Summary
Α-idrossilazione di nitrosamine cancerogene dal citocromo P450s è accettata via metabolica che produce intermedi danneggiano il DNA, che causano mutazioni. Tuttavia, nuovi dati indicano ulteriore ossidazione a nitrosamides può verificarsi. Descriviamo un generale metodo per la rilevazione nitrosamides prodotta da in vitro metabolismo del citocromo P450-catalizzata di nitrosammine.
Abstract
N-nitrosammine sono un gruppo ben consolidato degli agenti cancerogeni ambientali, che richiedono l'ossidazione del citocromo P450 per esibire l'attività. Il meccanismo di attivazione metabolica accettato coinvolge la formazione di α-hydroxynitrosamines che si decompongono spontaneamente agli agenti alchilanti del DNA. Accumulazione di danno del DNA e le mutazioni risultante in ultima analisi può portare al cancro. La nuova prova indica che α-hydroxynitrosamines può essere ulteriormente ossidata a nitrosamides processively dal citocromo P450s. Poiché nitrosamides sono generalmente più stabili di α-hydroxynitrosamines e anche possibile alchilare il DNA, nitrosamides possono svolgere un ruolo nella carcinogenesi. In questo rapporto, descriviamo un protocollo generale per valutare la produzione di nitrosamide da metabolismo P450-catalizzata-citocromo in vitro di nitrosammine. Questo protocollo utilizza un approccio generale alla sintesi del nitrosamides pertinenti e un in vitro del citocromo P450 metabolismo test utilizzando la spettrometria di massa tandem di cromatografia a fase mobile liquida-nanospray ionizzazione-alta risoluzione per il rilevamento. Questo metodo ha rilevato N′- nitrosonorcotinine come un metabolita secondario di N′- nitrosonornicotine nello studio di esempio. Il metodo ha alta sensibilità e selettivamente dovuto accurata rilevazione di masse. Applicazione di questo metodo per una vasta gamma di sistemi di nitrosamina-citocromo P450 aiuterà a determinare la generalità di questa trasformazione. Perché citocromo P450s sono polimorfici e variano in attività, una migliore comprensione della formazione di nitrosamide potrebbe aiutare nella valutazione del rischio di cancro individuali.
Introduction
N-nitrosammine sono una vasta classe di agenti cancerogeni trovati nella dieta, prodotti del tabacco e l'ambiente in generale; si possono anche formare in modo endogeno nel corpo umano1. Più di 300 N -nitroso composti sono stati testati e > 90% sono stati valutati come cancerogeni in modelli animali2,3. Per esibire la loro cancerogenicità, questi composti devono prima essere attivati dal citocromo P450s1,2,3. La ricerca dimostra che il citocromo P450s ossidare prontamente nitrosammine di α-hydroxynitrosamines (Figura 1), che sono composti altamente reattivi con emivita di ~ 5 s prima spontaneamente decomponendosi in alkyldiazohydroxides. Quest'ultimo può alchilazione del DNA dopo la perdita di H2O e N2. Addotti del DNA risultante, se trafficatissime, può causare mutazioni che, in caso di critica onco - o geni oncosoppressori, portano al cancro di sviluppo1. Per questo motivo, molto sforzo è stato consumato per acquisire una piena comprensione delle vie metaboliche, complessi del DNA e metaboliti a valle di ossidazione del citocromo P450 di nitrosamine cancerogene. Questa conoscenza ha potenziale applicazione individuale cancro rischio valutazione4.
Figura 1: Generale e metabolismo proposto di nitrosammine.
Nitrosammine (1) sono ossidati da P450s a α-hydroxynitrosamines (2) che si decompongono spontaneamente a alkyldiazohydroxides (3). Questi composti possono legare al DNA per formare che complessi del DNA. È supposto che 2 sono ulteriormente ossidati da P450s a nitrosamides 4. Questi possibile associare direttamente al DNA a forma novella del DNA addotti o essere idrolizzata a 3 per formare che complessi del DNA noto. R1 R2 rappresentano qualsiasi gruppo alchilico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Anche se l'ipotesi di α-hydroxynitrosamine è solidamente sostenuto da numerosi dati, ci sono alcune incoerenze; una maggiore è la breve emivita di α-hydroxynitrosamines5,6. È noto che questi composti sono prodotti alla membrana del reticolo endoplasmatico e successivamente alchilazione del DNA nucleare. Dato il loro ciclo di vita di pochi secondi, esso è sconcertante come questi intermedi sopravvivono la corsa richiesta però nel citosol. Un'ipotesi è che una parte di α-hydroxynitrosamines processively sono ossidati a nitrosamides7,8, che sono abbastanza stabili in confronto9. Presumibilmente questo avverrebbe attraverso una trattenuta di α-hydroxynitrosamines nel sito attivo del citocromo P450. Precedente per questo tipo di ossidazione è stato visto con nicotina10, alcoli11e semplice alkylnitrosamines12,13. Inoltre, nitrosamides sono ad azione diretta agenti cancerogeni2,3. Basato su loro reattività9, questi composti sono creduti per produrre DNA addotti identici a quelli derivanti da α-hydroxynitrosamines insieme a nuovi, complessi inesplorate del DNA (Figura 1). Così, questa ipotesi non solo spiega il trasporto attraverso il citosol, ma anche la formazione di DNA danneggiare i prodotti.
In questa carta, un protocollo generale per la valutazione in vitro del citocromo P450-mediata conversione di nitrosammine in nitrosamides è descritto. La conversione precedentemente segnalata di N′- nitrosonornicotine (NNN) N′- nitrosonorcotinine (NNC) di citocromo P450 2A6 viene presentata come un esempio14. Applicazione del presente protocollo ad una vasta gamma di sistemi di enzima-substrato aiuterà a determinare l'importanza di nitrosamides nel metabolismo di nitrosamina complessiva.
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Protocol
1. materiali e procedure generali
- Synthesize NNN come precedentemente descritto 15. Ottenere norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema di rigenerazione NADPH, tampone di reazione 0,5 x e tutte le altre sostanze chimiche o solventi da fonti commerciali in grado reagente.
- Gli spettri RMN record su uno spettrometro di 500 MHz. Prodotto chimico relazione sposta come parti per milione (ppm). Utilizzare picchi di solventi residui come riferimenti interni per 1 H-NMR (7,26 ppm CDCl 3) e 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3).
Nota: Peak spaccare usate le seguenti abbreviazioni: s = singoletto, d = doppietto, dd = doppietto di doppietti, dt = doppietto di terzine, dq = doppietto di quartetti, ddd = doppietto di doppietto di doppietti e m = multipletto. - Eseguire la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) per composti selezionati su un LTQ Orbitrap Velos e dei dati del report come m/z.
- Uso polygram prerivestiti lastre di gel di silice TLC (40 mm x 80 mm, spessore di 0,2 mm) con indicatore fluorescente di 254 nm per cromatografia di strato sottile (TLC). Visualizzare lastre TLC di irradiazione UV Lampada.
- Eseguire cromatografia flash su un 60 Å, gel di silice di 70-150 mesh utilizzando una colonna di vetro 1,5 cm x 15 cm.
2. Preparazione del controllo positivo nitrosamide (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- asciutto, in un forno durante la notte (16h, ~ 140 ° C), un 25 mL, pallone a sfondo sferico contenente un'ancoretta magnetica. Al mattino, raffreddare il pallone sotto un flusso di N 2 durante l'utilizzo di una vasca di gorgogliamento dell'olio per mantenere il flusso di 2 N valuta sotto una bolla al secondo.
Nota: Dopo il raffreddamento, non per tenere il pallone N. 2 sono necessarie precauzioni. - In una cappa, aggiungere norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), l'anidride acetica (5 mL) e acido acetico (1 mL) nel matraccio raffreddato. Mescolate il composto continuamente durante il raffreddamento a 0 ° C con un bagno di ghiaccio d'acqua.
Attenzione: L'anidride acetica e acido acetico sono corrosivi. - Aggiungere NaNO 2 (33,3 mg, 0,483 mmol) in una porzione e mescolare continuamente per 2,5 h. monitorare l'avanzamento della reazione di TLC (100% EtOAc, R f = 0,19, vedi punto 1.4).
Nota: Oltre questo orario, il composto diventerà sempre più giallo con occasionali bubbling. - Placare la reazione versando il composto in ghiacciata H 2 O (18ml). Estrarre immediatamente la soluzione acquosa con 18 mL di CH 2 Cl 2 in un imbuto separatore mL 100. Estrarre lo strato acquoso almeno 2 volte con CH 2 Cl 2 (9 mL ciascuno).
- Asciugare i prodotti organici riuniti più di ~ 100 mg di MgSO 4 per 2 min filtro e concentrare la soluzione mediante evaporazione rotativa per produrre un olio grezzo, giallo. Riscaldare il bagno di acqua a 30 ° C durante l'evaporazione per rimuovere il residuo di acido acetico.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui se il composto è dissolto in CH 2 Cl 2 e la soluzione conservati al buio a 2-8 ° C. - Purificare il grezzo composto da cromatografia a colonna (Vedi punto 1.5) utilizzando il gel di silice come fase stazionaria e 100% EtOAc come l' eluente 16.
Attenzione: NNC e nitrosamides correlate devono essere maneggiati con cura come essi vengono considerati come agenti cancerogeni umani. - Sciogliere il composto puro in CDCl 3 e utilizzare NMR (Vedi punto 1.2) per confermare la struttura e determinare la molarità di questa soluzione 17. Conservare questa soluzione al buio a 2-8 ° C fino a quando necessario.
Nota: Questa soluzione sarà utilizzata come controllo positivo nel test in vitro (punto 3.5). Gli spettri RMN e gli spostamenti chimici sono disponibili nelle informazioni di supporto. - Con una soluzione pura di NNC, confermare il preciso padre massa e determinare le masse di ioni prodotto da infusione diretta su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (HRMS) sotto i parametri descritti ai punti 1.3 e 4.3.
Nota: Masse di prodotto verranno utilizzate per la rilevazione di questo composto in vitro test metabolismo (punto 4.3).
3. Una nitrosamina-P450 in vitro incubazione di esempio
- rimuovere P450 2A6 Baculosomes, sistema di Vivid-NADPH-rigenerazione e 10mm NADP + soluzione Stock da un congelatore a-80 ° C e lasciarli scongelare su ghiaccio. Una volta scongelato, diluire il Baculosomes e la NADPH-rigenerazione sistema 1:10 e 01:50, rispettivamente, in un tubo singolo 1 mL con reazione di 0,5 X Buffer. Allo stesso modo, aggiungere 3 μL di NADP + soluzione Stock a 97 μL di 0,5 X tampone di reazione.
Nota: NADP + è sensibile alla luce. Mantenere questa soluzione protetta avvolgendo il contenitore in carta stagnola. Soluzioni enzimatiche sono sensibile ai cicli di gelo-disgelo; limitare questo per non più di 2 cicli. Preparare aliquote come necessarie per gli esperimenti futuri. - Per ciascuna incubazione aggiungere 50 μL di soluzione di enzima (contenente 5 pmol P450) ad un 1 mL tubo contenente 40 μL di soluzione NNN μM 4 fatta con tampone di reazione. Pre-Incubare questa nuova miscela per 2 min a 37 ° C, usando un bagno di acqua e aggiungere 10 μL di soluzione diluita di NADP +. Incubare il sistema completo per 1-30 min a 37 ° C.
Nota: Utilizzando intervalli di 5 min per tempi di incubazione (per esempio 5, 10, 15 min, ecc.) fornirà un sufficiente corso di tempo di formazione nitrosamide. - Dopo il tempo di incubazione desiderato, placare prima aggiungere 10 μl di 3.0 ZnSO N 4 e poi 10 μL di 3.0 N BA (Oh) 2. Vortice formeranno questa soluzione e un precipitato bianco. Centrifugare il campione a 8000 x g per 4 min a pellet il precipitato.
Nota: La procedura non deve sospendere in questo passaggio come il formato nitrosamides hanno limitato la stabilità in soluzione acquose. Lunghe pause possono causare falsi negativi. - Immediatamente Pipettare il surnatante e analizzare 2 μL di spettrometria tandem massa ad alta risoluzione nanoelectrospray-ionizzazione positiva di cromatografia liquida (LC-NSI +-HRMS/MS, punti 4.1-4.3).
- Per le incubazioni di controllo positivo, evaporare una parte aliquota contenente 100 fmol di soluzione NNC sintetizzato in una provetta 1 mL sotto un flusso di N 2. Questo flacone, aggiungere il sistema enzimatico completo passaggio 3.2 e procedere come descritto per la procedura 3.3-3.4.
- Per le incubazioni di controllo negativo, eseguire l'esperimento come descritti (passaggi 3.2-3.4) tranne sostituire il 50 μL di soluzione enzimatica con 0,5 X tampone di reazione.
4. Parametri di esempio per il rilevamento di nitrosamide di LC-NSI +-HRMS/MS
- per the LC componente, applicare la sfumatura di multi-step seguente nel passaggio 4.2 a un sistema UPLC utilizzando un commerciale, confezionate 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, colonna capillare orifizio di 15 μm.
- Utilizzando 5 mM NH 4 OAc come A solvente e MeCN come solvente B, caricare il campione sulla colonna eseguendo al 5% B al punto 1 μL/min da 0 - 5 min e quindi rallentare la velocità di flusso a 0,3 µ l/min in seguito. Successivamente, eseguire una sfumatura dal 5 al 20% B in 4 minuti, seguita da una rampa al 55% B oltre 10 minuti e poi riequilibrio al 5% B.
- Eseguire il LC-NSI +-HRMS/MS su un LTQ Orbitrap. Monitor per NNC da scansione completa e frammentazione di 2 MS. Eseguire scansione completa con una risoluzione di 60.000 ed estrarre la massa accurata padre (192.07670) a una tolleranza di massa di 5 ppm. Uso MS 2 frammentazione per isolare ioni genitore (2,0 amu) e frammento di dissociazione indotta da collisione (CID) con un'energia di collisione di 25 eV, risoluzione di 15.000 e tempo di 30 ms di scansione estrarre le masse accurate per gli ioni prodotto di NNC (m/z 192 m/z 134.04739 e 162.07874) a una tolleranza di massa di 5ppm.
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Representative Results
Basato sul lavoro di bianco et al. 19, norcotinine era nitrosi a NNC in modo pulito e nell'alto rendimento (80-92%) per produrre uno standard per l'esperimento in vitro . Prove strutturali per una reazione di successo è stata ottenuta da analisi spettroscopiche compreso 1H-NMR, 13C-NMR, COSY e HSQC (supporto informazioni) insieme a HRMS che ha confermato la massa di padre [M + H]+ all'interno di 5 ppm della valore teorico (Figura 2). Frammentazione di2 MS di NNC era utilizzato per determinare le masse di ioni prodotto più abbondante. Lo ione di massa e prodotto determinato genitore precise masse sono state utilizzate nel metodo LC-NSI+- HRMS/MS del saggio in vitro . Se conservati al buio a 2-8 ° C, la soluzione NNC è stabile per almeno 3 mesi. Si tratta di una reazione molto generale, ha applicazione per qualsiasi ammide di 2°.
Figura 2: HRMS e HRMS2 spettro di NNC.
A) massa accurate padre di NNC con una tolleranza di massa di 5 ppm: calcolato: [M + H]+ = 192.07675, Found: 192.07670. B) MS2 frammentazione di m/z 192 con una larghezza di isolamento di 2,0 amu. I due ioni prodotto più abbondanti sono 134.04739 e 162.07875. Ristampato con il permesso da Chem Res Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
NNC sintetizzato è stata utilizzata come standard per il dosaggio di metabolismo in vitro P450. Citocromo P450 2A6 è stato utilizzato perché è noto per essere un efficace catalizzatore di ossidazione NNN20. Allo stesso modo, la concentrazione di NNN è stata impostata a 2 μM come si approssima Km per α-idrossilazione21. Sotto le condizioni cromatografiche descritte, sintetico NNC eluisce a ~17.5 min con picchi ben risolti dello ione genitore sia agli ioni prodotto canali. In conformità con il controllo positivo, formazione di NNC è stata notata nelle incubazioni di 1, 5 e 10 min.
Figura 3: Cromatogrammi di LC-NSI-HRMS derivanti dalle incubazioni 2A6 NNN-citocromo P450.
Per tutte le sezioni, il cromatogramma superiore è il genitore accurato massa Estratto dalla scansione completa per NNC. I cromatogrammi centro e in basso sono due masse di ioni prodotto accurato estratte dalla frammentazione di2 MS per NNC. Le sezioni sono come segue: NNC standard (A), NNC-citocromo P450 2A6 incubazioni contenente tutte le pertinenti enzimi e cofattori con tempi di incubazione di 1 min (B), 5 min (C) e 10 min (D). RT = tempo di ritenzione; MA = massa Area. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
NNC livelli erano massimi a 5 min e diminuito a intervalli di tempo successivi. Quantificazione relativa utilizzando NNC sintetico come standard stimata massima NNC livelli per essere 10 nM. Nel controllo negativo manca il sistema P450, nessuna formazione di NNC era rilevato (dati non mostrati), così indicando conversione enzimatica è stato richiesto. Insieme, questo protocollo indica una prova diretta per la conversione di NNN NNC da P450 2A6, anche se l'entità della formazione è minore rispetto al α-idrossilazione di NNN.
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Discussion
Delucidamento il metabolismo di nitrosammine è un componente critico per comprendere la loro cancerogenicità. Poiché il coinvolto citocromo P450s e altri enzimi metabolici sono polimorfici, ulteriore applicazione di questa conoscenza potrebbe potenzialmente identificare gli individui ad alto rischio1,4. Nuovi dati indica che l'ulteriore ossidazione di α-hydroxynitrosamines, presunti principali metaboliti di nitrosammine coinvolti nel legame al DNA, a nitrosamides è possibili; Tuttavia, questo non è stato robustamente testato attraverso una vasta gamma di substrati. Abbiamo descritto un protocollo per la determinazione del limite di processive ossidazione di nitrosammine per nitrosamides in vitro. Ampia applicazione di questo metodo per determinare l'importanza complessiva di questa via di metabolismo.
Il metodo inizia con la preparazione standard per la nitrosamide di interesse. Nello studio di esempio, è NNC, un metabolita ipotizzato dell'agente cancerogeno tabacco NNN, un agente cancerogeno trovato in tabacco prodotti14,22. Come descritto, nitrosazione di norcotinine proceduto senza intoppi con nessun lato discernable prodotti. Il prodotto grezzo è stato contaminato da solo la partenza dell'ammide e acido acetico, che facilmente sono stati rimossi da cromatografia a colonna. Ciò è stata seguita da conferma della struttura di NMR e HRMS. Un vantaggio di questo metodo è che è adatto per praticamente qualsiasi ammide, che consente a più sistemi di nitrosamina/nitrosamide essere studiato. Inoltre, uso di NMR per quantificazione dà una misura diretta della molarità per la soluzione standard17. Questo consente la memorizzazione del composto sotto condizioni inerti piuttosto che misura che necessitano di tecniche distruttive come l'HPLC in fase inversa. Poi varie diluizioni possono essere fatto per soddisfare la progettazione dell'esperimento.
Con un controllo positivo e un modello di frammentazione di massa ben caratterizzati, il metodo di - HRMS/MS LC-NSI+altamente sensibile e selettivo consente rilevamento di nitrosamides in una matrice relativamente complessa. Come illustrato, il metodo di stima una concentrazione di NNC di 1-10 nM o 2-20 fmol in colonna nonostante il volta 1000 in eccesso a partire nitrosamina, enzima e altri cofattori. La sensibilità e la selettività del metodo sono dovute all'uso di massa ad alta risoluzione di monitoraggio, quali mancanza di sistemi di LC-MS standard. Selezione di ioni del padre con una tolleranza di 5 ppm di massa assicura che solo composti con la formula molecolare desiderata sono isolati. Allo stesso modo, accurata rilevazione di masse di due ioni più abbondanti prodotto insieme a loro tempo di ritenzione dà conferma ulteriori analita. Per questo motivo, il metodo di spettrometria di massa richiede che molti parametri sono ottimizzati compreso isolamento larghezza, energia di collisione e tempo di scansione. Il gradiente di LC possa anche essere modificato per migliorare la sensibilità come co-eluizione con altre sostanze limiterà la presa dello ione di riempimento con il nitrosamide di destinazione.
Nel esempio Studio14, formazione NNC era minore. Basata su massa area, NNC era ~ 4000-fold meno abbondanti rispetto ai prodotti idrolizzati di α-hydroxyNNN21. Se questo indica che NNC è un metabolita molto minore di NNN, altri sistemi possono differire. Chowdhury et al. Trovati considerevole, processive ossidazione di dimetilnitrosammina e dietilnitrosammina; Tuttavia, l'intermedio di nitrosamide era inosservabile sotto loro circostanze12. È possibile che la nuova analisi il loro sistema della tecnica qui descritta potrebbe rivelare nitrosamide formazione. Indipendentemente dal loro livello di formazione, la più alta stabilità di nitrosamides rispetto al α-hydroxynitrosamines potrebbe indicare che questi composti hanno importanza biologica come dovrebbe trasportano più facilmente la cella.
Anche se questo metodo sarà applicabile alla maggior parte dei sistemi nitrosamina-enzima, esistono alcune limitazioni. Quello più significativo è che il metodo non è quantitativo. L'esperimento di esempio, formazione è stata stimata dalla zona di picco di spettrometria di massa di un campione di controllo positivo. Per una misurazione più accurata, potrebbe essere sviluppato un metodo di diluizione dell'isotopo che utilizza un nitrosamide isotopicamente etichettato. Un altro approccio sarebbe essere attuazione di una strategia di intrappolamento con composti come N- acetyllysine o N- acetilcisteina, ma questo non ebbe successo fino ad oggi nelle nostre mani14.
Un'altra limitazione è la tendenza di nitrosamides a idrolizzano facilmente9; così i campioni devono essere trattati singolarmente. Ciò rallenta il flusso di lavoro e impedisce l'invio ai collaboratori per l'analisi di campioni. Infine, si deve osservare che sebbene citocromo P450 2A6 e molti altri sono disponibili in commercio, alcuni richiedono l'espressione della proteina e purificazione per ottenere. Ad esempio, questo test è stato applicato al citocromo P450 2A1314, ma è disponibile solo dopo un rigoroso isolamento processo23.
In sintesi, abbiamo descritto un protocollo per la rilevazione nitrosamides derivanti dall'ossidazione di citocromo P450-catalizzata di nitrosammine in vitro. Il protocollo comprende una sintesi generale per una nitrosamide standard come controllo positivo e una in vitro del citocromo P450 metabolismo analisi usando LC-NSI+- HRMS/MS per il rilevamento. Nello studio di esempio, NNC rilevato all'incubazione di tutti i tempi che vanno da 1-10 min, ma solo come un metabolita secondario di NNN. Applicazione del presente protocollo alle altre nitrosammine valuterà la sua generalità ed il ruolo potenziale di nitrosamides nella carcinogenesi nitrosammina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da grant no. CA-81301 dal National Cancer Institute. Ringraziamo Bob Carlson per assistenza editoriale, Dr. Peter Villalta e Xun Ming per assistenza di spettrometria di massa nella analitica biochimica ha condiviso risorsa del Masonic Cancer Center e Dr. Adam T. Zarth Dr. Anna K. Michel per le loro discussioni importanti e di input. La risorsa condivisa biochimica analitica è parzialmente supportata da nazionale Cancer Institute cancro centro supporto Grant CA-77598
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
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