Summary
Denne protokollen beskriver utviklingen av en i vitro menneskelige prekliniske modell av osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter kultivert med bryst kreftcelle linjer å etterligne kreft celle-osteoclast interaksjon. Modellen kan brukes til å fremme vår forståelse av bein metastasering dannelse og forbedre behandlingsalternativer.
Abstract
Crosstalk mellom svulst cellene og bein i bein microenvironment er avgjørende å forstå mekanismen av bein metastasering formasjon. Vi utviklet en i vitro fullt menneskelige prekliniske modellen av en co kultur av brystkreft celler og monocytter gjennomgår differensiering mot osteoklast. Vi har optimalisert en modell av osteoclastogenesis fra et utvalg av perifert blod fra friske blodgivere. Perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ble først atskilt med tetthet gradert sentrifugering, seeded på en høy tetthet og overtalt til å skille ved å legge til to vekstfaktorer (GFs): reseptor aktivator av kjernefysiske faktor-κB ligand (RANKL) og macrophage koloni-stimulerende faktor (MCSF). Cellene ble igjen i kulturen i 14 dager og deretter fast og analyseres av nedstrøms. I osteolytic benmetastaser er en av effekten av kreft cellen ankomst i bein induksjon av osteoclastogenesis. Vi dermed utfordret vår modell med co kulturer av brystkreft celler å studere differensiering kraften av kreftceller med hensyn til GFs. En grei måte å studere kreft celle-osteoclast interaksjon er å utføre indirekte co kulturer basert på bruk av betinget medium samlet fra bryst kreft cellekulturer og blandet med fersk medium. Denne blandingen brukes deretter til å indusere osteoclast differensiering. Vi har også optimalisert en metode for direkte co kultur i som kreft celler og monocytter gjennomgår differensiering dele mediet og utveksle utskilles faktorer. Dette er en betydelig forbedring over den opprinnelige indirekte co kultur metoden forskere kan observere gjensidige samspillet av de to cellen og utføre nedstrøms analyser for både kreftceller og osteoklast. Denne metoden gjør det mulig for oss å studere effekten av legemidler på metastatisk bone microenvironment og frø cellelinjer utenom det som er avledet fra brystkreft. Modellen kan også brukes til å studere andre sykdommer som osteoporose eller andre bein forhold.
Introduction
Ben er en vanlig metastasering for ulike typer primære svulster som prostata, lunge og bryst kreft, med 20-25% av pasientene utvikler bein metastaser i løpet av sykdommen1,2,3. Spesielt bære 70% av brystkreftpasienter bevis av bein metastasering død4. Svulst og stromal cell samhandling er viktig for kreft progresjon både primære kreft og sekundære lesjoner. I bein-microenvironment avhenger osteolytic benmetastaser av brystkreft etableringen av en patologisk ond syklus oppstår mellom kreftceller, beinet cellene og Ben microenvironment. Kreftceller forstyrre bein balanse, øke bein benresorpsjon5,6,7.
I normale og patologiske forhold er osteoklast celler ansvarlig for benresorpsjon, mens osteoblasts, ved innskudd nye matrise, er ansvarlig for nye bein formasjon8. Osteoclast aktivitet er regulert av osteoblasts gjennom uttrykk for RANKL, som binder seg til sin reseptor rangering på pre osteoclast overflaten, inducing pre osteoclast fusion, en nødvendig prosess for differensiering i eldre osteoklast. Induksjon av osteoclastogenesis øker benresorpsjon. Et stort antall i vivo studier har forbedret vår forståelse av bein metastasering formasjon9,10,11. Brystkreft celler fra den primære svulsten og bein microenvironment forurolige bein homeostase, fremme osteoclastogenesis og bein benresorpsjon8. I dette scenariet er alle molekylære interaksjoner som oppstår mellom kreftceller og osteoklast av avgjørende betydning. Som allerede nevnt, har mekanismen av bein metastasering dannelsen blitt belyst i vivo mus modeller. Men i tillegg til behovet for godkjenning av alle i vivo dyreforsøk av komité for etikk er det flere andre ulemper å utføre i vivo eksperimenter inkludert høye kostnader og tidkrevende metoder. Flere forfattere har kombinert prekliniske i vivo og i vitro modeller av osteoclastogenesis bruker en murine linje av pre osteoklast kalt RAW246.79,10,11. Ulempene med denne modellen stammer fra det faktum at cellene er allerede forpliktet til å bli før osteoklast og er ikke menneskets opprinnelse. For disse grunner, kan translasjonsforskning mye nytte av tilgjengeligheten av i vitro fullstendig menneske prekliniske modeller å studere bein kreft cellen interaksjoner.
Vi har optimalisert en metode for osteoclastogenesis i vitro fra menneskelige perifert blod prøver12,13. Osteoklast avledes fra monocytter, som er til stede, om enn i liten grad i perifert blodprøver. Mononukleære celler er først atskilt fra erytrocytter og granulocytter i fullblod med Ficoll tetthet gradert; de deretter valgt takket være deres evne til å overholde plastikk substrat, i motsetning til lymfocytter. Etter seeding, er celler kultivert i 14 dager. MCSF og RANKL er GFs kreves av monocytter å skille først i makrofager og så i osteoklast14,15. MCSF er nødvendig for hele varigheten av analysen, mens RANKL blir brukt å indusere differensiering prosessen på slutten stadier av osteoclastogenesis. I den tidlige fasen av differensiering hjelper MCSF monocytter sprer og overleve14,15. Under den andre delen av osteoclastogenesis, celler smelter sammen og eldre som osteoklast viser karakteristiske fordelingen av utgangen F i ringer og uttrykke spesifikke indikatorer som tartrate-resistente sure fosfatase (TRAP) og calcitonin reseptor (CTR) 14 , 15. våre metoden består av å legge MCSF til monocytt kultur for de første 7 dagene i eksperimentet og en kombinasjon av MCSF og RANKL fra 7 til 14 dager. På slutten av eksperimentet, er osteoclastogenesis analysert ved å telle differensierte celler, som beskrevet nedenfor.
Monocytt kulturer overtalt til å skille av GFs danner grunnlaget for vår prekliniske modell. Vi har optimalisert en co kultur-systemet uten GFs å forstå osteoclastogenic makt brystkreft celler. Vi utviklet en modell av indirekte co kulturer ved å legge til et medium (80% α-Minimal viktig Medium (α-MEM) og 20% betinget medium samlet fra en kultur av brystkreft celler at var ca 90% confluent celler under differensiering12 . Betinget mediet (ikke samlet under serum deprivasjon forhold) ble samlet inn etter 24 timer og blandet med fersk medium på en andel av 1:4. Betinget mediet indusert betydelig osteoclast differensiering forhold til kontrollen negative. Men som informasjon om gjensidige samspillet mellom kreftceller og beinet cellene går tapt når du bruker indirekte co kulturer, forbedret vi vårt system ved å utføre direkte co kulturer. Vi seeded kreftceller i 0,4 µM setter inn og plassert dem i brønner hvor mononukleære celler var belagt. Bruker denne metoden, celler dele den samme mediet og utveksle utskilles proteiner. Vi har derfor opprettet en fullstendig menneske prekliniske modell av osteoclastogenesis forårsaket av kreft celler13.
Dette systemet er svært allsidig og kan brukes til forskjellige forskningsformål, f.eksi farmakologiske studier undersøke rollen som narkotika i bein metastasering. Vår modell gjør det mulig å studere effekten og virkningsmekanismer av bein-målrettet terapi og/eller antitumor narkotika i bein microenvironment i nærvær av kreft celler13. Designe eksperimenter med riktig kontrollene, gjør dvs, kreftcellene og osteoklast kulturperler, det enklere å forstå virkningen av co kultur på narkotika aktivitet. Denne tilnærmingen blir enda mer interessant når stoffet blir studert mål både kreft celler og osteoklast f.ekseverolimus16. Denne modellen kan også brukes til å identifisere nye veier av samspillet mellom kreftceller og beinet cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
menneskelig osteoklast var differensiert fra PBMCs sunn givere som ga skriftlig samtykke i studien. Studien protokollen ble godkjent av den lokale etikk-komiteen, i samsvar med de etiske standardene fastsatt i 1964 erklæring i Helsinki.
1. osteoclast differensiering
Merk: samle perifert blod eller buffy strøk fra sunne menneskelige givere i EDTA. Bruk ikke mindre enn 20 mL perifert blod. Buffy strøk er å foretrekke fordi de har en større overflod av mononukleære celler. Utføre alle følgende trinn i sterilt vev kultur hette.
- Fortynne EDTA fullblod 1:1 med 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Nytt suspendere godt.
- Lag på lymfocytt separasjon media (blod PBS: lymfocytt separasjon media, 2:1) i 50 mL rør.
- Pipetter 30 mL blod fortynnet i PBS i en 50 mL tube.
- Forsiktig underlag 15 mL av lymfocytt separasjon media i bunnen av 50 mL tube.
- Sentrifuge 757 × g for 10 min ved romtemperatur (ingen bremser).
- Samle mononukleære celler:
- samle det hvite laget av mononukleære celler med en 5 mL pipette uten agiterte og plasserer den i en ny 50 mL tube.
- Fortynne de innsamlede PBMCs med 20 mL PBS.
- Vask PBMCs:
- sentrifuge 225 x g for 5 min ved romtemperatur.
- Kaste nedbryting av invertere røret. Gjentas én gang.
- RBC lysis:
Merk: Hvis cellen pellets er rød, behandle celler med røde blodlegemer lysing buffer løsning (se Tabell for materiale).- Legge 50 mL røret på ice.
- Legge til 5 mL av røde blodlegemer lysing buffer.
- Vente 3-5 minutter å fullføre den røde blodlegemer lysis. Tiden varierer etter røde blodlegemer forurensning.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 20 mL PBS.
- Sentrifuge 225 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Forkaste nedbryting av invertere røret.
Merk: Valgfritt: Hvis RBC lysis utføres, vask PBMCs som beskrevet under.
- Vask PBMCs:
- legge til 20 mL PBS og sentrifuger 225 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Forkaste nedbryting av invertere røret.
- å suspendere cellene i fullstendig α-MEM (supplert med 1% glutamin (innledende konsentrasjon 100 X) og 10% fosterets bovin serum).
- Telle celler med en Neubauer kammer.
- Fortynne eksempel 1: 100 i iseddik og bruke 10 µL av fortynning telle celler.
- Teller minst to ganger og beregne gjennomsnittet av replikat å få gjennomsnittlig antall celler samlet.
- Plate celler:
- Plate celler i en konsentrasjon av 750 000 PBMCs per cm 2.
- Lagre belagt celler i en inkubator på 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfære.
Merk: Design å inkludere negative kontroller, som er celler som behandles med vanlig komplett α-MEM uten MCSF eller RANKL GFs. Husk å utføre hver betingelse i minst 3 teknisk replikerer. Utføre minst 3 biologiske gjentak.
- Endre mediet med GFs:
- vente ca 3 h etter celle såing og deretter fjerner mediet ved Pipetter (200-1000 µL) forkaste rusk, ledige celler og erytrocytter.
Merk: Vær forsiktig når du endrer medium for å unngå celle løsgjøring. - Legge til nye komplett α-MEM supplert med 20 ng/mL MCSF (500 µL/vel).
Merk: Når co dyrking kreftceller, frø kreft celler dagen etter den PBMC seeding.
- vente ca 3 h etter celle såing og deretter fjerner mediet ved Pipetter (200-1000 µL) forkaste rusk, ledige celler og erytrocytter.
- Endre media hver 2-3 dager (α-MEM supplert med 20 ng/mL MCSF):
- forkaste mediet av en 200-1000 µL pipette.
- Legg til nytt frisk medium av en 200-1000 µL pipette.
- 6-7 dager etter celle seeding, legge til 20 ng/mL RANKL komplett α-MEM + MCSF.
- Endre medium (komplett α-MEM + MCSF + RANKL) hver 2-3 dager:
- forkaste mediet med en 200-1000 µL pipette.
- Legge til nye medium med en 200-1000 µL pipette. Stoppe induksjon av differensiering 14 dager etter celle seeding.
- Forkast medium og vask to ganger med PBS.
- Fikse celler med paraformaldehyde:
- La cellene tørke.
- Legge til 4% paraformaldehyde (se Tabell av materialer).
- Incubate etter 20 min i romtemperatur.
- Forkaste paraformaldehyde og vaske to ganger med 500 µL av PBS.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er giftig; Vennligst bære hansker, maske og briller. - Tillate celler tørke.
- Utføre FELLE flekker ifølge produsenten ' s instruksjoner (se Tabell av materialer).
- Telle osteoclast-lignende celler manuelt under mikroskopet ved forstørrelse 10 X; NA 0,30.
Merk: Osteoclast-lignende celler er definert som FELLE + polycarion celler med minst 4 kjerner.
2. Kreft cellekulturer
Merk: eksperimenter kan utføres med ulike typer bryst adenocarcinoma linjer som SCP2 17, en osteotropic celle linje som stammer fra trippel negative menneske bryst kreft cellen linje (MDA-MB-231) og hormonelle reseptor-positiv celle linjen MCF7.
- Kultur cellene som en monolayer i 75 cm 2 flasker.
- Frø 1,000,000 kreftceller i en 75 cm 2 kolbe.
- Lagre cellene på 37 ° C i fullstendig α-MEM medium med 1% glutamin og 10% fosterets bovin serum i en 5% CO 2 atmosfære.
- Koble cellene på en confluency på ca 90%:
- forkaste medium, vask med PBS og legge 2-3 mL av trypsin 1 X i PBS.
- Ruge celler for 3-5 minutter på 37 ° C.
- Samle frittliggende cellene fra 75 cm 2 kolbe av en 10 mL pipette, legge 8 mL komplett medium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
- Sentrifuger 225 x g i 5 min.
- Vask kreftcellene:
- legge 10 mL PBS.
- Sentrifuger 600 x g i 5 min.
- Telle celler med en Neubauer kammer.
- Teller kreftceller minst to ganger og beregne gjennomsnittet av replikat å få gjennomsnittlig antall celler samlet.
3. Direkte co kulturer av kreftceller en nd monocytter gjennomgår differensiering mot Osteoclasts
- frø kreftceller på inserts (pore diameter 0,4 µm):
- frø kreftceller i en konsentrasjon av 4000 celler per cm 2.
- Ruge på 37 ° C og 5% CO 2.
Merk: Frø kreft celler dagen etter PBMC frø for co kultur eksperimentet i 0,4 µm innsettinger.
- Vente 24 timer til at cellene å overholde.
- Sted i seeded sett kultur over mononukleære kulturer å starte co kultur (se avsnitt 1,10 protokollen).
- Endre media hver 2-3 dager med komplett α-MEM.
- Forkaste mediet med en 200-1000 µL pipette.
- Legge til 500 µL av friske medium.
Merk: Av co kultur er å forstå osteoclastogenic kraften av kreftceller, derfor GFs legges ikke til α-MEM. I hvert eksperiment co kultur, Inkluder negative kontroller (se merknad i trinn 1,10 protokollen) og positiv kontroller av osteoklast atskilte av RANKL og MCSF (ingen kreftceller). Kreftceller seeded i skivene ikke plassert over mononukleære celler brukes som en negativ kontroll av co kultur.
- Stoppe co kulturen og bruke kreftceller for nedstrøms:
- 13 dager etter PBMC frø og 12 dager etter kreft cellen seeding, plasser innsatsen på en ny plate.
- Stoppe kreft cellekultur basert på som nedstrøms analysene er utført (se diskusjon).
- På dag 14, stoppe osteoclast differensiering og fikse celler, som rapportert i trinn 1.15.
- Utføre FELLE flekker umiddelbart eller innen 14-30 dager.
Merk: Valgfri flekker: for å bekrefte at FELLE + polycarion cellene er osteoklast, forskere kan utføre ytterligere flekker å oppdage CTR, en osteoclast-spesifikk markør. Gjenkjenning av F-utgangen ringene er en annen osteoclast-spesifikk farging analysen 12 , 13 , 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En metode ble optimalisert for å enkelt skille osteoklast fra menneskelige perifert blod monocytter. Monocytt kultur ble kultivert kreftceller, bekrefter (som beskrevet i litteraturen18) at kreftceller er i stand til å opprettholde osteoclastogenesis i benmetastaser. Osteoklast differensiert fra kreftceller og GFs er vist i figur 1. En osteoclast-lignende celle er en celle med 4 eller flere kjerner og positivt for TRAP flekker (lilla celler). Akseptert cut-off av kjerner brukes til å definere en osteoclast er 318, men vi besluttet å bruk 4 for å redusere risikoen for falske positiver til et minimum.
Modellen viser at bryst kreft celler vedvarende osteoclastogenesis fordi antallet osteoklast i brønnene indusert av kreftcellene var lik som oppnås i positiv kontroll (figur 2). Som vist i figur 2A, en rekke celler også differensiert spontant i osteoklast i kontrollen negative. For å bekrefte nytten av modellen, ble systemet utfordret med en antitumor narkotika12,13. Osteoclast tallene var høyere i co oppdrettsforholdene og positiv kontroll (CTR +) prøver enn i negativ kontroll (CTR-) prøver. Osteoclast tallene betydelig redusert i nærvær av stoffet (everolimus) både co oppdrettsforholdene og positiv kontroller (CTR +). T-test ble brukt for statistiske analyser. Cellene ble talt i hver brønn. Overflate areaof osteoclast er en karakteristisk for modning og kan analyseres med åpen kildekode som ImageJ. Osteoklast fra GFs var større enn de av kreftceller (figur 2B). Behandling med en antitumor narkotika (everolimus) slått av effekten av GFs. Modellen gitt nyttig informasjon på rollen av stoffet i osteoclastogenesis hemming. Figur 2C viser at osteoclastogenesis redusert i nærvær av stoffet. Disse resultatene ble oppnådd ved co-culture-indusert osteoclastogenesis. Som forklart i delen protokoll, kan en rekke andre nedstrøms analyser utføres for å undersøke mekanismer av crosstalk og/eller analysert narkotika. Modellen oppsummert i Figur 3 er versatileand kan brukes til å studere effekten av legemidler på kreftceller, spesielt osteoklast.
Figur 1. Osteoclastogenesis analysen. Celler farget etter 14 dager i kultur. CTR-monocytter kultivert i fravær av vekstfaktorer; CTR + monocytter kultivert med RANKL og MCSF vekst faktorer; COCO, osteoklast ved co dyrking blodceller kreftceller. 10 X forstørrelse. Osteoclast-lignende celler var celler med minst 4 kjerner som var positivt å FELLE (lilla celler). Celler kvantifisert ved å telle cellene i hver brønn; 4 gjentak for hver betingelse ble utført og gjennomsnittet ble beregnet. Skala baren er 400 µm. Image zoom i nedre panel (100 X) illustrerer areal på 2 osteoklast (røde sirkler). Pilene angir osteoclast kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Effekten av everolimus på osteoclastogenesis behandling. (A) antall osteoklast etter tilstedeværelse/fravær av et stoff; 4 gjentak for hver betingelse ble utført. CTR-monocytter kultivert i fravær av vekstfaktorer; CTR + monocytter kultivert med RANKL og MCSF vekst faktorer; COCO, osteoklast ved co dyrking blodceller kreftceller. Data uttrykkes som gjennomsnittlig ± SE. Betydning ble evaluert av t-test; * p < 0,05. (B) Osteoclast areal ble beregnet av ImageJ åpen kildekode. Minst 50 osteoklast per betingelse ble målt. CTR-monocytter kultivert i fravær av vekstfaktorer; CTR + monocytter kultivert med RANKL og MCSF vekst faktorer; COCO, osteoklast ved co dyrking blodceller kreftceller. (C) bilder av cellene etter 14 dager i kulturen i fravær eller tilstedeværelse av en antitumor narkotika (everolimus). 10 X forstørrelse; skala bar er 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Co kultur modell. Ordningen av modellen og mulig nedstrøms analyser og fremtidige anvendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prekliniske i vitro modeller studere mekanismer for crosstalk mellom kreftceller og bein celler for å identifisere virkningsmekanismer bein metastasering som kan brukes til å opprette nye strategier. Vi utviklet en fullstendig menneske i vitro modell av osteoclastogenesis fra menneskelige perifert blod (Figur 3). Under optimalisering av metodikken, ble en rekke kritiske punkter identifisert og løst. Først gjelder antallet mononukleære celler frøet. Antall celler ved mikroskop greven er bare en grov kvantifisering som det er vanskelig å skille mellom lymfocytter og monocytter, sistnevnte er målcellene frøet for osteoclastogenesis eksperimentet. Vi kunne identifisere monocytter fordi lymfocytter ikke overholder plastikk substrat og dermed fleste ble slått ut på første endring av medium. Cellene ble sådd i en kompakt, som det er viktig for cellene skal kunne samhandle med hverandre for differensiering, spesielt i den andre fasen av osteoclastogenesis der før osteoklast må være tett sammen for å sikring og bli eldre osteoklast. Flere problemer oppstår når det er flere eksperimentelle forhold fordi dette krever et høyt antall celler og mye blod. En mulig løsning er å bruke buffy strøk som har en høy konsentrasjon av PBMCs, f.eks, 4 x 105-6 x 106 mononukleære celler er normalt innhentet fra et 50 mL buffy pels utvalg sammenlignet med mindre enn 1 x 105 PBMCs fra en 20 mL blodprøve.
Som blodprøver ble Hentet fra ulike frivillige, var det en viss grad av variasjon i osteoclastogenesis analysen. Dermed var det viktig å utføre hver analysen med minst 3-4 teknisk gjentak. Biologiske gjentak er også behov og som forskjellige friske blodgivere ble brukt, vi normalt beregne ikke gjennomsnittet av verdier ved ulike eksperimenter. Vi sikret at utviklingen av de ulike testene var tilsvarende og deretter valgte et eksperiment fra en av sunn givere i manuskriptet.
Vår prekliniske modell innebærer co dyrking av monocytter gjennomgår differensiering kreftceller. Som vi tidligere viste, kan kreftceller også opprettholde i vitro osteoclastogenesis12,13. Dette systemet kan brukes til å teste narkotika eller for å undersøke mekanismer for samhandling, det er mulig å utføre flere nedstrøms analyser på både kreftceller og osteoklast. Faktisk, er det mulig å utføre spredning analyser på kreftceller og gene expression analyser/Western blot analyser på både kreft celler og osteoklast13. Det ville være av interesse å forstå hvordan utskilles proteiner avvike i ulike forhold. Vår modell har en rekke fordeler, dvs., det er en fullstendig menneske modell som ikke er avhengig av murine cellelinjer, i motsetning til flere modeller rapportert i litteraturen. Modellen er også ganske robust og reproduserbare, og kan brukes til andre formål. Andre kreftcelle linjer kan for eksempel være co kulturperler med osteoklast og forskjellen i deres osteoclastogenic makt studerte. Videre kan dette systemet brukes til å vurdere andre fysiologiske eller patologisk mekanismer for å forbedre vår forståelse av bein biologi og osteoclast-mediert sykdommer som osteoporose. Andre cytokiner og cellen typer kan også være co kulturperler sammen med osteoklast avhengig av formålet med eksperimentet.
Flere nedstrøms analyser er mulig med denne modellen. Det er viktig å bestemme under designfasen av studien hva analyser utføres slik at et tilstrekkelig antall brønner kan bli sådd.
Nedstrøms analyser med Osteoclasts:
(i) Gene expression analyser. Planlegg flere brønner av osteoklast trekke ut totalt RNA, som brønnene farget for TRAP evaluering ikke er tilgjengelige for RNA utvinning. (ii) Western blot analyser. (iii) kvantifisering av osteoclast areal. Osteoclast er en parameter for osteoclast modning og kan kvantifiseres benytter åpen kildekode programvare som ImageJ.
Nedstrøms analyser kreftceller:
(i) spredning analyser som MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. (ii) Gene expression analyser. (iii) Western blot analyser.
Nedstrøms analyser med Osteoclasts og kreftceller (co kultur):
Som kreftceller og osteoklast deler samme kultur medium, kan deres samspill studeres med ELISA-analysen som analyzesthe utskillelsen av bestemte cytokiner, GFs og andre utskilles proteiner.
Utviklingen av denne modellen var avgjørende for vårt prosjekt vi planlegger å forbedre det i nær fremtid. Et stort skritt fremover vil være å skille monocytter i 3D mineralholdig kollagen stillaser å etterligne bein matrise. Det vil da være mulig å vurdere direkte osteoclast aktivitet med en bein benresorpsjon analysen. Som vi fortsetter å lære mer om de ulike rollene spilt av osteoklast i fysiologiske og patologiske behandling varierer fra ubalanse å regulere benmetastaser, gjør vår modell forskere å isolere og studere osteoklast i vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Yibin Kang for å gi SCP2 celle linjen og Cristiano Verna for redaksjonell bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D |
|
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
