Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Published: September 25, 2017 doi: 10.3791/56312

Summary

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Abstract

N-nitrosaminen zijn een gevestigde groep van milieu kankerverwekkende stoffen, waarvoor cytochroom P450 oxidatie activiteit vertonen. De aanvaarde mechanisme van metabole activering omvat vorming van α-hydroxynitrosamines die spontaan aan DNA alkylerend agentia ontleden. Accumulatie van DNA-beschadiging en de resulterende mutaties kan uiteindelijk leiden tot kanker. Nieuw bewijs geeft aan dat α-hydroxynitrosamines kan worden verder geoxideerd tot nitrosamides processively door cytochroom P450s. Omdat nitrosamides over het algemeen stabieler dan α-hydroxynitrosamines zijn en kan ook DNA alkylate, kan nitrosamides een rol spelen in carcinogenese. In dit verslag beschrijven we een algemeen protocol voor de evaluatie van de nitrosamide productie van in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen. Dit protocol maakt gebruik van een algemene aanpak van de synthese van de relevante nitrosamides en een in vitro cytochroom P450 metabolisme bepaling met behulp van vloeibare chromatografie-nanospray ionisatie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie voor de detectie. Deze methode ontdekt N′- nitrosonorcotinine als een minder belangrijke metaboliet van N′- nitrosonornicotine in de voorbeeld-studie. De methode heeft hoge gevoeligheid en selectief moeten nauwkeurige detectie van de massa. Toepassing van deze methode op een breed scala aan nitrosamine-cytochroom P450 systemen zal medebepalend zijn voor de algemene strekking van deze transformatie. Omdat cytochroom P450s polymorf zijn en in activiteit variëren, zou een beter begrip van de vorming van de nitrosamide helpen bij het individuele kanker risico-evaluatie.

Introduction

N-nitrosaminen vormen een grote klasse van kankerverwekkende stoffen gevonden in het dieet, tabaksproducten en het algemene klimaat; ze kunnen ook endogeen worden gevormd in het menselijk lichaam1. Meer dan 300 N -nitroso verbindingen zijn getest en > 90% werden geëvalueerd als kankerverwekkend in diermodellen2,3. Om te exposeren hun carcinogeniteit, moeten deze verbindingen eerst worden geactiveerd door cytochroom P450s1,2,3. Onderzoek toont aan dat cytochroom P450s gemakkelijk oxideren nitrosaminen naar α-hydroxynitrosamines (Figuur 1), die zeer reactieve verbindingen met half-leven van ~ 5 zijn s voordat spontaan ontbindend te alkyldiazohydroxides. De laatste kan DNA na het verlies van H2O en N2alkylate. De resulterende DNA adducten, als herstelde, mutaties, die als kritische onco- of tumor suppressor genen, tot kanker ontwikkeling1 leidenkunnen veroorzaken. Om deze reden veel moeite heeft zijn uitgegeven om het verwerven van een volledig begrip van de metabole routes, DNA adducten, en stroomafwaarts metabolieten van cytochroom P450 oxidatie van kankerverwekkende nitrosaminen. Deze kennis heeft potentiële toepassing in individuele kanker risico beoordeling4.

Figure 1
Figuur 1: Algemeen en voorgestelde metabolisme van nitrosaminen.
Nitrosaminen (1) zijn geoxideerd door P450s tot α-hydroxynitrosamines (2) die spontaan tot alkyldiazohydroxides (3 ontleden). Deze verbindingen kunnen binden aan DNA aan formulier die DNA adducten. Het is veronderstelde dat 2 zijn verder geoxideerd door P450s tot nitrosamides 4. Deze kunnen direct binden aan DNA aan formulier nieuwe DNA adducten of worden gehydrolyseerd tot 3 aan formulier die bekende DNA adducten. R1 en R2 vertegenwoordigen een alkyl-groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Hoewel de α-hydroxynitrosamine hypothese is stevig ondersteund door uitgebreide gegevens, zijn er enkele tegenstrijdigheden; een groot probleem is de korte halfwaardetijd van α-hydroxynitrosamines5,6. Het is bekend dat deze stoffen worden geproduceerd op het membraan van het endoplasmatisch reticulum en later nucleaire DNA alkylate. Gezien hun leven voor een paar seconden, is het puzzelen hoe deze tussenproducten overleven de vereiste reizen al het cytosol. Een hypothese is dat een deel van de α-hydroxynitrosamines processively zijn geoxideerd tot nitrosamides7,8, die zijn vrij stabiel in vergelijking9. Dit gebeurt vermoedelijk via retentie van α-hydroxynitrosamines in de cytochroom P450 actieve site. Precedent voor dit soort oxidatie gesignaleerd met nicotine10, alcoholen11en eenvoudige alkylnitrosamines12,13. Daarnaast zijn de nitrosamides direct-acting kankerverwekkende stoffen2,3. Op basis van hun reactiviteit9, worden deze verbindingen verondersteld tot DNA adducten identiek zijn aan die welke voortvloeien uit α-hydroxynitrosamines samen met nieuw, onontgonnen DNA adducten (Figuur 1). Dus deze hypothese verklaart niet alleen het vervoer via het cytosol, maar ook de vorming van DNA schade aan producten.

In deze paper wordt een algemeen protocol voor de beoordeling van het in vitro cytochroom P450-gemedieerde conversie van nitrosaminen naar nitrosamides beschreven. De eerder gerapporteerde conversie van N′- nitrosonornicotine (NNN) naar N′- nitrosonorcotinine (NNC) door cytochroom P450 2A6 is tentoongesteld als een voorbeeld14. Toepassing van dit protocol tot een brede waaier van substraat-enzym systemen zal medebepalend zijn voor het belang van nitrosamides in algemene nitrosamine metabolisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. materialen en algemene procedures

  1. Synthesize NNN 15 zoals hiervoor is beschreven. Verkrijgen van norcotinine, P450 2A6 Baculosomes NADPH regeneratie systeem, 0.5 x reactie buffer en alle andere chemicaliën of oplosmiddelen uit commerciële bronnen in het reagens rang.
  2. Record NMR spectra op een 500 MHz spectrometer. Verslag chemische verschuivingen als delen per miljoen (ppm). Gebruik van residuele oplosmiddelen pieken als interne verwijzingen voor 1 H-NMR (7.26 ppm CDCl 3) en 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3).
    Opmerking: Peak splitsen de volgende afkortingen gebruikt: s singlet, d = doublet, dd = = doublet van paren, dt = doublet van de drieling, dq = doublet van kwartetten, ddd = doublet van doublet van paren en m = multiplet.
  3. Hoge resolutie massa spectrometrie (HRMS) uitvoeren voor de geselecteerde verbindingen op een LTQ Orbitrap Velos en rapportgegevens als m/z.
  4. Gebruik polygram vooraf gecoat silicagel TLC platen (40 mm x 80 mm, 0.2 mm dik) met 254 nm fluorescerende indicator voor dunne-laag chromatografie (TLC). Visualiseren van TLC platen door UV lamp bestraling.
  5. Flash chromatografie uitvoeren op een 60 Å, 70-150 mesh silica gel met behulp van een glazen kolom van 1,5 cm x 15 cm.

2. Voorbereiding van de positieve controle nitrosamide (N -nitrosonorcotinine, NNC)

  1. droge, in een oven's nachts (16 h, ~ 140 ° C), een 25 mL, Rondbodemkolf met een magnetische roer bar. In de ochtend, cool de kolf onder een stroom van N 2 terwijl het gebruiken van een waterpijp olie te houden van de N 2 stroom stem onder een zeepbel per seconde.
    Let op: Na afkoeling geen voorzorgsmaatregelen te houden van de erlenmeyer onder N 2 zijn verplicht.
  2. In een zuurkast, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), azijnzuur-anhydride (5 mL) en azijnzuur (1 mL) toevoegen aan de afgekoelde maatkolf. Roer dit mengsel continu onder afkoeling tot 0 ° C met een water-ijsbad.
    Let op: Azijnzuur-anhydride en azijnzuur zijn bijtende.
  3. Toevoegen NaNO 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) in één gedeelte en continu roer het mengsel voor 2.5 h. reactie voortgang door TLC (100% EtOAc, R f = 0,19, zie stap 1.4).
    Opmerking: Gedurende deze tijd, het mengsel zal worden steeds geel met af en toe borrelt.
  4. Quench de reactie door het gieten van het mengsel in ijskoude H 2 O (18 mL). Onmiddellijk pak de waterige oplossing met 18 mL CH 2 Cl 2 in een 100 mL separatory trechter. Pak de waterige laag ten minste 2 extra keer met CH 2 Cl 2 (9 mL elk).
  5. De gepoolde organics meer dan ~ 100 mg MgSO 4 voor 2 min. Filter droog en het concentreren van de oplossing door roterende verdamping een ruwe, gele olie opleveren. Verwarm het waterbad tot 30 ° C tijdens verdamping te verwijderen van de resterende azijnzuur.
    Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier als de stof wordt opgelost in CH 2 Cl 2 en de oplossing die is opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C.
  6. Zuiveren de ruwe compound door kolom-chromatografie (zie stap 1.5) met behulp van silica gel als de stationaire fase en 100% EtOAc als het eluens 16.
    Let op: NNC en verwante nitrosamides moet voorzichtig behandeld worden als ze wordt aangenomen dat menselijke carcinogenen.
  7. Los van de pure stof in CDCl 3 en gebruiken van NMR (zie stap 1.2) om te bevestigen de structuur en de molarity van deze oplossing 17 bepalen. Bewaar deze oplossing in het donker bij 2-8 ° C totdat nodig.
    Opmerking: Deze oplossing zal worden gebruikt als positieve controle in de in vitro assay (stap 3.5). NMR spectra en chemische shifts zijn beschikbaar in de ondersteunende informatie.
  8. Met een zuivere oplossing van de NNC, bevestigen de nauwkeurige parent massa en product ion massa bepalen door directe infusie op een hoge resolutie massaspectrometer (HRMS) onder parameters beschreven in stap 1.3 en 4.3.
    Opmerking: Massa van het Product zal worden gebruikt voor het opsporen van dit samengestelde in de in vitro metabolisme assay (stap 4.3).

3. Een voorbeeld nitrosamine-P450 in vitro incubatie

  1. P450 2A6 Baculosomes, Vivid-NADPH-regeneratie systeem en 10 mM NADP + Stock oplossing verwijderen uit een vriezer-80 ° C en laat ze ontdooien op ijs. Eenmaal ontdooid, Verdun de Baculosomes en NADPH-regeneratie systeem 1:10 en 1:50, respectievelijk, in een enkele 1 mL-buis met 0,5 X reactie Buffer. Op dezelfde manier toevoegen 3 μL van de NADP + Stock oplossing aan 97 μL van 0,5 X reactie Buffer.
    Opmerking: NADP + is lichtgevoelig. Bewaar deze oplossing beschermd door de container te wikkelen in aluminiumfolie. Enzym oplossingen zijn gevoelig voor bevriezen-ontdooien cycli; dit te beperken tot niet meer dan 2 cycli. Bereiden aliquots als nodig is voor toekomstige experimenten.
  2. Voor elke incubatie, voeg 50 μl van enzym-oplossing (met 5 pmol P450) tot een 1 mL tube met 40 μL van 4 μM NNN oplossing gemaakt met reactie Buffer. Vooraf Incubeer dit nieuwe mengsel gedurende 2 minuten bij 37 ° C met behulp van een waterbad en voeg vervolgens 10 μL van verdunde NADP +-oplossing. Incubeer het volledige systeem voor 1-30 min op 37 ° C.
    Opmerking: Het gebruik van 5-min intervallen voor incubatie keer (bijvoorbeeld 5, 10, 15 min, etc.) zorgt voor een voldoende nitrosamide formatie tijdsverloop.
  3. Na de gewenste incubatietijd, doven door eerste toevoegen 10 μl van 3.0 N ZnSO 4 en vervolgens 10 μL van 3.0 N Ba(OH) 2. Vortex deze oplossing en een witte neerslag zal vormen. Centrifugeer het monster bij 8000 x g voor 4 min aan de neerslag pellet.
    Opmerking: De procedure moet niet onderbreken bij deze stap als de gevormde nitrosamides hebben beperkte stabiliteit in waterige oplossingen. Lange pauzes kunnen leiden tot valse negatieven.
  4. Onmiddellijk Pipetteer het supernatant en 2 μL analyseren door vloeistofchromatografie positieve nanoelectrospray-ionisatie high-resolution tandem massaspectrometrie (LC-NSI +-HRMS/MS, stappen 4.1-4.3).
  5. Voor positieve controle incubations, verdampen een aliquoot gedeelte met 100 fmol van gesynthetiseerde NNC-oplossing in een buis 1 mL onder een stroom van N-2. Deze injectieflacon, de volledige enzymsysteem uit stap 3.2 toevoegen en ga verder zoals beschreven voor stappen 3.3-3.4.
  6. Voor de negatieve controle incubations, uitvoeren van het experiment beschreven (stap 3.2-3.4) behalve vervangen de 50 μl enzym oplossing met 0,5 X reactie buffer.

4. Voorbeeld van de parameters voor de detectie van de nitrosamide door LC-NSI +-HRMS/MS

  1. voor de LC-component, de volgende scriptingregel verloop in stap 4.2 toepassen op een systeem van de UPLC met behulp van een commerciële, hand boordevol 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm opening capillaire kolom.
  2. Met behulp van 5 mM, NH 4 OAc als oplosmiddel A en acetonitril als oplosmiddel B, laadt het monster op de kolom door op 5% B op 1 l/min van 0 - 5 min en dan vertraagt het debiet aan 0,3 μl/min daarna. Voer vervolgens een verloop van 5 tot 20% B meer dan 4 min, gevolgd door een oprit naar 55% B meer dan 10 min, en vervolgens opnieuw evenwichtsinstelling tot 5% B.
  3. Voeren de LC-NSI +-HRMS/MS op een LTQ Orbitrap. Monitor voor NNC door zowel volledige scan en MS 2 fragmentatie. Volledige scannen bij een resolutie van 60.000 en haal de nauwkeurige bovenliggende massa (192.07670) op een massale tolerantie van 5 ppm. Gebruik MS 2 fragmentatie te isoleren van bovenliggende ionen (2.0 amu) en de fragment door botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) met de energie van een botsing van 25 eV, resolutie van 15.000, en scan tijd van 30 ms. Extract de nauwkeurige massa's voor product ionen van NNC (m/z 192 m/z 134.04739 en 162.07874) bij een massale tolerantie van 5 ppm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gebaseerd op het werk van witte et al. 19, norcotinine was nitrosoderivaten aan NNC netjes en in hoog rendement (80-92%) tot een standaard voor het experiment in vitro . Structurele bewijs voor een succesvolle reactie was verkregen van spectroscopische analyses, met inbegrip van 1H-NMR, 13C-NMR, GEZELLIGE en HSQC (ondersteunende informatie) samen met HRMS die bevestigd de bovenliggende massa [M + H]+ binnen 5 ppm van de theoretische waarde (Figuur 2). MS2 versnippering van NNC werd gebruikt voor het bepalen van de meest voorkomende product ion massa. De vastberaden nauwkeurige bovenliggende massa en product ion massa's werden gebruikt in de LC-NSI+- HRMS/MS methode van de in vitro -assay. Als opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C, is de NNC-oplossing stabiel gedurende ten minste 3 maanden. Aangezien dit een zeer algemene reactie, heeft het aanvraag tot een amide 2°.

Figure 2
Figuur 2: HRMS en HRMS2 spectrum van NNC.
A) nauwkeurige bovenliggende massa van NNC met een massale tolerantie van 5 ppm: berekend: [M + H]+ = 192.07675, gevonden: 192.07670. B) MS2 versnippering van m/z 192 met een breedte van de isolatie van 2.0 amu. De twee meest voorkomende product ionen zijn 134.04739 en 162.07875. Overgenomen met toestemming van Chem. Res. Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Gesynthetiseerde NNC werd gebruikt als de standaard voor de in vitro P450 metabolisme assay. Cytochroom P450 2A6 werd gebruikt omdat het is bekend dat een effectieve katalysator van NNN oxidatie20. Ook werd de concentratie NNN ingesteld op 2 μM omdat het benadert de K-m voor α-hydroxylering21. Onder de chromatografische beschreven omstandigheden, GC synthetische NNC op ~17.5 min met goed opgelost pieken in zowel de bovenliggende ion en product ion kanalen. Volgens de positieve controle, werd vorming van NNC opgemerkt in de incubations 1, 5 en 10 min.

Figure 3
Figuur 3: LC-NSI-HRMS chromatogrammen die voortvloeien uit de NNN-cytochroom P450 2A6 incubations.
Voor alle secties is het bovenste chromatogram het nauwkeurige bovenliggende volledige scan voor NNC massa is onttrokken. De middenlaag en chromatogrammen zijn twee nauwkeurige product ion massa's MS2 fragmentatie voor NNC is onttrokken. Secties zijn als volgt: NNC standaard (B), NNC-cytochroom P450 2A6 incubations met alle relevante enzymen en cofactoren met incubatie tijd van 1 minuut (B), 5 min (C) en 10 min (D). RT = retentietijd; MA = massa gebied. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

NNC niveaus waren maximale op 5 min en daalde op latere tijdstippen. Relatieve kwantificatie met behulp van synthetische NNC als een standaard maximale NNC geschatte niveaus te 10 nM. In de negatieve controle ontbreekt het P450 systeem, geen NNC-formatie was gedetecteerd (gegevens niet worden weergegeven), dus met de vermelding enzymatische conversie is vereist. Samen, dit protocol geeft direct bewijs voor de conversie van NNN naar NNC door P450 2A6, hoewel de omvang van de formatie klein is in vergelijking tot α-hydroxylatie van NNN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ophelderen van het metabolisme van nitrosaminen is een essentieel onderdeel voor het begrip van hun carcinogeniteit. Aangezien de betrokken cytochroom P450s en andere metabole enzymen polymorf zijn, verder is toepassing van deze kennis kon potentieel identificeren hoog risico personen1,4. Nieuwe data geeft aan dat verdere oxidatie van α-hydroxynitrosamines, de vermoedelijke belangrijkste metabolieten van nitrosaminen betrokken in het DNA binden, nitrosamides is mogelijk; echter, dit is niet krachtig getest in een breed scala van substraten. We hebben een protocol voor het bepalen van de omvang van processive oxidatie van nitrosaminen aan nitrosamides in vitrobeschreven. Ruime toepassing van deze methode zal medebepalend zijn voor het algemene belang van deze route van het metabolisme.

De methode wordt gestart door het opstellen van een standaard voor het nitrosamide van belang. In de studie van het voorbeeld is het NNC, een hypothetische metaboliet van de tabak carcinogeen NNN, een kankerverwekkende stof gevonden in tabak producten14,22. Zoals beschreven, verlopen nitrosation van norcotinine soepel met geen waarneembare kant-producten. Het ruwe product werd besmet door alleen het begin amide- en azijnzuur, die waren gemakkelijk verwijderd door kolom-chromatografie. Dit werd gevolgd door bevestiging van structuur door NMR en HRMS. Een voordeel van deze methode is dat het geschikt is voor vrijwel elke amide, waarmee meerdere nitrosamine/nitrosamide systemen worden onderzocht. Gebruik van NMR voor kwantificatie geeft bovendien een directe meting van molarity voor de standaardoplossing17. Hierdoor opslag van de stof onder inert voorwaarden in plaats van die meting door destructieve technieken, zoals reverse-fase HPLC. Vervolgens kunnen verschillende verdunningen worden gemaakt aan de proefopzet.

Met een positieve controle en een goed gekarakteriseerd massa fragmentatie patroon maakt de zeer gevoelige en selectieve LC-NSI+- HRMS/MS methode de ontdekking van nitrosamides in een relatief complexe matrix. Zoals aangetoond, de methode geschat een NNC concentratie van 1-10 nM of 2-20 fmol op kolom ondanks de 1000-fold overschrijding van het starten van nitrosamine, enzym en andere cofactoren. De gevoeligheid en selectiviteit van de methode zijn te wijten aan het gebruik van hoge resolutie massa monitoring, welke standaard LC-MS systemen ontbreken. Bovenliggende ion selectie met een 5-ppm massa tolerantie zorgt ervoor dat alleen verbindingen met de gewenste molecuulformule geïsoleerd. Evenzo geeft nauwkeurige detectie van de massa van de twee meest voorkomende product ionen samen met hun retentietijd extra analyt bevestiging. Vanwege dit vereist de Spectrometrie van de massa-methode dat veel parameters worden geoptimaliseerd met inbegrip van isolatie breedte, botsing energie en tijd van de scan. Het verloop van de LC kan ook worden gewijzigd ter verbetering van de gevoeligheid als co elutie met andere stoffen zal beperken de ion trap vullen met het doel nitrosamide.

In het voorbeeld studie14was NNC formatie klein. Op basis van massale gebied, NNC was ~ 4000-fold minder overvloedig dan de gehydrolyseerd producten van α-hydroxyNNN21. Hoewel dit dat nnc is een zeer kleine metaboliet van NNN aangeeft, kunnen andere systemen verschillen. Chowdhury et al. gevonden aanzienlijke, processive oxidatie van dimethylnitrosamine en diethylnitrosamine; de intermediaire nitrosamide was echter niet detecteerbaar onder hun voorwaarden12. Het is mogelijk dat de reanalyzing hun systeem door de hier beschreven techniek nitrosamide vorming kan onthullen. Ongeacht hun niveau van vorming, de hogere stabiliteit van nitrosamides in vergelijking met α-hydroxynitrosamines kan erop wijzen dat deze stoffen biologisch belang zoals ze gemakkelijker de cel moeten vervoeren.

Hoewel deze methode toepassing op de meeste nitrosamine-enzym systemen zijn zullen, zitten ziedaar sommige beperktheid. De belangrijkste is dat de methode niet kwantitatieve is. In het voorbeeld-experiment, werd vorming geschat uit de massaspectrometrische piekoppervlakte van een steekproef van de positieve controle. Voor een meer nauwkeurige meting, kan een isotoop-verdunning methode met behulp van een ionenpaar geëtiketteerd nitrosamide worden ontwikkeld. Een andere benadering zou worden tenuitvoerlegging van de strategie van een overlapping met verbindingen zoals N- acetyllysine of N- Acetylcysteïne, maar dit was niet succesvol tot nu toe in onze handen14.

Een andere beperking is de neiging van nitrosamides te hydrolyseren gemakkelijk9; monsters moeten dus afzonderlijk worden verwerkt. Dit vertraagt de workflow en voorkomt dat monsters worden verzonden naar medewerkers voor analyse. Tot slot moet opgemerkt worden dat alhoewel de cytochroom P450 2A6 en vele anderen commercieel verkrijgbaar zijn, sommige dat eiwit expressie en zuivering te verkrijgen. Bijvoorbeeld, deze bepaling werd toegepast op de cytochroom P450 2A1314, maar het is alleen beschikbaar na een strenge isolatie proces23.

Kortom, hebben wij beschreven een protocol voor het opsporen van nitrosamides als gevolg van cytochroom P450-gekatalyseerde oxidatie van nitrosaminen in vitro. Het protocol bevat een algemene synthese voor een standaard nitrosamide als positieve controle en een in vitro cytochroom P450 metabolisme kwantitatieve analyse met behulp van LC-NSI+- HRMS/MS voor detectie. In de voorbeeld-studie, werd NNC ontdekt op alle incubatie tijden variërend van 1-10 min, maar alleen als een minder belangrijke metaboliet van NNN. Toepassing van dit protocol op andere nitrosaminen zal beoordelen zijn algemeenheid en de potentiële rol van nitrosamides in nitrosamine carcinogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de subsidie geen. CA-81301 van het National Cancer Institute. Wij danken Bob Carlson voor redactionele ondersteuning, Dr. Peter Villalta en Xun Ming voor de bijstandsverlening van de Spectrometrie van de massa in de analytische biochemie gedeelde Resource van de vrijmetselaars Cancer Center, en Dr. Adam T. Zarth en Dr. Anna K. Michel voor hun waardevolle discussies en input. De analytische biochemie gedeelde Resource wordt gedeeltelijk ondersteund door nationaal kanker instituut Cancer Center ondersteuning Grant CA-77598

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Norcotinine AKoS GmbH (Steinen, Germany) CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
Acetic Anhydride Sigma-Aldrich 242845
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 431311
Barium Hydroxide Sigma-Aldrich 433373
D-Chloroform Sigma-Aldrich 151823
HPLC Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Chloride Sigma-Aldrich 34856
Sodium Nitrite Sigma-Aldrich 237213
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit Life Technologies PV6140
Zinc Sulfate Sigma-Aldrich 221376
0.5 mL tubes Fisher AB0533
100 mL round bottom flask Sigma-Aldrich Z510424
125 mL Erlenmeyer flask Sigma-Aldrich CLS4980125
125 mL Separatory Funnel Sigma-Aldrich Z261017
25 mL round bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
500 MHz NMR Spectrometer Bruker
Allegra X-22R Centrifuge Beckman-Coulter
LC vials ChromTech CTC–0957–BOND
LTQ Orbitrap Velos Thermo Scientific
Magnetic Stir bar Sigma-Aldrich Z127035
NMR tube Sigma-Aldrich Z274682
P1000, P200, and P10 pipettes Eppendorf
Rotary evaporator Sigma-Aldrich Z691410
RSLCnano UPLC system Thermo Scientific
Shaking Water Bath Fisher FSSWB15
Stir plate Sigma-Aldrich CLS6795420
PicoFrit Column New Objective PF3607515N5
Luna C18, 5 um Phenomenex 535913-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
  2. Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
  3. Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
  4. Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
  5. Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
  6. Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
  7. Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
  8. Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
  9. Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
  10. von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
  11. Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
  12. Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
  13. Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
  14. Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
  15. Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
  16. Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
  17. Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
  18. van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
  19. White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
  20. Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
  21. Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
  22. Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
  23. von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).

Tags

Celbiologie kwestie 127 Nitrosamine nitrosamide cytochroom P450 metabolisme processive oxidatie carcinogenese hoge-resolutie massa spectrometrie
Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme <em>In Vitro</em> van nitrosaminen door cytochroom P450s
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carlson, E. S., Upadhyaya, P.,More

Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s. J. Vis. Exp. (127), e56312, doi:10.3791/56312 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter