חלבוני המופרש. לכן יצרנו דגם פרה אנושית לחלוטין של osteoclastogenesis הנגרם על ידי תאי סרטן13.
מערכת זו הוא תכליתי מאוד והוא יכול לשמש למטרות מחקריות שונות, למשל, במחקרים תרופתי חוקרים את התפקיד של סמים בתוך עצם גרורות. המודל שלנו מאפשר ללמוד את היעילות ואת מנגנוני הפעולה של טיפולים, ממוקדות עצם ו/או תרופות antitumor microenvironment העצם בנוכחות תאי סרטן13. תכנון הניסויים עם בקרות הנכון, כלומר, תאים סרטניים osteoclasts תרבותי בנפרד, מקל להבין את ההשפעה של תרבות משותפת על פעילות התרופה. גישה זו הופך להיות מעניין יותר כאשר הסם נחקר מטרות הן סרטן תאים ועוד osteoclasts, למשל, everolimus16. מודל זה יכול לשמש גם כדי לזהות מסלולים חדשים של אינטראקציה בין תאים סרטניים ותאים העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
osteoclasts האנושי היו תריז PBMCs תורמים בריא שנתן בכתב הסכמה מדעת להשתתף במחקר. פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית, על פי הסטנדרטים אתית הניח הצהרת הלסינקי של 1964.
1. בידול אוסטאוקלסט
הערה: לאסוף דם היקפיים או מעילים באפי מתורמים אנושי בריא ב- EDTA. אל תשתמש פחות מ 20 מ"ל של דם היקפיים. מעילים באפי עדיפים כי להם שפע רב יותר של תאי תאי. בצע את כל השלבים הבאים בשכונה תרביות רקמה סטרילי.
- דם EDTA לדלל 1:1 עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). מחדש להשעות טוב.
- שכבה במדיה ההפרדה לימפוציטים (דם PBS: לימפוציט ההפרדה מדיה, 2:1) 50 מ ל צינורות.
- פיפטה 30 מ של דם מדולל ב- PBS שפופרת 50 מ ל.
- בעדינות ביסוד 15 מ"ל של לימפוציטים ההפרדה מדיה לתוך החלק התחתון של הצינור 50-mL-
- צנטריפוגה-757 × g 10 דקות בטמפרטורת החדר (בלי בלמים).
- איסוף תאי תאי:
- לאסוף את השכבה הלבנה של תאי תאי עם פיפטה 5 מ"ל בלי לזעזע ולמקם אותו צינור 50 מ ל.
- לדלל את PBMCs שנאספו עם 20 מ של PBS.
- לרחוץ את PBMCs:
- צנטריפוגה ב 225 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך ברכבת התחתית. אני חוזר פעם.
- פירוק RBC:
הערה: אם בגדר תא אדום, יטפל בתאים עם תאי הדם האדומים lysing בופר (ראה טבלה של חומרים).- שמכניסים את נקז 50 מ בקרח
- הוסף 5 מ של תאי הדם האדומים lysing מאגר.
- לחכות 3-5 דקות כדי להשלים את פירוק כדוריות דם אדומות. פרק זמן זה משתנה על פי מידת זיהום כדוריות דם אדומות.
- לעצור את התגובה על-ידי הוספת 20 מ של PBS.
- צנטריפוגה-225 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך הצינור.
הערה: אופציונלי: אם פירוק RBC מבוצע, לשטוף את PBMCs כפי שמתואר להלן.
- PBMCs ווש:
- להוסיף 20 מ"ל של PBS, צנטריפוגה-g x 225 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך הצינור.
- מחדש להשעות את התאים מלאה α-מ (בתוספת גלוטמין 1% (הריכוז ההתחלתי 100 X) ו- 10% סרום שור עוברית).
- לספור את התאים עם תא Neubauer.
- לדלל את בטחונות לדוגמה בחומצה אצטית ולהשתמש µL 10 של הדילול לספור תאים.
- נחשב לפחות פעמיים, לחשב את הממוצע של משכפל כדי לקבל את המספר הממוצע הכולל של תאים שנאספו.
- צלחת תאים:
- צלחת תאים על ריכוז של 750,000 PBMCs לכל ס מ 2-
- לאחסן תאים מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 2 CO 5%-
הערה: תכנון הניסוי כדי לכלול פקדים שליליים, אשר הם תאים שהם מטפלים עם נורמלי מלאה α-הגברת בלי MCSF או רנקל GFs. לזכור לבצע כל תנאי לפחות 3 טכני משכפל. לבצע לפחות 3 ביולוגי משכפל.
- לשנות את המדיום בתוספת של GFs:
- לחכות כ-3 שעות לאחר זריעה תא ולאחר מכן להסיר את המדיום באמצעות פיפטה (200-1, 000 µL) להשליך פסולת תאים כעיגולים בצבע, אריתרוציטים.
הערה: להיזהר בעת שינוי של המדיום כדי למנוע ניתוק התא. - להוסיף חדשה מלאה α-מ בתוספת 20 ng/mL של MCSF (500 µL היטב).
הערה: כאשר culturing במשותף עם תאים סרטניים, זרע הסרטן תאים מחרתיים זריעת PBMC.
- לחכות כ-3 שעות לאחר זריעה תא ולאחר מכן להסיר את המדיום באמצעות פיפטה (200-1, 000 µL) להשליך פסולת תאים כעיגולים בצבע, אריתרוציטים.
- שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים (α-מ בתוספת 20 ng/mL של MCSF):
- למחוק את המדיום באמצעות פיפטה µL 200-1, 000.
- הוסף בינוני טריים חדש מאת פיפטה µL 200-1, 000.
- 6-7 ימים לאחר תא זריעה, להוסיף 20 ng/mL של רנקל מלאה α-מאמ + MCSF.
- לשנות את המדיום (α מלאה-מאמ + MCSF + רנקל) כל 2-3 ימים:
- למחוק את המדיום עם פיפטה µL 200-1, 000.
- הוסף אמצעי חדש עם פיפטה µL 200-1, 000. תפסיק אינדוקציה של בידול 14 ימים לאחר זריעה תא.
- להשליך בינונית, לשטוף פעמיים עם PBS.
- לתקן תאים עם paraformaldehyde:
- להשאיר תאים להתייבש.
- להוסיף paraformaldehyde 4% (ראה טבלה של חומרים).
- Incubate עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- למחוק את paraformaldehyde. ולשטוף פעמיים עם µL 500 ל- PBS.
התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; ללבוש כפפות, מסיכה, משקפיים. - מאפשרים לתאים יבש.
- השמנה לבצע צביעת לפי היצרן ' s הוראות (ראה טבלה של חומרים).
- לספור תאים דמויי אוסטאוקלסט באופן ידני תחת המיקרוסקופ בהגדלה 10 X; נה 0.30-
הערה: כמו אוסטאוקלסט התאים מוגדרים בתור מלכודת + polycarion תאים עם גרעינים לפחות 4.
2. תרביות תאים סרטניים
הערה: ניתן לבצע את הניסויים עם סוגים שונים של שורות תאים אדנוקרצינומה השד כגון SCP2 17, קו תא osteotropic שמקורם האדם שלילי טריפל השד סרטן התא (מד א-MB-231), ובין התא קולטן חיובי הורמונלי הקו MCF7.
- התרבות התאים כמו טפט ב- 75 ס מ 2 מבחנות.
- 1,000,000 זרע תאים סרטניים בבקבוקון 75 ס מ 2-
- לאחסן את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במדיום מלאה α-מ בתוספת 1% גלוטמין ו-10% עוברית שור סרום באווירה 2 CO 5%-
- ניתוק התאים-confluency כ-90%:
- למחוק את המדיום, לשטוף עם PBS ולהוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין 1 X ב- PBS.
- דגירה תאים למשך 3-5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לאסוף את התאים מנותקת מן הבקבוק 75 ס מ 2 על ידי פיפטה 10 מ"ל, הוספת 8 מ של בינוני מלא כדי לעצור את התגובה אנזימטי.
- צנטריפוגה-g x 225 עבור 5 דק.
- לרחוץ את התאים הסרטניים:
- להוסיף 10 מ של PBS.
- צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דק.
- לספור תאים סרטניים עם תא Neubauer.
- לספור תאים סרטניים לפחות פעמיים, לחשב את הממוצע של משכפל כדי לקבל את המספר הממוצע הכולל של תאים שנאספו.
3. ישיר תרבויות המשנה של תאים סרטניים nd ומונוציטים שעברו התמיינות לכיוון Osteoclasts
- זרע התאים הסרטניים על מוסיף (נקבוביות בקוטר 0.4 מיקרומטר):
- זרע של תאים סרטניים-ריכוז של 4,000 תאים לכל ס מ 2.
- דגירה-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
הערה: זרע הסרטן תאים יום אחרי PBMC זריעה לניסוי תרבות משותפת ב- 0.4 מוסיף מיקרומטר.
- לחכות 24 שעות לאפשר את התאים לדבוק.
- המקום הזריעה להוסיף תרבות על התרבויות תאי להתחיל את תרבות משותפת (ראו סעיף 1.10 לפרוטוקול).
- לשנות את המדיה כל 2-3 ימים עם מלאה α-מ.
- למחוק את המדיום עם פיפטה µL 200-1, 000.
- להוסיף 500 µL טריים בינונית.
הערה: המטרה העיקרית של תרבות משותפת היא להבין את הכוח osteoclastogenic של תאים סרטניים, לכן, GFs לא יתווספו α-מ. ניסוי של תרבות משותפת, כוללים neפקדי gative (ראה הערה בשלב 1.10 לפרוטוקול) ופקדי חיובית של osteoclasts מובחנת על ידי רנקל ו- MCSF (אין תאים סרטניים). תאים סרטניים נזרע ב הכיסויים אינם ממוקמים מעל תאי תאי משמשים פקד השלילית של תרבות משותפת.
- לעצור את תרבות משותפת ולהשתמש תאים סרטניים לניתוח במורד הזרם:
- 13 יום לאחר PBMC זריעה, 12 יום לאחר סרטן התא זריעה, למקם את תותב על צלחת חדשה.
- תפסיק תרבית תאים סרטן בסיסו ניתוחים במורד הזרם הם להתבצע (ראה דיון).
- ביום 14, תפסיק אוסטאוקלסט בידול ולתקן תאים, כפי שדווח בשלב 1.15.
- השמנה לבצע צביעת באופן מיידי או תוך 14-30 ימים.
הערה: צביעת אופציונלי: כדי לוודא כי השמנה + polycarion התאים נמצאים osteoclasts, חוקרים לבצע צביעת נוספים כדי לזהות CTR, סמן אוסטאוקלסט ספציפיים. הגילוי של טבעות F-אקטין הוא אחר ספציפי אוסטאוקלסט מכתימים assay 12 , 13 , 14-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה אופטימלי כדי בקלות להבדיל osteoclasts ומונוציטים דם היקפיים אנושי. התרבות מונוציט היה תרבותי עם תאים סרטניים, המאשרת (כפי שמתואר בספרות18) כי התאים הסרטניים הם לשמר osteoclastogenesis של גרורות בעצמות. Osteoclasts תריז תאים סרטניים, GFs מוצגים באיור1. תא אוסטאוקלסט דמוי תא עם גרעינים 4 או יותר והיא חיובית עבור מלכודת מכתים (תאים סגול). שרשם מקובל עבור מספר גרעינים משמש להגדרת של אוסטאוקלסט הוא 318, אבל אנחנו החלטנו להשתמש 4 כדי להפחית את הסיכון של תוצאות חיוביות שגויות עד למינימום.
המודל מראה osteoclastogenesis מתמשכת זה סרטן תאי השד כי המספר של osteoclasts בבארות הנגרם על ידי תאים סרטניים היה דומה לזה שהושג בפקד חיובי (איור 2). כפי שמוצג באיור 2A, מספר תאים גם הבדיל באופן ספונטני לתוך osteoclasts בפקד שלילי. על מנת לאשר את התועלת של המודל, למערכת אותגרה עם12,סמים antitumor13. אוסטאוקלסט המספרים היו גבוהות ב תרבות משותפת תנאים ודוגמאות בקרה חיובית (CTR +) מאשר בדגימות שליטה שלילי (CTR-). אוסטאוקלסט מספרים ירד משמעותית בנוכחות הסם (everolimus) תנאים תרבות משותפת והן פקדי חיובי (CTR +). מבחן t שימש ניתוחים סטטיסטיים. תאים נספרו בכל טוב. האיזור שבו משטח אוסטאוקלסט מאפיין של התבגרות, ניתן לנתח באמצעות תוכנת קוד פתוח כגון ImageJ. Osteoclasts נגזר GFs היו גדולים יותר מאלה הנגרם על ידי תאים סרטניים (איור 2B). טיפול עם תרופה antitumor (everolimus) לבטל את ההשפעות של GFs. המודל ומידע שימושי שסופקו על עצמו את התפקיד של הסם על עיכוב osteoclastogenesis. איור 2C מראה כי osteoclastogenesis ירד בנוכחות הסם. תוצאות אלו התקבלו על-ידי osteoclastogenesis co-culture-induced. כפי שהוסבר בסעיף פרוטוקול, ניתן לבצע מספר ניתוחים במורד הזרם אחרים לחקור את המנגנונים של crosstalk ו/או התרופות שנותחה. המודל מסוכמות באיור 3 הוא מאוד versatileand יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של תרופות על תאים סרטניים, במיוחד osteoclasts.
איור 1. Osteoclastogenesis assay. תאים מוכתם לאחר 14 ימים בתרבות. CTR-ומונוציטים תרבותי, בהעדר גורמי גדילה; CTR + ומונוציטים תרבותי עם גורמי גדילה רנקל, MCSF; . קוקו, osteoclasts מתקבל על ידי שיתוף culturing תאי דם עם תאים סרטניים. 10 X הגדלה. אוסטאוקלסט כמו התאים היו תאים עם גרעינים לפחות 4 היו חיוביים למלכודת (תאים סגול). התאים היו לכמת על ידי ספירת התאים כל טוב; משכפל 4 עבור כל תנאי בוצעו, הממוצע מחושב. סרגל קנה מידה הוא 400 מיקרומטר. הזום התמונה בחלונית התחתונה (100 X) מדגים את פני השטח של osteoclasts 2 (עיגולים אדומים). החצים מצביעים אוסטאוקלסט גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. השפעת everolimus על טיפול osteoclastogenesis. (א) מספר של osteoclasts לפי העדר/הנוכחות של תרופה; משכפל 4 עבור כל תנאי בוצעו. CTR-ומונוציטים תרבותי, בהעדר גורמי גדילה; CTR + ומונוציטים תרבותי עם גורמי גדילה רנקל, MCSF; . קוקו, osteoclasts מתקבל על ידי שיתוף culturing תאי דם עם תאים סרטניים. נתונים מבוטא זאת אומרת ± SE. משמעות הוערך על ידי t-test; * p < 0.05. תוכנת קוד-פתוח אוסטאוקלסט (B) שטח מחושב על ידי ImageJ. לפחות 50 osteoclasts לכל תנאי נמדדו. CTR-ומונוציטים תרבותי, בהעדר גורמי גדילה; CTR + ומונוציטים תרבותי עם גורמי גדילה רנקל, MCSF; . קוקו, osteoclasts מתקבל על ידי שיתוף culturing תאי דם עם תאים סרטניים. (ג) תמונות של התאים לאחר 14 ימים בתרבות היעדרות או נוכחות של סם antitumor (everolimus). 10 X הגדלה; סולם בר הוא 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תרבות משותפת דגם- ערכה של המודל, של ניתוחים במורד הזרם אפשרי, יישומים עתידיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרה במבחנה מודלים לומד על מנגנוני crosstalk בין תאים סרטניים ותאים עצם נחוצים כדי לזהות מנגנונים של עצם גרורות יכול לשמש ליצירת אסטרטגיות טיפוליות חדשות. פיתחנו מודל אנושית לחלוטין במבחנה של osteoclastogenesis מדם היקפי אנושי (איור 3). במהלך אופטימיזציה של המתודולוגיה, מספר נקודות קריטיות היו מזוהה, נפתרה. הראשון נוגע את כמות תאי תאי זרע. מספר התאים מתקבל על ידי הרוזן מיקרוסקופ הוא רק כימות קשה כפי שקשה להפלות בין לימפוציטים ומונוציטים, הישות השנייה תאי היעד זרע לניסוי osteoclastogenesis. הצלחנו לזהות ומונוציטים כי לימפוציטים אינן מתיישבות המצע פלסטיק, ולכן הרוב חוסל ב השינוי הראשון של מדיום. התאים היו נזרע על צפיפות גבוהה, כפי שהוא חיוני עבור התאים להיות מסוגלים לתקשר אחד עם השני על בידול, במיוחד בשלב השני של osteoclastogenesis שבו osteoclasts מראש צריך להיות קרובים זה לזה כדי נתיך ולהיות בוגרת osteoclasts. קושי נוסף מתעוררת כאשר ישנם מספר תנאים ניסיוני כי אלו דורשים מספר רב של תאים, כמות גדולה של דם. פתרון אפשרי אחד הוא להשתמש באפי מעילים בעלי ריכוז גבוה של PBMCs, למשל, 4 x 105-6 x 106 תאים תאי נאספים בדרך כלל מתוך מדגם המעיל באפי 50 מ ל, לעומת פחות מ 1 x 105 PBMCs שנאסף 20 מ ל דם.
כפי דגימות דם נאספו ממתנדבים שונים, היה איזה מידת ההשתנות וזמינותו osteoclastogenesis. לכן היה חשוב לבצע כל assay עם משכפל טכנית לפחות 3-4. משכפל ביולוגי נדרשו גם, כפי תורמים בריא שונים שימשו, אנחנו לא בדרך כלל חישוב הממוצע של הערכים שהתקבלו על ידי ניסויים שונים. אנחנו הבטיחו כי המגמות של בדיקות שונות היו שווי ערך, אז בחר ניסוי אחד מאחד התורמים בריא כדי להיכלל בכתב היד.
המודל שלנו פרה כרוך culturing משותפת של monocytes שעברו התמיינות עם תאים סרטניים. כפי שהצגנו קודם לכן, תאים סרטניים יכול להימשך גם במבחנה osteoclastogenesis12,13. מערכת זו ניתן לבדוק תרופות או לחקור מנגנונים של אינטראקציה, ככל האפשר לבצע ניתוח במורד הזרם מספר על תאים סרטניים והן osteoclasts. למעשה, זה ניתן לבצע מבחני התפשטות תאים סרטניים, ג'ין ביטוי ניתוחים המערבית מבחני כתם על שתי סרטן תאים של osteoclasts13. זה להיות עניין להבין איך המופרש חלבונים שונים בתנאים שונים. המודל שלנו יש מספר יתרונות, קרי, זה מודל אנושית לחלוטין, שאינה תלויה שורות תאים מאתר, בניגוד מספר מודלים דיווחו בספרות. המודל גם לשחזור ועמיד למדי, יכול לשמש למטרות אחרות. לדוגמה, שורות תאים סרטן אחרים יכול להיות משותף תרבותי עם osteoclasts, ההבדל כוחם osteoclastogenic למד. יתר על כן, מערכת זו ניתן להעריך מנגנונים פיזיולוגיים או פתולוגיים אחרים כדי לשפר את ההבנה שלנו של ביולוגיה העצם ומחלות בתיווך אוסטאוקלסט, כגון אוסטיאופורוזיס. סוגים אחרים ציטוקינים והתא יכול להיות גם תרבותי משותף יחד עם osteoclasts בהתאם מטרת הניסוי.
מספר ניתוחים במורד הזרם אפשריות עם מודל זה. חשוב להחליט במהלך שלב העיצוב של המחקר מה הבדיקות יבוצעו כך יכול להיות נזרע מספר בארות.
מבחני במורד הזרם עם Osteoclasts:
(i) ניתוח ביטוי גנים. תוכנית בארות נוספות של osteoclasts לחלץ RNA הכולל, ככל הבארות צבעונית להערכת השמנה אינם זמינים עבור החילוץ-RNA. (ii) תספיג ניתוחים. (iii) כימות אוסטאוקלסט פני השטח. אוסטאוקלסט גודל פרמטר עבור אוסטאוקלסט ההבשלה, ניתן לכמת באמצעות תוכנת קוד פתוח כגון ImageJ.
מבחני במורד הזרם עם תאים סרטניים:
(i) התפשטות מבחני כגון MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד. (ii) ניתוח ביטוי גנים. (iii) תספיג ניתוחים.
מבחני במורד הזרם עם Osteoclasts, תאים סרטניים (תרבות משותפת):
כמו תאים סרטניים של osteoclasts לשתף המדיום באותה תרבות, שניתן ללמוד האינטראקציה שלהם עם וזמינותו אליסה אילו analyzesthe הפרשת ציטוקינים ספציפיים, GFs ועוד מופרש חלבונים.
הפיתוח של מודל זה היה חיוני לפרוייקט שלנו, אנו מתכננים עוד לשיפורה בעתיד הקרוב. צעד חשוב יהיה להבדיל ומונוציטים ב- 3D על בסיס מינרלים מן קולגמן עצם מחקים מטריקס. אז אפשר היה להעריך ישירות אוסטאוקלסט פעילות עם וזמינותו ספיגת עצם. כאשר אנו ממשיכים ללמוד יותר על מגוון התפקידים בגילומו של osteoclasts ב עיבוד פיזיולוגיים ופתולוגיים החל עצם שיפוץ בהסדרת גרורות בעצמות, המודל שלנו יאפשר לחוקרים לבודד וללמוד osteoclasts במבחנה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות קאנג Yibin למתן את שורת התאים SCP2 ולורנה כריסטיאנו לסיוע העריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
