Summary
Α-hydroxylering av cancerogena nitrosaminer genom cytokrom P450s är den accepterade metaboliska smittvägen som producerar DNA-skadande intermediärer, som orsakar mutationer. Nya data tyder dock ytterligare oxidation till nitrosamides kan uppstå. Vi beskriver en allmän metod för att upptäcka nitrosamides produceras från in vitro- cytokrom P450-katalyseras metabolismen av nitrosaminer.
Abstract
N-nitrosaminer är en väletablerad grupp av miljömässiga cancerframkallande ämnen, som kräver cytokrom P450-oxidation till uppvisar aktivitet. Accepterade mekanismen av metabolisk aktivering innebär bildandet av α-hydroxynitrosamines som spontant sönderfaller till DNA alkylerande medel. Ansamling av DNA-skador och de resulterande mutationerna kan i slutändan leda till cancer. Nya uppgifter tyder på att α-hydroxynitrosamines kan ytterligare oxideras till nitrosamides processively av cytokrom P450s. Eftersom nitrosamides är generellt mer stabila än α-hydroxynitrosamines och också kan alkylera DNA, kan nitrosamides spela en roll i carcinogenes. I den här rapporten beskriver vi ett allmänt protokoll för att utvärdera nitrosamide produktion från in vitro- cytokrom P450-katalyseras metabolismen av nitrosaminer. Detta protokoll använder tredjeparts en generell strategi för syntesen av de relevanta nitrosamides och ett in vitro- cytokrom P450-metabolism test med liquid chromatography-nanospray jonisering-hög upplösning tandem masspektrometri för upptäckt. Denna metod upptäckt N′- nitrosonorcotinine som en mindre metabolit av N′- nitrosonornicotine i studien exempel. Metoden har hög känslighet och selektivt på grund av korrekt massa upptäckt. Tillämpningen av denna metod på en mängd olika nitrosamin-cytokrom P450-system kommer att avgöra allmängiltigheten av denna omvandling. Eftersom cytokrom P450s är polymorfa och variera i aktivitet, kunde en bättre förståelse av nitrosamide bildande stöd i enskilda cancer riskbedömning.
Introduction
N-nitrosaminer är en stor klass av cancerframkallande ämnen i kosten, tobaksvaror och den allmänna miljön; de kan också bildas endogent i den mänskliga kropp1. Mer än 300 N -nitroso föreningar har testats och > 90% utvärderades som cancerframkallande i djur modeller2,3. Att ställa ut deras cancerogenitet, måste dessa föreningar först aktiveras av cytokrom P450s1,2,3. Forskning visar att cytokrom P450s lätt oxidera nitrosaminer till α-hydroxynitrosamines (figur 1), som är mycket reaktiva föreningar med halveringstider på ~ 5 s innan spontant förmultna till alkyldiazohydroxides. Den senare kan alkylera DNA efter förlusten av H2O och N2. Den resulterande DNA addukter, om utan reparation, kan orsaka mutationer som om i kritiska onco- eller tumörsuppressorgener, leda till cancer utveckling1. Av den anledningen mycket möda har lagts ner på att förvärva en full förståelse av metaboliska vägar, DNA addukter, och nedströms metaboliter av cytokrom P450-oxidation av cancerogena nitrosaminer. Denna kunskap har potentiella tillämpning i enskilda cancer risk bedömning4.
Figur 1: General och föreslagna metabolism av nitrosaminer.
Nitrosaminer (1) oxideras av P450s till α-hydroxynitrosamines (2) som spontant sönderfaller till alkyldiazohydroxides (3). Dessa föreningar kan binda till DNA att bilda DNA addukter. Det är en hypotes om att 2 oxideras vidare av P450s till nitrosamides 4. Dessa kan direkt binda till DNA att bilda nya DNA addukter eller vara hydrolyseras till 3 till formuläret kända DNA addukter. R1 och R2 representerar någon alkylgrupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Även om α-hydroxynitrosamine hypotesen är stabilt stöds av omfattande data, finns det några motsägelser; en större är den korta halveringstiden av α-hydroxynitrosamines5,6. Det är känt att dessa föreningar produceras på endoplasmatiska retiklet membranet och senare Alkylatbensin nuclear DNA. Med tanke på sin livstid för några sekunder, det förbryllande hur dessa intermediärer överleva krävs resa men cytosolen. En hypotes är att en del av den α-hydroxynitrosamines processively oxideras till nitrosamides7,8, som är ganska stabil i jämförelse9. Detta skulle förmodligen ske via lagring av α-hydroxynitrosamines i den cytokrom P450-aktiva platsen. Prejudikat för denna typ av oxidation har setts med nikotin10, alkoholer11och enkel alkylnitrosamines12,13. Nitrosamides är dessutom direktverkande carcinogener2,3. Baserat på deras reaktivitet9, tros dessa föreningar producera DNA addukter identiska med dem som följer av α-hydroxynitrosamines tillsammans med nya, outforskade DNA addukter (figur 1). Således denna hypotes förklarar inte bara transport genom cytosolen, men också bildandet av DNA skada produkter.
I den här artikeln beskrivs ett allmänt protokoll för bedömning av in vitro- cytokrom P450-medierad konvertering av nitrosaminer till nitrosamides. Tidigare rapporterade omvandlingen av N′- nitrosonornicotine (NNN) till N′- nitrosonorcotinine (NNC) av cytokrom P450 2A6 är utställningsmonter som ett exempel14. Tillämpningen av detta protokoll till ett brett utbud av substrat-enzymsystem kommer att avgöra betydelsen av nitrosamides i övergripande nitrosamin metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. material och allmänna förfaranden
- Synthesize NNN beskrivs som tidigare 15. Få norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH regenereringssystem, 0,5 x reaktion buffert och alla andra kemikalier eller lösningsmedel från kommersiella källor i reagens klass.
- Posten NMR spectra på en 500 MHz spektrometer. Rapport kemiska förskjutningar som delar per miljon (ppm). Använda resterande lösningsmedel toppar som interna referenser för 1 H-NMR (7,26 ppm CDCl 3) och 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3).
Obs: Peak uppdelning används följande förkortningar: s = linne, d = doublet, dd = dublett av dubletter, dt = doublet trillingar, dq = dublett av kvartetter, ddd = dublett av doublet midjekort jacka, och m = multipleten. - Utföra hög upplösning masspektrometri (HRMS) för utvalda föreningar på en LTQ Orbitrap Velos och rapportdata som m/z.
- Användning polygram belagd före kiselgel TLC plattor (40 mm x 80 mm, 0,2 mm tjock) med 254 nm fluorescerande indikator för tunnskiktskromatografi (TK). Visualisera TLC plattor av UV lamp irradiation.
- Utför flash kromatografi på en 60 Å, 70-150 mesh kiselgel använder en glaskolonn 1,5 x 15 cm.
2. Beredning av nitrosamide positiv kontroll (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- torr, i ugn över natten (16 h, ~ 140 ° C), en 25 mL, runda-botten kolv som innehåller magnetiska rör bar. På morgonen, cool Betygsätt kolven under en ström av N 2 medan du använder en olja bubbelflaskan för att hålla N 2 flödet under en bubbla per sekund.
Obs: Efter kylning inga försiktighetsåtgärder att hålla kolven under N 2 krävs. - i ett dragskåp, lägga till norcotinine (31,8 mg, 0.196 mmol), ättiksyraanhydrid (5 mL) och ättiksyra (1 mL) kyls kolven. Rör ner denna blandning kontinuerligt medan nedkylning till 0 ° C med en vatten-isbad.
Varning: Ättiksyraanhydrid och ättiksyra är frätande. - Lägg till NaNO 2 (33,3 mg, 0.483 mmol) i en portion och kontinuerligt rör blandningen för 2,5 h. Monitor reaktion framsteg av TLC (100% EtOAc, R f = 0,19, se steg 1.4).
Obs: Under denna tid, blandningen kommer att bli alltmer gul med enstaka bubblande. - Släcka reaktionen genom att hälla blandningen i iskall H 2 O (18 mL). Omedelbart extrahera en vattenlösning med 18 mL CH 2 Cl 2 i en 100 mL separatory tratt. Extrahera vattenskiktet minst 2 ytterligare gånger med CH 2 Cl 2 (9 mL vardera).
- Torka den poolade organics över ~ 100 mg av MgSO 4 för 2 min. Filter och koncentrera lösningen genom roterande avdunstning till ger en grov, gul olja. Värma vattenbadet till 30 ° C under avdunstning att ta bort kvarvarande ättiksyra.
Obs: Protokollet kan pausas här om föreningen är upplöst i CH 2 Cl 2 och lösningen förvaras i mörker vid 2-8 ° C. - Rena råa föreningen genom kolonnkromatografi (se steg 1,5) med kiselgel som stationär fas och 100% EtOAc som eluent 16.
Varning: NNC och relaterade nitrosamides bör hanteras med försiktighet eftersom de antas vara cancerframkallande. - Lös den ren föreningen i CDCl 3 och använda NMR (se steg 1.2) att bekräfta struktur och bestämma molariteten av denna lösning 17. Här förvaras i mörker vid 2-8 ° C tills behövs.
Obs: Denna lösning kommer att användas som den positiva kontrollen i in vitro- analys (steg 3.5). NMR-spektra och kemiska förskjutningarna är tillgängliga i den stödjande Information. - Med en ren NNC lösning, bekräfta den korrekta förälder massa och fastställa produkt ion massorna genom direkt infusion på en högupplöst masspektrometer (HRMS) enligt parametrar som beskrivs i steg 1.3 och 4.3.
Obs: Produkten massorna kommer att användas för att upptäcka denna förening i in vitro- ämnesomsättning analys (steg 4,3).
3. Ett exempel nitrosamin-P450 i vitro inkubation
- bort P450 2A6 Baculosomes, Vivid-NADPH-regenereringssystem och 10 mM NADP + lager lösning från-80 ° C frys och låt dem Tina på is. När tinas, späd den Baculosomes och NADPH-regenerering System 1:10 och 1:50, respektive till ett enda 1 mL provrör med 0,5 X reaktion buffert. Likaså, tillsätt 3 μL av NADP + lager lösning till 97 μL av 0,5 X reaktion buffert.
Obs: NADP + är ljuskänsligt. Förvara lösningen skyddas av inslagning dess behållare i aluminiumfolie. Enzym lösningar är känsliga för frysning-tining cykler; begränsa detta till mer än 2 cykler. Förbereda alikvoter som behövs för framtida experiment. - För varje inkubation, tillsätt 50 μL av enzymet lösning (innehållande 5 pmol P450) till 1 mL tub innehållande 40 μl 4 μM NNN lösning gjord med reaktion buffert. Preinkubera denna nya blandning under 2 minuter vid 37 ° C med hjälp av vattenbad och sedan tillsätt 10 μL utspätt NADP + lösning. Inkubera hela systemet för 1-30 min vid 37 ° C.
Obs: Med 5 minuters intervall för inkubationstider (t.ex. 5, 10, 15 min, etc.) kommer att ge en tillräcklig nitrosamide bildning tid kurs. - Efter önskad inkubationstiden, släcka av första lägga 10 μl av 3.0 N ZnSO 4 och därefter 10 μL av 3.0 N Ba(OH) 2. Vortex denna lösning och en vit fällning bildar. Centrifugera provet vid 8000 x g i 4 min till pellet fällningen.
Obs: Förfarandet måste inte pausa i detta steg som de bildade nitrosamides har begränsat stabilitet i vattenlösningar. Långa pauser kan resultera i falska negativa. - Omedelbart Pipettera supernatanten och analysera 2 μL genom vätskekromatografi positiva nanoelectrospray-jonisering högupplösta tandem masspektrometri (LC-NSI +-HRMS/MS, steg 4.1-4.3).
- För positiv kontroll inkubationer, avdunstar en alikvot innehållande 100 fmol syntetiserade NNC lösning i en 1 mL-rör under en ström av N 2. Till denna injektionsflaska, lägga det full enzymsystemet från steg 3,2 och fortsätt enligt beskrivningen för steg 3.3-3.4.
- För negativ kontroll inkubationer, utföra experimentet som beskrivs (steg 3,2-3,4) utom Ersätt 50 μL enzym lösning med 0,5 X reaktion buffert.
4. Exempel parametrar för nitrosamide upptäckt av LC-NSI +-HRMS/MS
- för the LC komponent, gäller följande flerstegs övertoningen i steg 4,2 för ett UPLC system som använder en kommersiell, hand-packade 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm orifice kapillärkolonn.
- Med 5 mM NH 4 OAc lösningsmedel A och MeCN som lösningsmedel B, Ladda provet till kolonnen genom att köra på 5% B vid 1 μL/min från 0 - 5 min och sedan bromsa flödet till 0.3 μL/min efteråt. Kör sedan en övertoning från 5 till 20% B över 4 min, följt av en ramp till 55% B över 10 min och sedan åter Jämviktstiden 5% B.
- Utföra det LC-NSI +-HRMS/MS på en LTQ-Orbitrap. Monitor för NNC både fullständig genomsökning och MS 2 fragmentering. Utför fullständig skanning med en upplösning på 60.000 och extrahera den korrekta överordnade massan (192.07670) på en massa tolerans på 5 ppm. Använd MS 2 fragmentering att isolera överordnade joner (2.0 amu) och fragment av kollision-inducerad dissociation (CID) med en kollision energi av 25 eV, upplösning av 15.000, och skanna tid av 30 ms. extrahera korrekt massorna för produkten joner av NNC (m/z 192 m/z 134.04739 och 162.07874) på en massa tolerans på 5 ppm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på arbetet av vita et al. 19, norcotinine var nitrosoderivat till NNC renlig och i hög avkastning (80-92%) att producera en standard för in vitro- experimentet. Strukturella bevis för en framgångsrik reaktion erhölls från spektroskopiska analyser inklusive 1H-NMR, 13C-NMR, mysiga och HSQC (stödja Information) tillsammans med HRMS som bekräftade den överordnade massan [M + H]+ inom 5 ppm av de teoretiska värdet (figur 2). MS2 fragmentering av NNC användes för att bestämma de vanligast förekommande produkt ion massorna. Den beslutsamma korrekt förälder massa och produkt ion massorna användes i LC-NSI+- HRMS/MS-metoden i vitro analysens. Om förvaras i mörker vid 2-8 ° C, är NNC lösningen stabil i minst 3 månader. Eftersom detta är en mycket allmän reaktion, har det för att någon 2° Amid.
Figur 2: HRMS och HRMS2 spektrum av NNC.
(A) korrekt överordnade massa NNC med en massa tolerans på 5 ppm: beräknas: [M + H]+ = 192.07675, Funna: 192.07670. (B) MS2 fragmentering av m/z 192 med en isolering bredd på 2,0 amu. De två vanligast förekommande produkt jonerna är 134.04739 och 162.07875. Omtryckt med tillåtelse från Chem. Res. Toxicol., 2016 29, pp 2194-2205. Copyright 2016 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Syntetiserade NNC utnyttjades som standard för in vitro- P450 metabolism analysen. Cytokrom P450 2A6 användes eftersom det är känt att vara en effektiv katalysator för NNN oxidation20. Jämväl, NNN koncentrationen var inställd på 2 μM som det approximerar Km för α-hydroxylering21. Under de kromatografiska förhållanden som beskrivs, eluerar syntetiska NNC vid ~17.5 min med väl löst toppar i både överordnade ion och produkt ion kanaler. I enlighet med den positiva kontrollen noterades bildandet av NNC i de 1, 5 och 10 min inkubationer.
Figur 3: LC-NSI-HRMS kromatogram som härrör från de NNN-cytokrom P450 2A6 inkubationer.
För alla sektioner är övre kromatogrammet korrekt överordnad massa utvinns från fullständig genomsökning för NNC. De mellersta och nedre kromatogram är två korrekt produkt ion massorna ur MS2 fragmentering för NNC. Sektioner är följande: NNC standard (A), NNC-cytokrom P450 2A6 inkubationer som innehåller alla relevanta enzymer och kofaktorer med inkubationstider 1 min (B), 5 min (C) och 10 min (D). RT = retentionstiden; MA = massa område. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
NNC nivåer var maximal på 5 min och minskade vid senare tidpunkter. Relativ kvantifiering med syntetiska NNC som en standard Beräknad maximal NNC nivåer för att vara 10 nM. I den negativa kontrollen saknar P450-systemet, ingen NNC bildning var upptäckta (inga data anges), vilket indikerar enzymatisk konvertering var således krävs. Tillsammans, detta protokoll visar direkta bevis för omvandlingen av NNN till NNC av P450 2A6, även om omfattningen av bildandet är mindre jämfört med α-hydroxylering av NNN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belysa metabolismen av nitrosaminer är en kritisk komponent för att förstå deras cancerogenitet. Eftersom de inblandade cytokrom P450s och andra metabola enzymer är polymorfa, kunde ytterligare tillämpningen av denna kunskap potentiellt identifiera hög risk individer1,4. Nya data visar att ytterligare oxidering av α-hydroxynitrosamines, de förmodade huvudmetaboliterna av nitrosaminer inblandade i DNA-bindning, att nitrosamides är möjlig. men har detta inte kraftfullt testats inom ett brett spektrum av substrat. Vi har beskrivit ett protokoll för att fastställa omfattningen av processive oxidation av nitrosaminer till nitrosamides in vitro. Bred tillämpning av denna metod kommer att avgöra den totala vikten av denna väg av metabolism.
Metoden börjar med att förbereda en standard för nitrosamide av intresse. I studien som exempel, är det NNC, en hypotetisk metabolit av den tobak cancerframkallande NNN, cancerframkallande Funna i tobak produkter14,22. Som beskrivits, fortsatte nitrosation av norcotinine smidigt med inga märkbara sida produkter. Råa produkten kontaminerades av endast start amide och ättiksyra, som var enkelt bort genom kolonnkromatografi. Detta följdes av bekräftelse av strukturen av NMR och HRMS. En fördel med denna metod är att den är lämplig för praktiskt taget alla amide, som tillåter flera nitrosamin/nitrosamide system för utredas. Dessutom, ger användning av NMR för kvantitering en direkt mätning av molariteten för standardlösningen17. Detta tillåter lagring av föreningen under inert villkor i stället för som kräver mätning av destruktiva tekniker såsom HPLC med omvänd fas. Sedan kan olika spädningar göras att passa experiment design.
Med en positiv kontroll och ett väl karakteriserade massa fragmentering mönster tillåter den mycket känsliga och selektiv LC-NSI+- HRMS/MS metoden påvisande av nitrosamides i en relativt komplex matris. Som visad, beräknad metoden en NNC koncentration av 1-10 nM eller 2-20 fmol på kolumn trots 1000-fold överskottet av börjar nitrosamin, enzym och andra kofaktorer. Känslighet och selektivitet av metoden är en följd av hög upplösning massa övervakning, som standard LC-MS system saknar. Överordnade ion urval med en 5-ppm massa tolerans säkerställer att endast föreningar med formeln önskad är isolerade. Likaså ger korrekt massa upptäckt av de två vanligast förekommande produkt jonerna tillsammans med sin retentionstid ytterligare analyten bekräftelse. På grund av detta kräver masspektrometri metoden att många parametrar är optimerade inklusive isolering bredd, kollision energi och söktiden. LC övertoningen kan också ändras för att förbättra känsligheten som samtidig eluering med andra ämnen kommer att begränsa fylla ion fällan med det målet nitrosamide.
I exempel studie14var NNC bildandet mindre. Baserat på massa område, NNC var ~ 4000-fold mindre riklig än de hydrolyserade produkterna av α-hydroxyNNN21. Även om detta indikerar NNC är en mycket mindre metabolit av NNN, kan andra system variera. Chowdhury et al. hittade betydande, processive oxidation av dimethylnitrosamine och diethylnitrosamine; men var den nitrosamide mellanliggande omätbara enligt deras villkor12. Det är möjligt att reanalyzing deras system av den teknik som beskrivs här kan avslöja nitrosamide bildning. Oberoende av deras bildning, kan högre stabilitet av nitrosamides jämfört med α-hydroxynitrosamines indikera att dessa föreningar har biologiska betydelse som de bör lättare transportera cellen.
Även om denna metod kommer att gälla för de flesta nitrosamin-enzymsystem, finns det vissa begränsningar. Den mest betydande är att metoden inte är kvantitativ. I exempel experimentet uppskattades bildandet från massa spektrometriska topparean för ett positivt kontrollprov. För en mer exakt mätning, skulle en Isotoputspädning metod utnyttjar en isotopically märkta nitrosamide kunna utvecklas. Ett annat tillvägagångssätt skulle genomföra en svällning strategi med föreningar såsom N- acetyllysine eller N- acetylcystein, men detta misslyckades hittills i våra händer14.
En annan begränsning är nitrosamides tendens att hydrolysera enkelt9. prover måste således behandlas individuellt. Detta saktar arbetsflödet och förhindrar prover skickas till medarbetare för analys. Det bör slutligen noteras att även om cytokrom P450 2A6 och många andra är kommersiellt tillgängliga, vissa kräver proteinuttryck och rening att erhålla. Exempelvis denna analys tillämpades på cytokrom P450-2A1314, men det är endast tillgänglig efter en rigorös isolering process23.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för att upptäcka nitrosamides följd av cytokrom P450-katalyseras oxidation av nitrosaminer i vitro. Protokollet innehåller en allmän syntes för en nitrosamide som standard som en positiv kontroll och ett in vitro- cytokrom P450-metabolism test med LC-NSI+- HRMS/MS för upptäckt. I exempel studien upptäcktes NNC vid alla inkubation tider sträcker sig från 1-10 min, men endast en mindre metabolit av NNN. Tillämpningen av detta protokoll för andra nitrosaminer kommer att bedöma dess generalitet och den potentiella rollen för nitrosamides i nitrosamin carcinogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av grant inga. CA-81301 från National Cancer Institute. Vi tackar Dr. Peter Villalta och Dr Anna K. Michel för deras värdefulla diskussioner, Xun Ming för masspektrometri hjälp i analytisk biokemi delade resursen av Masonic Cancer Center, och Bob Carlson för redaktionellt stöd, Dr. Adam T. Zarth och input. Analytisk biokemi delade resursen stöds delvis av National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA-77598
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
- Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
- Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
- Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
- Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
- Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
- Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
- Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
- Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
- Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
- von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
- Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
- Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
- Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
- Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
- Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
- van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
- White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
- Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
- Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
- Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
- von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).
