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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

परिधीय रक्त Monocytes सह से Osteoclastogenesis के एक मानव नैदानिक मॉडल का विकास स्तन कैंसर सेल लाइनों के साथ-कल्चरल

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

Summary

इस प्रोटोकॉल के विकास का वर्णन करता है एक इन विट्रो osteoclastogenesis के परिधीय रक्त monocytes से मानव नैदानिक मॉडल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के साथ संस्कृति के कैंसर कोशिका-अस्थिशोषक बातचीत की नकल करने के लिए । मॉडल हड्डी मेटास्टेसिस गठन के बारे में हमारी समझ और चिकित्सकीय विकल्प में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

अस्थि microenvironment में ट्यूमर कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच crosstalk हड्डी मेटास्टेसिस गठन के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक सह के स्तन कैंसर की कोशिकाओं की संस्कृति और osteoclasts की ओर भेदभाव के दौर से गुजर monocytes के एक इन विट्रो पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल विकसित की है । हम osteoclastogenesis के एक मॉडल परिधीय रक्त स्वस्थ दाताओं से एकत्र का एक नमूना से शुरू अनुकूलित । परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) पहले घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा अलग किया गया, एक उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त और दो विकास कारकों (GFs) जोड़कर अंतर करने के लिए प्रेरित: परमाणु कारक के रिसेप्टर उत्प्रेरक-κB ligand (RANKL) और macrophage कॉलनी-उत्तेजक भाज्या (MCSF). कोशिकाओं 14 दिनों के लिए संस्कृति में छोड़ दिया और फिर तय की और बहाव विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया । osteolytic बोन मेटास्टेसिस, अस्थि में कैंसर कोशिका आगमन के प्रभाव में से एक osteoclastogenesis की प्रेरण है । हम इस प्रकार सह स्तन कैंसर की कोशिकाओं की संस्कृतियों के साथ हमारे मॉडल को चुनौती के लिए GFs के संबंध में कैंसर कोशिकाओं के भेदभाव शक्ति का अध्ययन । कैंसर कोशिका-अस्थिशोषक बातचीत के अध्ययन का एक सीधा रास्ता स्तन कैंसर कोशिका संस्कृतियों से एकत्र और ताजा माध्यम के साथ मिश्रित वातानुकूलित माध्यम के उपयोग के आधार पर अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों प्रदर्शन करने के लिए है । इस मिश्रण तो अस्थिशोषक भेदभाव प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम भी प्रत्यक्ष सह संस्कृति है जिसमें कैंसर की कोशिकाओं और monocytes भेदभाव के दौर से गुजर के एक विधि अनुकूलित मध्यम और विनिमय स्रावित कारकों । इस मूल अप्रत्यक्ष सह संस्कृति पद्धति पर एक महत्वपूर्ण सुधार के रूप में शोधकर्ताओं ने दो कोशिका प्रकार के पारस्परिक बातचीत का पालन कर सकते है और दोनों कैंसर कोशिकाओं और osteoclasts के लिए बहाव का विश्लेषण करते हैं । इस विधि हमें मेटास्टेटिक हड्डी microenvironment पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और बीज कोशिका लाइनों स्तन कैंसर से प्राप्त उन के अलावा अंय करने के लिए सक्षम बनाता है । मॉडल में ऑस्टियोपोरोसिस या अन्य हड्डियों की स्थिति जैसे अन्य रोगों का भी अध्ययन किया जा सकता है ।

Introduction

अस्थि प्रोस्टेट, फेफड़े और स्तन कैंसर के रूप में प्राथमिक ट्यूमर के विभिंन प्रकार के लिए मेटास्टेसिस का एक आम साइट है, रोग के पाठ्यक्रम के दौरान हड्डी मेटास्टेसिस के विकास के 20-25% केसाथ1, 2, 3 । विशेष रूप से, स्तन कैंसर रोगियों की ७०% मौत पर हड्डी मेटास्टेसिस के सबूत ले4। ट्यूमर और stromal कोशिका संपर्क दोनों प्राथमिक कैंसर और द्वितीयक घावों में कैंसर की प्रगति के लिए आवश्यक है । अस्थि microenvironment में, स्तन कैंसर से osteolytic अस्थि मेटास्टेसिस एक रोग दुष्चक्र कैंसर कोशिकाओं के बीच होने वाली चक्र की स्थापना पर निर्भर करता है, अस्थि कोशिकाओं, और हड्डी microenvironment. कैंसर कोशिकाओं हड्डी संतुलन को बाधित, बढ़ती हड्डी याला५,६,७.

सामांय और रोग की स्थिति में, osteoclasts अस्थि अवशोषण के लिए जिंमेदार कोशिकाओं रहे हैं, जबकि osteoblasts, नए मैट्रिक्स जमा करने में, नई हड्डी के गठन के लिए जिंमेदार है8। अस्थिशोषक गतिविधि RANKL की अभिव्यक्ति है, जो पूर्व अस्थिशोषक सतह पर अपनी रिसेप्टर रैंक करने के लिए बांध के माध्यम से osteoblasts द्वारा विनियमित है, पूर्व अस्थिशोषक फ्यूजन, परिपक्व osteoclasts में भेदभाव के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया उत्प्रेरण. प्रेरणे osteoclastogenesis प्रमाणात याला वृद्धि होते. वीवो स्टडीज में बड़ी संख्या में अस्थि मेटास्टेसिस गठन9,10,11की हमारी समझ में काफी सुधार हुआ है । प्राथमिक ट्यूमर और अस्थि में से स्तन कैंसर की कोशिकाओं microenvironment perturb प्रमाणात homeostasis, संवर्धन osteoclastogenesis आणि वाढ याला८. इस परिदृश्य में, सभी आणविक बातचीत है कि कैंसर की कोशिकाओं और osteoclasts के बीच घटित महत्वपूर्ण महत्व के हैं । जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, अस्थि मेटास्टेसिस गठन के तंत्र में वीवो चूहों के मॉडलों का आविर्भाव किया गया है । हालांकि, आचार समिति द्वारा vivo पशु प्रयोगों में सभी की मंजूरी की जरूरत के अलावा, उच्च लागत और समय लेने वाली विधियों सहित vivo प्रयोगों में प्रदर्शन करने के लिए कई अन्य कमियां हैं. कई लेखकों vivo में नैदानिक संयुक्त है और इन विट्रो मॉडल osteoclastogenesis के पूर्व osteoclasts कच्चे 246.79,10,11बुलाया के एक murine लाइन का उपयोग कर । इस मॉडल की कमियां तथ्य यह है कि कोशिकाओं को पहले से ही पूर्व osteoclasts बनने के लिए प्रतिबद्ध है और मानव मूल के नहीं है से स्टेम । इन कारणों के लिए, शोधों के अनुसंधान से काफी इन विट्रो में पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल अस्थि कैंसर सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए की उपलब्धता से लाभ हो सकता है ।

हम मानव परिधीय रक्त के नमूनों12,13से शुरू इन विट्रो में osteoclastogenesis की एक विधि अनुकूलित । Osteoclasts monocytes से निकला है, जो मौजूद हैं, हालांकि एक छोटे से डिग्री करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों में. Mononuclear कोशिकाओं को पहले Ficoll घनत्व ढाल द्वारा एरिथ्रोसाइट्स और पूरे रक्त में मौजूद granulocytes से अलग कर रहे हैं; वे तो लिम्फोसाइटों के विपरीत, प्लास्टिक सब्सट्रेट करने के लिए उनका पालन करने की क्षमता के लिए धन्यवाद चुना जाता है. बोने के बाद, कोशिकाओं को 14 दिनों के लिए संस्कृति है । MCSF और RANKL monocytes द्वारा आवश्यक GFs है मैक्रोफेज में पहले अंतर और फिर osteoclasts14,15में । MCSF परख की पूरी अवधि के लिए आवश्यक है, जबकि RANKL osteoclastogenesis के देर चरणों में भेदभाव की प्रक्रिया को प्रेरित किया जाता है । भेदभाव के प्रारंभिक चरण में, MCSF monocytes पैदा में मदद करता है और14,15जीवित रहते हैं । osteoclastogenesis के दूसरे भाग के दौरान, कोशिकाओं के साथ फ्यूज और osteoclasts के रूप में परिपक्व, छल्ले में Actin एफ के लक्षण वितरण दिखा और tartrate के रूप में विशिष्ट मार्करों-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) और कैल्सीटोनिन रिसेप्टर व्यक्त सीटीआर) 14 , 15. हमारे विधि monocyte संस्कृति को MCSF जोड़ने के प्रयोग के पहले 7 दिनों के लिए और 7 से 14 दिनों से MCSF और RANKL का एक संयोजन शामिल हैं । प्रयोग के अंत में, osteoclastogenesis विभेदित कोशिकाओं की गिनती, नीचे के रूप में विस्तृत द्वारा विश्लेषण किया है ।

monocyte को GFs द्वारा अंतर करने के लिए प्रेरित संस्कृतियों हमारे नैदानिक मॉडल के आधार फार्म । हम GFs के बिना एक सह संस्कृति प्रणाली को बेहतर स्तन कैंसर की कोशिकाओं के osteoclastogenic शक्ति को समझने के लिए अनुकूलित । हम पहले एक माध्यम जोड़कर अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों के एक मॉडल विकसित (८०% α-ंयूनतम आवश्यक माध्यम (α-मेम) और 20% वातानुकूलित मध्यम स्तन कैंसर की कोशिकाओं है कि के बारे में ९०% थे अंतर के दौर से गुजर कोशिकाओं को धाराप्रवाह के एक संस्कृति से एकत्र12 . वातानुकूलित मध्यम (सीरम अभाव शर्तों के तहत एकत्र नहीं) 24 घंटे के बाद एकत्र किया गया था और 1:4 के अनुपात में ताजा माध्यम के साथ मिलाया । वातानुकूलित मध्यम नकारात्मक नियंत्रण के संबंध में महत्वपूर्ण अस्थिशोषक भेदभाव प्रेरित । हालांकि, के रूप में कैंसर की कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच पारस्परिक संपर्क पर जानकारी खो दिया है जब अप्रत्यक्ष सह संस्कृतियों का उपयोग कर, हम प्रत्यक्ष सह संस्कृतियों बाहर ले जाकर हमारी प्रणाली में सुधार हुआ । हम ०.४ µ मीटर आवेषण में कैंसर की कोशिकाओं को वरीयता दी और उंहें कुओं में रखा जहां mononuclear कोशिकाओं को चढ़ाया गया । इस विधि का उपयोग कर, कोशिकाओं को एक ही मध्यम और विनिमय गुप्त प्रोटीन का हिस्सा है । हम इस प्रकार कैंसर की कोशिकाओं को13से प्रेरित osteoclastogenesis के एक पूरी तरह से मानव नैदानिक मॉडल बनाया ।

इस प्रणाली के अत्यंत बहुमुखी है और विभिंन अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे, औषधीय अध्ययन में हड्डी मेटास्टेसिस में दवाओं की भूमिका की जांच । हमारे मॉडल यह कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति में हड्डी microenvironment में हड्डी लक्षित चिकित्सा और/या अर्बुदरोधी दवाओं की प्रभावकारिता और कार्रवाई के तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव बनाता है13. सही नियंत्रण के साथ प्रयोग डिजाइनिंग, यानी, कैंसर कोशिकाओं और व्यक्तिगत रूप से संस्कृति osteoclasts, यह आसान दवा गतिविधि पर सह संस्कृति के प्रभाव को समझने के लिए बनाता है । इस दृष्टिकोण और भी दिलचस्प हो जाता है जब दवा लक्ष्य का अध्ययन किया जा रहा दोनों कैंसर कोशिकाओं और osteoclasts, जैसे, everolimus16। यह मॉडल भी कैंसर कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच बातचीत के नए रास्ते की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > मानव osteoclasts को स्वस्थ दानदाताओं के PBMCs से विभेदित किया गया जिन्होंने अध्ययन में भाग लेने के लिए लिखित सूचित सहमति दे दी. अध्ययन प्रोटोकॉल स्थानीय एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था, के अनुसार में १९६४ हेलसिंकी की घोषणा में नीचे रखी नैतिक मानकों.

< p class = "jove_title" > 1. अस्थिशोषक भेदभाव

< p class = "jove_content" > नोट: EDTA में स्वस्थ मानव दाताओं से परिधीय रक्त या buffy कोट एकत्र करें । परिधीय रक्त के 20 मिलीलीटर से कम का उपयोग न करें । Buffy कोट बेहतर है क्योंकि वे mononuclear कोशिकाओं की एक बड़ी बहुतायत है । एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में निम्न चरणों का पालन करें.

  1. EDTA पूरे रक्त 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ 1:1 पतला । फिर से अच्छी तरह से सस्पेंड ।
    2. लिम्फोसाइट जुदाई मीडिया पर
  2. परत (रक्त पंजाबियों: लिम्फोसाइट जुदाई मीडिया, 2:1) में ५० मिलीलीटर ट्यूबों ।
    1. पिपेट एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में पंजाब में पतला खून की 30 मिलीलीटर ।
    2. धीरे ५०-एमएल ट्यूब के नीचे में लिम्फोसाइट जुदाई मीडिया के 15 मिलीलीटर बुनियाद ।
  3. केंद्रापसारक पर ७५७ & #215; जी कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए (कोई ब्रेक).
    4. mononuclear कोशिकाओं को इकट्ठा
  4. :
    1. आंदोलन के बिना एक 5 मिलीलीटर mononuclear के साथ पिपेट कोशिकाओं की सफेद परत को इकट्ठा करने और यह एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में जगह है ।
    2. के 20 मिलीलीटर के साथ एकत्र PBMCs पतला ।
  5. धुलाई PBMCs:
    1. के केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २२५ x जी में ।
    2. ट्यूब को पलटने से supernatant को त्याग दें । एक बार दोहराएं ।
  6. आरबीसी lysis:
    नोट: अगर सेल गोली लाल है, लाल रक्त कोशिका lysing बफर समाधान के साथ कोशिकाओं का इलाज ( सामग्री की मेज देखें) ।
    1. बर्फ पर ५० मिलीलीटर ट्यूब डाल
    2. लाल रक्त कोशिका lysing बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. एरिथ्रोसाइट lysis को पूरा करने के लिए 3-5 मिनट प्रतीक्षा करें । समय एरिथ्रोसाइट संदूषण की डिग्री के अनुसार बदलता रहता है ।
    4. ने पंजाब के 20 एमएल जोड़कर रिएक्शन पर रोक लगाई ।
    5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २२५ x g पर केंद्रापसारक । ट्यूब को पलटने से supernatant को त्याग दें ।
      नोट: वैकल्पिक: यदि आरबीसी lysis किया जाता है, नीचे वर्णित के रूप में PBMCs धो लो ।
  7. धो PBMCs:
    1. पंजाब के 20 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २२५ x g पर केंद्रापसारक ।
    2. ट्यूब को पलटने से supernatant को त्याग दें ।
  8. Re-reसस्पेंड प्रकोष्ठों में पूर् & #945;-मेम (1% glutamine (प्रारंभिक एकाग्रता 100X) और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक).
  9. एक Neubauer चैंबर के साथ कोशिकाओं गिनती ।
    1. पतला हिमनदों एसिटिक अम्ल में नमूना 1:100 और उपयोग 10 & #181; एल के कमजोर पड़ने कोशिकाओं की गणना करने के लिए.
    2. की गणना कम से दो बार और की गणना के माध्य की प्रतिकृतियां एकत्रित कक्षों की कुल संख्या का मतलब प्राप्त करने के लिए ।
  10. प्लेट कोशिकाओं:
    1. प्लेट कोशिकाओं की एकाग्रता पर ७५०,००० PBMCs प्रति सेमी 2 .
    2. एक मशीन में मढ़वाया कोशिकाओं की दुकान पर ३७ & #176; ग में एक 5% सह 2 वायुमंडल.
      नोट: नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल करने के लिए प्रयोग को डिज़ाइन करें, जो कि ऐसी कोशिकाएं हैं जिनका सामान्य पूर्ण & #945 के साथ इलाज किया जाता है;-मेम बिना MCSF या RANKL GFs. में प्रत्येक शर्त करने के लिए याद रखें ंयूनतम 3 तकनीकी प्रतिकृति । न्यूनतम 3 जैविक प्रतिकृति निष्पादित करें.
  11. मध्यम पूरक के साथ GFs:
    1. सेल सीडिंग के बाद 3 ज के बारे में प्रतीक्षा करें और फिर मध्यम निकालकर पिपेट (२००-१,००० & #181; L) मलबे, अनअनुलग्न कक्षों, और एरिथ्रोसाइट्स को छोड़ने के लिए.
      नोट: सेल टुकड़ी से बचने के लिए मीडियम बदलते समय सावधानी बरतें ।
    2. जोड़ नया पूरा & #945;-मेम पूरण MCSF के 20 एनजी/एमएल के साथ (५०० & #181; L/
      नोट: जब कैंसर कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन, बीज कैंसर कोशिकाओं PBMC बोने के बाद दिन ।
  12. हर 2-3 दिन में मीडिया बदल (& #945;-मेम पूरण के साथ 20 एनजी/MCSF के):
    1. माध्यम को त्याग कर एक २००-१,००० & #181; L पिपेट.
    2. एक २००-१,००० & #181 द्वारा नए ताजा माध्यम जोड़ें; L पिपेट.
  13. 6-7 दिन सेल सीडिंग के बाद, RANKL के 20 एनजी/एमएल जोड़ने के लिए पूरा & #945;-मेम + MCSF.
  14. परिवर्तन यम (complete & #945;-मेम + MCSF + RANKL) हर 2-3 दिन:
    1. यम को त्याग कर एक २००-१,००० & #181; L पिपेट.
    2. के साथ नए माध्यम जोड़ें २००-१,००० & #181; L पिपेट. भेदभाव की प्रेरण बंद सेल बोने के बाद 14 दिनों ।
    3. को छोड़ दें और पंजाबियों के साथ दो बार धो लें ।
  15. paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक:
    1. शुष्क करने के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें.
    2. Add 4% paraformaldehyde (सामग्री की तालिका देखें).
    3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
  16. त्याग paraformaldehyde और दो बार धो के साथ ५०० & #181; पंजाब के एल.
    सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; कृपया दस्ताने, मुखौटा और चश्मा पहनते हैं ।
  17. कोशिकाओं को शुष्क करने की अनुमति दें ।
  18. निर्माता के अनुसार जाल धुंधला प्रदर्शन & #39; s निर्देश (देखें सामग्री की तालिका).
  19. की गणना अस्थिशोषक-की तरह कोशिकाओं को स्वयं आवर्धन 10x पर माइक्रोस्कोप के तहत; न ०.३०.
    नोट: अस्थिशोषक-like कक्षों को ट्रैप + polycarion कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें कम से 4 नाभिक.
< p class = "jove_title" > 2. कैंसर सेल संस्कृतियों

< p class = "jove_content" > नोट: प्रयोगों के विभिन्न प्रकारों के साथ किया जा सकता है स्तन ग्रंथिकर्कटता सेल लाइनों जैसे SCP2 < सुप वर्ग = "xref" > 17 , एक osteotropic सेल लाइन ट्रिपल नेगेटिव मानव से उद्भव स्तन कैंसर सेल लाइन (एमडीए-एमबी-२३१), और हार्मोनल रिसेप्टर-सकारात्मक सेल लाइन MCF7.

  1. संस्कृति ७५ में एक monolayer के रूप में कोशिकाओं-सेमी 2 कुप्पी ।
    1. बीज १,०००,००० एक ७५ में कैंसर की कोशिकाओं-सेमी 2 कुप्पी.
    2. पर कोशिकाओं को स्टोर करें ३७ & #176; C in complete & #945;-मेम मध्यम 1% glutamine और 10% एक 5% सह 2 वातावरण में भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ।
  2. कोशिकाओं के बारे में ९०% के एक प्रवाह में अलग:
    1. माध्यम को त्यागें, पंजाबियों से धो लें, और पंजाब में trypsin 1x के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. 3-5 मिनट में ३७ & #176; C.
    3. एक 10 मिलीलीटर पिपेट द्वारा ७५ सेमी 2 कुप्पी से अलग कोशिकाओं को इकट्ठा, एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए पूरा माध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ने.
    4. 5 min.
      5. के लिए २२५ x g पर केंद्रापसारक
  3. धो लें कैंसर कोशिकाएं:
    1. के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
    2. 5 min.
      3. के लिए ६०० x g पर केंद्रापसारक
  4. एक Neubauer चैंबर के साथ कैंसर कोशिकाओं गिनती ।
    1. की गणना कैंसर कोशिकाओं को कम से दो बार और दोहराने के मतलब की गणना एकत्र कोशिकाओं की कुल मतलब संख्या प्राप्त करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. प्रत्यक्ष सह कैंसर कोशिकाओं की संस्कृतियों एक एन डी Monocytes के दौर से गुजर Osteoclasts

  1. बीज आवेषण पर कैंसर कोशिकाओं (ताकना व्यास ०.४ & #181; m):
    1. बीज प्रति सेमी ४,००० कोशिकाओं की एकाग्रता पर कैंसर कोशिकाओं 2 .
    2. पर ३७ & #176; ग र 5% सह 2 .
      नोट: कैंसर कोशिकाओं बीज सह संस्कृति प्रयोग के लिए PBMC बोने के बाद दिन में ०.४ & #181; मी न्या.
  2. कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए 24 ज के लिए प्रतीक्षा करें.
  3. जगह mononuclear संस्कृतियों पर बीज डालने संस्कृति को सह संस्कृति शुरू (१.१० प्रोटोकॉल की धारा देखें) ।
  4. बदल कर हर 2-3 दिन के साथ पूरे & #945;-मेम.
    1. २००-१,००० & #181 के साथ यम त्यागें; L पिपेट.
    2. Add ५०० & #181; ताजा माध्यम के एल.
      नोट: सह-संस् कृति का प्राथमिक उद्देश् य कैंसर कोशिकाओं की osteoclastogenic शक्ति को समझना है, इसलिए GFs को नहीं जोड़ा जाता है & #945;-मेम. सह संस्कृति के प्रत्येक प्रयोग में, पूर्वोत्तर में शामिलgative नियंत्रण (प्रोटोकॉल के चरण १.१० में नोट देखें) और RANKL और MCSF (कोई कैंसर कोशिकाओं) द्वारा विभेदित osteoclasts के सकारात्मक नियंत्रण. कैंसर mononuclear कोशिकाओं पर नहीं रखा आवेषण में बीज कोशिकाओं सह संस्कृति का एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है ।
  5. बंद करो सह संस्कृति और बहाव विश्लेषण के लिए कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करें:
    1. 13 दिनों के बाद PBMC सीडिंग और 12 दिनों के कैंसर कोशिका बोने के बाद, एक नई थाली पर डालने प्लेस ।
    2. कैंसर सेल संस्कृति के आधार पर जो बहाव के विश्लेषण के लिए प्रदर्शन किया जा रहे है (देखें चर्चा ) ।
  6. पर 14 दिन, अस्थिशोषक अंतर और फिक्स कक्षों, चरण १.१५ में रिपोर्ट की गई के रूप में बंद करें ।
  7. तुरंत या 14-30 दिनों के भीतर जाल धुंधला प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: वैकल्पिक धुंधला: यह पुष्टि करने के लिए कि TRAP + polycarion कक्ष osteoclasts हैं, शोधकर्ताओं ने CTR का पता लगाने के लिए अतिरिक्त दाग-धब्बा, एक अस्थिशोषक-विशिष्ट मार्कर का प्रदर्शन कर सकते हैं. F-actin रिंग्स का पता लगाना एक और अस्थिशोषक-विशिष्ट धुंधला परख है < सुप class = "xref" > 12 , < सुप class = "xref" > 13 , < सुप class = "xref" > 14 .

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Representative Results

एक विधि को आसानी से मानव परिधीय रक्त monocytes से osteoclasts अंतर अनुकूलित किया गया । monocyte संस्कृति कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति, पुष्टि (के रूप में साहित्य18में वर्णित) है कि कैंसर की कोशिकाओं को अस्थि मेटास्टेसिस में osteoclastogenesis बनाए रखने में सक्षम हैं । Osteoclasts कैंसर कोशिकाओं और GFs से विभेदित चित्रा 1में दिखाया गया है । एक अस्थिशोषक सेल की तरह 4 या अधिक नाभिक के साथ एक सेल है और जाल धुंधला (बैंगनी कोशिकाओं) के लिए सकारात्मक है । एक अस्थिशोषक को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया नाभिक की संख्या के लिए स्वीकृत कटौती बंद 318है, लेकिन हम एक न्यूनतम करने के लिए झूठी सकारात्मक के जोखिम को कम करने के लिए 4 का उपयोग करने का फैसला किया.

मॉडल से पता चलता है कि स्तन कैंसर कोशिकाओं निरंतर osteoclastogenesis क्योंकि कैंसर कोशिकाओं द्वारा प्रेरित कुओं में osteoclasts की संख्या सकारात्मक नियंत्रण में प्राप्त करने के लिए समान था (चित्रा 2) । जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है, कई कक्ष भी नकारात्मक नियंत्रण में osteoclasts में सहज रूप से विभेदित होते हैं । आदेश में मॉडल की उपयोगिता की पुष्टि करने के लिए, प्रणाली एक अर्बुदरोधी दवा12,13के साथ चुनौती दी थी । अस्थिशोषक संख्या में अधिक थे सह-संस्कृति की स्थिति और सकारात्मक नियंत्रण (सीटीआर +) के नमूनों की तुलना में नकारात्मक नियंत्रण (सीटीआर-) के नमूने । अस्थिशोषक संख्या में दवा की उपस्थिति में काफी कमी आई (everolimus) दोनों में सह-संस्कृति की स्थिति और सकारात्मक नियंत्रण (सीटीआर +) । टी परीक्षण सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक कुआं में कोशिकाएं गिनी जाती थीं । सतह areaof अस्थिशोषक परिपक्वता की एक विशेषता है और ImageJ के रूप में खुला स्रोत सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । Osteoclasts GFs से व्युत्पंन कैंसर कोशिकाओं (चित्रा बी) द्वारा प्रेरित उन से बड़े थे. एक अर्बुदरोधी दवा (everolimus) के साथ उपचार GFs के प्रभाव को बंद कर दिया । मॉडल osteoclastogenesis निषेध में दवा की भूमिका पर उपयोगी जानकारी प्रदान की है । चित्र 2c पता चलता है कि osteoclastogenesis दवा की उपस्थिति में कमी आई है । इन परिणामों को सह संस्कृति प्रेरित osteoclastogenesis द्वारा प्राप्त किया गया । के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में बताया गया है, अंय अनुप्रवाह का विश्लेषण के एक नंबर के लिए crosstalk के तंत्र की जांच करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है और/ चित्रा 3 में संक्षेप मॉडल अत्यधिक versatileand कैंसर की कोशिकाओं पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से, osteoclasts.

Figure 1
चित्र 1. Osteoclastogenesis परख । कोशिकाओं को संस्कृति में 14 दिनों के बाद दाग । सीटीआर-monocytes विकास कारकों के अभाव में प्रसंस्कृत; सीटीआर + monocytes RANKL और MCSF वृद्धि कारकों के साथ प्रसंस्कृत; कोको, osteoclasts कैंसर कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन रक्त कोशिकाओं द्वारा प्राप्त की । 10x आवर्धन । अस्थिशोषक-की तरह कोशिकाओं को कम 4 नाभिक कि जाल (बैंगनी कोशिकाओं) के लिए सकारात्मक थे के साथ कोशिकाओं थे । कोशिकाएँ प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं की गिनती करके मात्रा थीं; 4 प्रतिकृति प्रत्येक शर्त के लिए किया गया था और औसत परिकलित किया गया था । स्केल बार ४०० µm है । छवि निचले पैनल में ज़ूम (100X) 2 osteoclasts (लाल हलकों) की सतह क्षेत्र दिखाता है । तीर अस्थिशोषक नाभिक संकेत करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. osteoclastogenesis उपचार पर everolimus का प्रभाव । (क) उपस्थिति के अनुसार osteoclasts की संख्या किसी औषध के अभाव/ 4 प्रत्येक शर्त के लिए प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । सीटीआर-monocytes विकास कारकों के अभाव में प्रसंस्कृत; सीटीआर + monocytes RANKL और MCSF वृद्धि कारकों के साथ प्रसंस्कृत; कोको, osteoclasts कैंसर कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन रक्त कोशिकाओं द्वारा प्राप्त की । डेटा मतलब ± एसई के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । महत्व टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था; * प & #60; ०.०५. (B) अस्थिशोषक सतह क्षेत्र को ImageJ ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर द्वारा परिकलित किया गया था । शर्त के अनुसार कम से ५० osteoclasts मापा गया । सीटीआर-monocytes विकास कारकों के अभाव में प्रसंस्कृत; सीटीआर + monocytes RANKL और MCSF वृद्धि कारकों के साथ प्रसंस्कृत; कोको, osteoclasts कैंसर कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन रक्त कोशिकाओं द्वारा प्राप्त की । (ग) किसी अर्बुदरोधी दवा (everolimus) के अभाव या उपस्थिति में संस्कृति में 14 दिनों के बाद कोशिकाओं की छवियां । 10x आवर्धन; स्केल बार ४०० µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. सह संस्कृति मॉडल । मॉडल की योजना और उसके संभव बहाव का विश्लेषण और भविष्य अनुप्रयोगों के । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इन विट्रो में नैदानिक मॉडल कैंसर कोशिकाओं और अस्थि कोशिकाओं के बीच crosstalk के तंत्र का अध्ययन करने के लिए अस्थि मेटास्टेसिस के तंत्र की पहचान की जरूरत है कि नए चिकित्सीय रणनीतियों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम मानव परिधीय रक्त (चित्रा 3) से osteoclastogenesis के इन विट्रो मॉडल में एक पूरी तरह से मानव विकसित की है । कार्यप्रणाली के अनुकूलन के दौरान कई महत्वपूर्ण बिंदुओं की पहचान की गई और उनका समाधान किया गया । पहले mononuclear कोशिकाओं की मात्रा के बीज के लिए चिंतित । माइक्रोस्कोप गिनती द्वारा प्राप्त कोशिकाओं की संख्या केवल एक मोटा ठहराव के रूप में यह लिम्फोसाइटों और monocytes के बीच भेदभाव करने के लिए मुश्किल है, बाद osteoclastogenesis प्रयोग के लिए बीज के लिए लक्ष्य कोशिकाओं जा रहा है । हम monocytes की पहचान करने में सक्षम थे क्योंकि लिम्फोसाइटों प्लास्टिक सब्सट्रेट करने के लिए पालन नहीं करते हैं और इस तरह बहुमत मध्यम के पहले परिवर्तन पर समाप्त किया गया था. कोशिकाओं को एक उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त थे, के रूप में यह कोशिकाओं के लिए आवश्यक करने के लिए भेदभाव के लिए एक दूसरे के साथ बातचीत करने में सक्षम हो, विशेष रूप से osteoclastogenesis के दूसरे चरण में जो पूर्व osteoclasts के लिए करीब एक साथ होना चाहिए में आदेश फ्यूज और बन परिपक्व osteoclasts । एक और कठिनाई पैदा होती है जब वहां कई प्रयोगात्मक शर्तों क्योंकि इन कोशिकाओं की एक उच्च संख्या और रक्त की एक बड़ी राशि की आवश्यकता होती है । एक संभव समाधान के लिए buffy कोट है कि PBMCs के एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करने के लिए है, उदा, 4 x 105-6 x 106 mononuclear कोशिकाओं को सामान्य रूप से एक ५० मिलीलीटर buffy कोट नमूना से कम 1 x 105 PBMCs से एकत्र की तुलना में एक से एकत्र कर रहे हैं 20 मिलीलीटर रक्त का नमूना लिया ।

के रूप में रक्त के नमूने अलग स्वयंसेवकों से एकत्र किए गए थे, वहां osteoclastogenesis परख में परिवर्तनशीलता के कुछ डिग्री थी । यह इस प्रकार के साथ एक परख करने के लिए महत्वपूर्ण था ंयूनतम 3-4 तकनीकी प्रतिकृतियां । जैविक प्रतिकृति भी जरूरत थी और विभिंन स्वस्थ दाताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया था, हम आम तौर पर विभिंन प्रयोगों द्वारा प्राप्त मूल्यों के मतलब की गणना नहीं था । हमने यह सुनिश्चित किया कि विभिंन परीक्षणों के रुझान बराबर थे और फिर एक प्रयोग को चुना स्वस्थ दाताओं में से एक को पांडुलिपि में शामिल हो ।

हमारे नैदानिक मॉडल कैंसर कोशिकाओं के साथ भेदभाव के दौर से गुजर monocytes के सह संवर्धन शामिल है । जैसा कि हम पहले से पता चला, कैंसर की कोशिकाओं को भी इन विट्रो osteoclastogenesis12,13 में बनाए रख सकते हैं । यह प्रणाली दवाओं का परीक्षण करने के लिए या बातचीत के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में यह दोनों कैंसर कोशिकाओं और osteoclasts पर कई बहाव विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए संभव है । वास्तव में, यह कैंसर की कोशिकाओं और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पर प्रसार परख प्रदर्शन करने के लिए संभव है/पश्चिमी दाग परख दोनों कैंसर कोशिकाओं और osteoclasts13पर । यह ब्याज की कैसे गुप्त प्रोटीन अलग स्थितियों में अलग समझने के लिए किया जाएगा । हमारे मॉडल के कई फायदे हैं, यानी, यह एक पूरी तरह से मानव मॉडल है कि murine सेल लाइनों पर निर्भर नहीं है, साहित्य में रिपोर्ट की गई अनेक मॉडलों के विपरीत है । मॉडल भी काफी मजबूत और प्रतिलिपि है, और अंय प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, अंय कैंसर कोशिका लाइनों osteoclasts के साथ सह-संस्कृति हो सकता है और उनके osteoclastogenic सत्ता में अंतर का अध्ययन किया । इसके अलावा, इस प्रणाली के लिए अंय शारीरिक या रोग तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए अस्थि जीवविज्ञान और ऑस्टियोपोरोसिस के रूप में अस्थिशोषक-मध्यस्थता रोगों की हमारी समझ में सुधार किया जा सकता है । अंय साइटोकिंस और कोशिका प्रकार भी प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर osteoclasts के साथ सह-कल्चरित हो सकते हैं ।

कई बहाव विश्लेषण इस मॉडल के साथ संभव हो रहे हैं । यह अध्ययन के डिजाइन चरण के दौरान तय करना महत्वपूर्ण है क्या विश्लेषण किया जाएगा ताकि कुओं की एक पर्याप्त संख्या वरीयता प्राप्त किया जा सकता है ।

Osteoclasts के साथ अनुप्रवाह परख:

(i) जीन अभिव्यक्ति िरा. osteoclasts के अतिरिक्त कुओं की योजना कुल आरएनए निकालने के लिए, के रूप में कुओं जाल मूल्यांकन के लिए दाग आरएनए निष्कर्षण के लिए उपलब्ध नहीं हैं । (२) पाश्चात्य ब्लाटर िरा. (iii) अस्थिशोषक सतह क्षेत्र का ठहराव । अस्थिशोषक आकार अस्थिशोषक परिपक्वता के लिए एक पैरामीटर है और मात्रा ऐसे ImageJ के रूप में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सकते हैं ।

कैंसर की कोशिकाओं के साथ अनुप्रवाह परख:

(i) प्रसार परख जैसे MTT 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड । (२) जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण. (iii) पश्चिमी दाग विश्लेषण ।

Osteoclasts और कैंसर कोशिकाओं के साथ बहाव परख (सह संस्कृति):

के रूप में कैंसर की कोशिकाओं और osteoclasts एक ही संस्कृति माध्यम का हिस्सा है, उनकी बातचीत एलिसा परख जो विशिष्ट साइटोकिंस, GFs और अंय गुप्त प्रोटीन के स्राव analyzesthe के साथ अध्ययन किया जा सकता है ।

इस मॉडल का विकास हमारी परियोजना के लिए महत्वपूर्ण था और हम निकट भविष्य में इसे और बेहतर बनाने की योजना बना रहे हैं । एक प्रमुख कदम आगे के लिए 3 डी खनिज कोलेजन पाड़ों में monocytes अंतर को हड्डी मैट्रिक्स की नकल होगी । यह तो सीधे एक हड्डी याला परख के साथ अस्थिशोषक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए संभव होगा । जैसा कि हम शारीरिक और अस्थि मेटास्टेसिस को विनियमित करने के लिए हड्डी remodeling से लेकर रोग प्रसंस्करण में osteoclasts द्वारा निभाई विविध भूमिकाओं के बारे में अधिक जानने के लिए जारी है, हमारे मॉडल शोधकर्ताओं को अलग करने के लिए सक्षम हो जाएगा और osteoclasts में अध्ययन इन विट्रो .

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम SCP2 सेल लाइन और संपादकीय सहायता के लिए क्रिस्टियानो वेरना प्रदान करने के लिए Yibin कांग धंयवाद देना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Euroclone BE12-169F
Glutamine Life-technologies ECB3000D
Fetal bovine serum Life-technologies ECS0180DPR
hMCSF Peprotech 300-25 Storage indications must be respected
hRANKL Peprotech 310-01 Storage indications must be respected
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma Aldrich 387 A
Lymphocyte separation media Biowest L0560-100
Red Blood cell lysing buffer SIgma 11814389001
ROCHE
Trypsin EuroClone COD.
ECB3052D
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
MDA-MB-231 cell line ATCC CRM-HTB-267
MCF7 ATCC HTB-22
Transwell Corning 3470-Clear These inserts are for 24-well plates;
6.5 mm, 0.4 μM;
pore size

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References

  1. Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
  2. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
  3. Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
  4. Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
  5. Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
  6. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
  7. Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
  8. Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
  9. Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
  10. Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
  11. Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
  12. Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
  13. Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
  14. Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
  15. Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
  16. Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
  17. Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  18. Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).

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कैंसर अनुसंधान अंक १२७ osteoclastogenesis कैंसर कोशिकाओं सह संस्कृतियों RANKL MCSF अस्थि मेटास्टेसिस इन विट्रो में मानव नैदानिक मॉडल
परिधीय रक्त Monocytes सह से Osteoclastogenesis के एक मानव नैदानिक मॉडल का विकास स्तन कैंसर सेल लाइनों के साथ-कल्चरल
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Mercatali, L., Spadazzi, C.,… More

Mercatali, L., Spadazzi, C., Miserocchi, G., Liverani, C., De Vita, A., Bongiovanni, A., Recine, F., Amadori, D., Ibrahim, T. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (127), e56311, doi:10.3791/56311 (2017).

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