Summary
المقايسة "الكروماتين" ترانسبوساسي موجوداً إلى جانب التسلسل الفائق (أتاك-seq) أسلوب المجين على نطاق المنظومة لكشف الكروماتين موجوداً. هذا بروتوكول أتاك-seq خطوة بخطوة، من الجزيئية للتحليل الحسابي النهائي، الأمثل للخلايا البشرية الليمفاوية (Th1/Th2). يمكن اعتماد هذا البروتوكول من الباحثين دون خبرة سابقة في أساليب تسلسل الجيل القادم.
Abstract
المقايسة "الكروماتين" ترانسبوساسي موجوداً مع التسلسل الفائق (أتاك-seq) أسلوب يستخدم لتحديد مناطق الكروماتين (موجوداً) مفتوحة. وتمثل هذه المناطق التنظيمية عناصر الحمض النووي (مثلاً، المروجين، معززات، موضع مراقبة المناطق، عوازل) للنسخ التي ربط العوامل. رسم الخرائط في الساحة الكروماتين موجوداً نهج قوية للكشف عن العناصر التنظيمية النشطة عبر الجينوم. هذه المعلومات بمثابة نهج غير متحيز لاكتشاف شبكة عوامل النسخ ذات الصلة، والآليات لهيكل الكروماتين التي تنظم برامج التعبير الجيني. أتاك-seq بديل قوية وحساسة الدناز أنا تحليل حساسية مقترنة بالجيل التالي التسلسل (الدناز-seq) وساعدت فورمالدهايد عزل العناصر التنظيمية (فير-seq) لتحليل المجين على نطاق المنظومة من الكروماتين إمكانية الوصول، وتسلسل المواقع الحساسة نوكلاس ميكروكوككال (seq منسى) لتحديد المواقع نوكليوسومي. نقدم بروتوكول أتاك-seq مفصلة الأمثل للخلايا البشرية المناعية الأولية أي خلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية (مساعد تي 1 (Th1) وخلايا Th2). هذا البروتوكول شامل يبدأ مع الخلية الحصاد، ثم يصف الإجراء الجزيئية من الكروماتين تاجمينتيشن، إعداد نموذج لتسلسل الجيل المقبل، ويشمل أيضا طرق واعتبارات للتحليلات الحسابية المستخدمة في تفسير النتائج. وعلاوة على ذلك، لتوفير الوقت والمال، قدمنا تدابير مراقبة الجودة لتقييم المكتبة seq أتاك قبل التسلسل. الأهم من ذلك، المبادئ الواردة في هذا البروتوكول تسمح التكيف مع خطوط الخلايا والخلايا الأولية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة البشرية الأخرى. كما ستكون هذه المبادئ التوجيهية مفيدة للمختبرات التي لا يتقن مع أساليب تسلسل الجيل القادم.
Introduction
أتاك-seq1،2 هو أسلوب قوي يتيح تحديد مناطق الكروماتين فتح التنظيمية3 ونوكليوسومي لتحديد المواقع. يتم تطبيق هذه المعلومات لاستنتاج موقع وهوية، والنشاط من عوامل النسخ. حساسية للأسلوب لقياس التغيرات الكمية في هيكل الكروماتين يتيح دراسة نشاط العوامل الكروماتين، بما في ذلك remodelers الكروماتين والمعدلات، فضلا عن النشاط الترانسكربتي من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني1. وبالتالي يوفر أتاك-seq نهج قوية وغير منحازة لفك رموز الآليات التي تحكم تنظيم النسخي في أي نوع من الخلايا للفائدة. يصف لنا تكييف أتاك-seq لخلايا Th1 و Th2 البشرية الأساسية.
أتاك-seq، تحميل مفرط Tn5 ترانسبوساسي مع محولات لتفتيت الحمض النووي الأزواج الجيل التالي التسلسل (خ ع) مع وضع علامات الحمض النووي مع محولات (أي، في عملية "تاجمينتيشن")1. وبعد التضخيم بكر، مكتبات الحمض النووي الناجم عن ذلك مستعدون للجيل التالي التسلسل (الشكل 1). تم الكشف عن تاجمينتاتيون تفضيلية من الكروماتين موجوداً بتحليل التخصيب المحلية أتاك-seq ترتيب القراءة.
الإجراءات التجريبية قصيرة ومتطلب لمواد انطلاق أقل، مقارنة بالأساليب الأخرى لقياس إمكانية الوصول الكروماتين ونوكليوسومال لتحديد المواقع مثل seq الدناز4و فير-seq5seq منسى6، قد تشجيع استخدام seq أتاك في النظم البيولوجية متعددة بما في ذلك الخلايا البشرية الابتدائية1،7 والعينات السريرية8، فضلا عن الكائنات الحية أحادي الخلية9،10من النباتات، ذباب الفاكهة11 ، ومختلف الثدييات12.
هوية النسخ يمكن كشف العوامل التي من المحتم أن المكاني موجوداً بتحليل في إثراء زخارف تسلسل الملزمة أو الجمع بين أتاك-seq الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها (تسلسل الحمض النووي الفائق تشيبسيق). تمكين هذا النهج تحديد عوامل النسخ الخاصة بنسب هامة هيماتوبويسيس في13من الماوس. تتيح طبيعة أتاك-seq غير متحيزة والعالمية دراسة تنظيم الجينات في الكائنات الحية التي لا تتوفر الكواشف مثل الأجسام المضادة لتحليل الرقائق. على سبيل المثال، الاختلافات التطورية في رابطة الدول المستقلة-وحددت المناطق التنظيمية بدراسة الخلايا الجمجمة العصبي كريست من البشر والشمبانزي14، التغيرات الإنمائية في العناصر التنظيمية خلال أوائل الماوس embryogenesis15، والتغيرات في المناظر الطبيعية التنظيمية خلال دورة الحياة من أحادي الخلية أووزارزاكي جيم-9، والتطور من المروجين ومحسنات عبر أنواع الثدييات 2012.
وكان أتاك-seq مفيداً لقياس إمكانية الوصول الكروماتين في الخلايا المفردة، وبالتالي الكشف عن التغير داخل الخلية السكان، التي عادة ما يتهرب من الدراسات على نطاق الجينوم7،16أيضا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام seq أتاك لدراسة التغيرات التي تحدث في المناطق التنظيمية الحمض النووي في ظروف المرض، التي عينات نادرة. على سبيل المثال، يمكن استخدام seq أتاك لدراسة التغيرات في المناظر الطبيعية التنظيمية أثناء ظهور سرطان الدم النقوي الحاد (AML)17 أو رأس-مدفوعة أونكوجينيسيس11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي أقرها مجلس المراجعة المؤسساتية في جامعة بار ايلان والبروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها اللجنة الموافقة على هذه التجارب-
1-تنقية من السذاجة CD4 + الخلايا البشرية والاستقطاب لخلايا Th2 ومساعد تي 1 (Th1)
ملاحظة: هنا يمكننا وصف الإجراء بدءاً من خلايا الدم الطرفية البشرية المجمدة وحيدات النوى (ببمكس). الخطوة الأولى تتكون من عزل خلايا CD4 + الخلايا باستخدام ميكروبيدس والأعمدة عادة ما تعطي لنا أكثر من 95% من خلايا CD4 +. ومع ذلك، قد تختلف هذه الخطوة وفقا للبروتوكول المفضل في كل مختبر. تعديل البروتوكول لتنشيط خلية تي والاستقطاب من جينر et al. (2009) 18-عزل خلايا CD4 + الخلايا من 10 مليون ببمكس يعطي ترتفع إلى 4 مليون خلايا CD4 +. وهي تنقسم إلى اثنين من قوارير ونمت تحت Th1 واستقطاب Th2 شروط الغلة خلايا Th1 و Th2 3 مليون في غضون أسبوع واحد فقط-
ملاحظة: يبرد الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية قبل البدء.
- ذوبان الجليد 1 مل من ببمكس البشرية (10 7 الخلايا) في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل متوسطة ربمي تستكمل مع 1% البنسلين والستربتوميسين، مم 2 لتر-الجلوتامين وإبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري. الطرد المركزي في 500 غرام x للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا مع ماصة معقمة 25 مل في 15 مل من تستكمل ربمي المتوسطة. نقل الخلايا (مع ماصة معقمة 25 مل) إلى قارورة ثقافة T75.
- ترك الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة هوميديفيد (37 درجة مئوية، 5% CO 2)-
- نقل الخلايا العائمة مع ماصة معقمة 25 مل أنبوب 50 مل. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستبعاد تريبان الأزرق-
- + CD4 عزل الخلايا من 10 مليون يعيش غير-تمسكا ببمكس بالتحديد الإيجابي باستخدام خلايا CD4 + ميكروبيدس والأعمدة وفقا للشركة المصنعة ' s توصيات (انظر الجدول للمواد والمعدات) بما يلي التعديلات: 10 7 ببمكس المسماة مع 30 ميليلتر من ميكروبيدس CD4 في 120 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 0.5% في برنامج تلفزيوني.
- تنشيط خلايا CD4 + T ح 72 برحيل-2 (10 نانوغرام/مل)، وربط لوحة مكافحة-CD3 (5 ميكروغرام/مل) وقابل للذوبان المضادة-CD28 (2 ميكروغرام/مل). للاستقطاب Th1، إضافة رهيل-12 (20 نانوغرام/مل) ومكافحة--إيل-4 (10 ميكروغرام/مل). إضافة لاستقطاب Th2، رهيل-4 (40 نانوغرام/مل) ومكافحة-IFN-γ (10 ميكروغرام/مل).
- ثقافة الخلايا الإضافية 7 أيام حضور رحيل-2 (10 نانوغرام/مل) والسيتوكينات الاستقطاب نفسه (رحيل-12 ل Th1 ورحيل-4 ل Th2)-
2. عزل نواة
ملاحظة: أتاك-seq تتم مع نويات سليمة. (انظر الجدول للمواد والمعدات) معايرة تحلل العازلة التي تحتوي على 0.05% نونيلفينيل البولي إثيلين جليكول لعزل نواة من خلايا Th1 و Th2 البشرية الأساسية. ونحن نوصي معايرة هذه الخطوة مع والكواشف المختبرية والخلايا. وجود فائض خلايا سليمة من المنظفات الصناعية غير كافية يقلل من كفاءة نقل رد فعل. تتحدد كفاءة تحلل الخلية بعدد الأنوية (الخلايا إيجابية تريبان الأزرق) مقارنة بالعدد الإجمالي للخلايا.
ملاحظة: إعداد المخزن المؤقت تحلل (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم كلوريد الصوديوم، مجكل 3 مم 2). يبرد الطرد مركزي مع دوار سوينغ-دلو إلى 4 درجة مئوية. التكوير خلايا الطرد مركزي سوينغ-دلو بدلاً من الطرد زاوية ثابتة يقلل من فقدان الخلية/نوى. لتجنب الأنوية أو فقدان الخلية، بيبيت بعناية عندما تجاهل المادة طافية.
- إضافة جديدة نونيلفينيل البولي إيثيلين غليكول (إلى نهائي تركز 0.05%) و 100 × مثبطات البروتياز (إلى نهائي تركز 1 x) إلى المخزن المؤقت تحلل الباردة فورا قبل الاستخدام. الاحتفاظ المخزن المؤقت على مدت
- T عدد الخلايا لتحديد كمية وصلاحية استخدام أسلوب تريبان الأزرق. صلاحية أقل من نتائج 90% في أعلى غير محدد الهضم.
- نقل 0.5 × 10 6 ر الخلايا (Th1 أو Th2) إلى 1.5 مل microtubes. تدور إلى أسفل في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من البرد مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) حل. تدور إلى أسفل في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من البرد تحلل المخزن المؤقت (الذي يحتوي على نونيلفينيل البولي إيثيلين غليكول ومثبطات البروتياز). الاحتفاظ بالانبوب على الجليد. ماصة برفق لتجنب عرقلة الأنوية.
- بسرعة 10 ميليلتر وعد الخلايا مع عداد الآلي خلية حين microtube مع تفكيك الخلايا على الجليد. هذه الخطوة ينبغي أن لا تتجاوز خمس دقائق لتجنب إتلاف الأنوية. وينبغي أن يكون تفكيك 80 في المائة على الأقل من الخلايا.
- متابعة مباشرة مع رد فعل النقل. تبقى الأنوية مستعدة على مدت
3. نقل رد فعل
ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم المحتضنة نواة معزولة مع بدائية Tn5 ترانسبوساسي (TDE1) محملة بمحولات لتسلسل خ ع. وشظايا من الحمض النووي Tn5 مفرط في الوقت نفسه ليجاتيس محولات إلى مناطق موجوداً للجينوم (عملية تاجمينتيشن). النسبة بين نوى وترانسبوساسي Tn5 أمر حاسم للانقسام تفضيلية في الكروماتين موجوداً. معايرة هذا البروتوكول لنوى 100,000 في حجم رد فعل 100 ميكروليتر. بيد أن رد فعل يمكن تقليصها.
- تعيين درجة الحرارة في شاكر حرارية إلى 37 درجة مئوية.
- نوى 100,000 نقل إلى microtube 1.5 مل.
- الطرد المركزي في ز 500 x لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية ولطف إزالة المادة طافية.
- إضافة مكونات رد فعل التحول إلى النواة ك محدد في الجدول 1-
- ريسوسبيند من بيبيتينج لطيف.
- احتضان رد فعل التحول في شاكر حرارية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع لطيف تهز (500 لفة في الدقيقة)-
ملاحظة: تنظيف الحمض النووي هو يؤديها التثبيت عكسها المرحلة الصلبة الخرز 19 (انظر الجدول للمواد والمعدات) أو PCR تنقية الأعمدة. في نهاية عملية التنظيف، الوت الشظايا من الحمض النووي في 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 8. تجنب يدتا في المخزن المؤقت شطف.
4. بكر إثراء المكتبات أتاك-seq
ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تضخيم أتاك-seq مكتبة أي الشظايا من الحمض النووي مع محولات المدرج. للسماح بخلط عدة مكتبات أتاك-seq في حارة تسلسل الجيل نفسه (" الإرسال المتعدد ") غير مفهرسة استخدام التمهيدي 1 (Ad1_noMx) 1 لجميع العينات، وفهرسة مختلفة (المراقب) التمهيدي 2 (Ad 2.1-2.24) 1 لكل عينة. وترد في تسلسل التمهيدي في الجدول للمواد والمعدات المكملة.
- الأولى [بكر] تضخيم
ملاحظة: تركيز العمل التمهيدي 1 (Ad1_noMx) و 2 التمهيدي هو 25 ميكرومتر. هي تضعف الإشعال كل من الأسهم الأصلية من 100 ميكرومتر إلى 25 ميكرون. في كل ردود الفعل بكر، استخدم التمهيدي 1 (Ad1_noMx) وواحد فقط من 2 التمهيدي المفهرسة.- إضافة المكونات لتفاعل PCR ك محدد في الجدول 2 إلى أنبوب PCR عقيمة.
- بكر مكان الأنبوبة إلى cycler حرارية وأداء [بكر] تضخيم استخدام الدراجات الشروط المفصلة في الجدول 3-
- تقييما لعدد من دورات إضافية التضخيم
ملاحظة: عدد دورات PCR إضافية ينبغي أن تسفر عن كمية كافية من مكتبة أجزاء وأو نجاح من جيل التالي تسلسل التشغيل، أثناء تصغير لتجنب GC وحجم التحيز 20. يتم تحديد عدد PCR دورات (ن) المطلوبة للتضخيم جزء المكتبة المثلى PCR الكمي (qPCR).- تمييع 1 كبسولة تفجير (Ad1_noMx) و 2 (يستخدم للتضخيم المكتبة الأولى) من 25 ميكرومتر إلى 6.25 ميكرومتر.
- إضافة المكونات إلى أنابيب PCR الضوئية أو لوحة كما ورد في الجدول 4-
- مكان في الصك قبكر ودورة المحدد في الجدول 5-
- الأرض لتقدير العدد المطلوب من دورات إضافية التضخيم (N)، عدد دورة على المحور السيني والأسفار النسبي (رفو) على المحور الصادي. دورات
- عدد التضخيم إضافية (N) هو 1/3 عدد من الدورات الذي يبلغ فيه رد فعل qPCR الهضبة. الشكل 2 يوفر أمثلة لثلاث مكتبات أتاك-seq التوصل إلى الهضبة في وحدات fluorescence النسبية ~ 2,350، رفو (خط أخضر سميك). عدد دورات PCR الذي يتم تضخيمه ثلث المبلغ الأقصى (783 رفو، علامة على المحور ص) يناظر 8 دورات لمدة سنتين للمكتبات (منحنيات التضخيم أحمر وأزرق) و 9 دورات PCR للمكتبة الثالث (الوردي)-
- النهائية [بكر] تضخيم
- تضخيم ميليلتر 45 المتبقية لتفاعل PCR. ضع أنبوب PCR الذي يتضمن رد فعل التضخيم من الخطوة 4.1.2 في cycler حرارية. قم بتشغيل برنامج PCR المبينة في الجدول 6. استخدام عدد سبق تحديدها (الخطوة 4.2.5) دورات التضخيم (N)-
5. حجم "التحديد لمكتبات" أتاك-Seq
ملاحظة: في تجربتنا، يحسن اختيار حجم من تضخيم أتاك-seq مكتبات الجيل التالي تسلسل النتائج لأنه يقضي على ارتفاع الوزن الجزيئي مكتبة شظايا من النهائي seq أتاك المكتبة-
ملاحظة: تسمح الخرز المغناطيسي الحارة إلى درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
إعداد جديدة من الإيثانول 70% في المياه خالية من نوكلاس.
- ريسوسبيند الخرز المغناطيسي بخلط.
- إضافة المياه خالية من نوكلياسي إلى مكتبات أتاك-seq (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3.1.) وجلب يصل إلى 100 ميليلتر.
- إضافة 50 ميليلتر (0.5 x) من حراكه الخرز المغناطيسي الحمض النووي ملزم إلى 100 ميليلتر من تضخيم المكتبات. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات. احتضان عينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إذا لزم الأمر، تدور بسرعة إلى أسفل microtubes-
- وضع الأنبوب على موقفا مغناطيسي مناسب لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز المغناطيسي من المادة طافية. بعد 2 دقيقة، نقل المادة طافية microtube جديدة- قياس حجم المادة طافية بيبيتينج
- وإضافة x 0.7 من حبات مغناطيسية. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
- احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. مكان على الوقوف مغناطيسي للحد الأدنى 2
- بعد 2 دقيقة الحضانة، تجاهل المادة طافية. إضافة ميليلتر طازجة 200 70% إيثانول لغسل الخرز في حين الأنابيب على الوقوف المغناطيسي.
- تبقى microtube على المغناطيس لمدة 30 ثانية وتجاهل ثم الإيثانول. كرر الخطوة 5.7.for هما الإيثانول النهائي يغسل.
- إزالة الإيثانول واسمحوا الخرز أيردري لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على المغناطيس المتبقية. إذا لزم الأمر، باختصار تدور في microtube. إزالة آثار الإيثانول مع تلميح ماصة p10.
- إزالة microtube من المغناطيس وإضافة ميليلتر 22 10 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 8. لا الوت المكتبات أتاك-seq في المخزن المؤقت الذي يحتوي على يدتا.
- احتضان الأنبوب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم ضع على الوقوف المغناطيسي.
- عندما يكون الحل واضح، نقل 20 ميليلتر من مكتبات التيد microtube عقيمة جديدة-
- تحديد مخزن الحجم المكتبات أتاك-seq في-20 درجة مئوية.
6. تحليل نوعية المكتبات Seq أتاك
- التحقق نوعية المكتبات seq أتاك من PCR الوقت الحقيقي
ملاحظة: من المهم تقييم إشارة إلى نسبة الضوضاء من مكتبات seq أتاك قبل الجيل القادم التسلسل. يتم ذلك عن طريق تحديد مبلغ نسبي من شظايا من الحمض النووي من المكاني موجوداً ولا يمكن الوصول إليها باستخدام PCR الكمي (قبكر). المكاني غير قابلة للوصول (المراقبة السلبية، chr1:48، 137، 860-48,137,934 و chr1:193، 093، 748-193,093,827) تتضخم بأزواج التمهيدي 1 و 2. المكاني موجوداً (مراقبة إيجابية، chr19:30، 336، 166-30,336,253 و chr19:11546154-11546237) تتضخم بأزواج التمهيدي 3 و 4. تم تعريف المكاني الإيجابية والسلبية من الكروماتين إمكانية الوصول (درهم-seq) لمحات من خلايا CD4 + الإنسان (ترميز الانضمام ENCSR000EQE و ENCSR000EQG). التمهيدي سلبية 1 يقع في منطقة إينتيرجينيك هيتيروتشروماتيك كبيرة (230 كيلو بايت من TRADB2 و 88 كيلو بايت من FOXD2). منطقة المراقبة السلبية 2 في داخل إنترون الأولى من الجينات CDC73. الإيجابي زوج التمهيدي 3 داخل منطقة الكروماتين فتح المصب من الجينات Cyclin E (CCNE1) بينما التمهيدي إيجابية زوج 4 يتركز داخل المروج للبروتين كيناز ج الركيزة 80 كح (برككش). الأهم من ذلك، إظهار المكاني التحكم هذه نمطاً مماثلاً للوصول في أنواع الخلايا البشرية الأخرى من مشروع ترميز 3، مما يوحي بأنه يمكن تطبيقها على رصد المكتبات seq أتاك من طائفة واسعة من أنواع الخلايا البشرية. تم التحقق من التمهيدي الكفاءة والنوعية لجميع أزواج التمهيدي قبل قبكر على إضعاف مسلسل من الحمض النووي (من الخلايا البشرية Th) وتحليل منحنى ذوبان للمنتجات المتحصل عليها مكبرة.- عزل الحمض النووي باستخدام المتاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد والمعدات)-
- تمييع تضخيم أتاك-seq مكتبة 01:10 (1 ميليلتر مكتبة + 9 ميليلتر من المياه خالية من nuclease) والحمض النووي ل ~ 5 نانوغرام/ميليلتر.
- إعداد رد فعل خليط (الجدول 7) لكل زوج التمهيدي التحكم الإيجابي والسلبي، آخذا في الاعتبار أن ردود الفعل التي يتم تنفيذها في ثلاث نسخ.
- إينكوباتي في qPCR cycler الحرارية وفقا للبروتوكول الذي أوصت به المورد الرئيسي ميكس qPCR.
- تحليل النتائج في الصك قبكر ' ق البرمجيات (انظر الجدول للمواد والمعدات). اختر الحمض النووي كعينة مراقبة. وتمثل القيم التي تم الحصول عليها إغناء المناطق موجوداً (تضخيمه بمراقبة إيجابية كبسولة تفجير). يتم عرض مثال في الجدول 8-
ملاحظة: تقدير حجم متوسط مكتبة وتركيز: توزيع حجم شظايا من الحمض النووي من مكتبات أتاك-seq يتحدد بأنظمة عالية الحساسية التفريد الآلي وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. فمن المستحسن أن قياس تركيز العينة على فلوروميتير استخدام طقم دسدنا حساسية عالية وعلى الأقل 2 ميليلتر لكل عينة من الحمض النووي-
ملاحظة: الجيل التالي التسلسل--قبل الإرسال المتعدد في المكتبات، حساب مولاريتي لكل مكتبة seq أتاك باستخدام الصيغة: (نانوغرام/ميليلتر x 10 6)/(تجزئة 660 × مكتبة متوسط الطول). وتهدف ل > ما يلي: 30 مليون لكل مكتبة أتاك-seq لتقييم الكروماتين مفتوحة مناطق عينات البشرية. إذا كنت ترغب في تحديد ما إذا كانت المكتبة جيدة بما يكفي لتسلسل خ ع، تهدف في البداية ليقرأ 10 مليون (5% حارة التسلسل على أداة تسلسل الحمض النووي في وضع التشغيل السريع). نأخذ في الاعتبار أن الاستدلال نوكليوسومي لتحديد المواقع، من إقران نهاية تسلسل المطلوبة 1-
7. تحليل "النتائج التي تم الحصول عليها التسلسل" الجيل القادم
- استنتاج نوعية ما يلي التسلسل بفحص الملفات فاستقك، لكل مكتبة على حدة-
- محاذاة على ما يلي للجينوم البشرية مرجع (الجمعية hg19) باستخدام البرمجيات 21 Bowtie في بيئة يونيكس/لينكس. أن الأمر ' bowtie-م 1-س-S الجينوم الدليل reads.fastq output_aligned.sam '. دليل الجينوم تقف للمجلد حيث يتم تخزين فهارس Bowtie الجينوم. المعلمة-م 1 عدم السماح بالمحاذاة ليقرأ على محور واحد أو أكثر في الجينوم،-q ملف الإدخال التي ينبغي أن تكون في شكل فاستق،-S للإخراج في تنسيق سام-
- إزالة مكررة ما يلي: استخدام الخيار رمدوب 22 سامتولس في بيئة يونيكس/لينكس. الأوامر ' سامتولس عرض output_aligned.sam-ب-S | فرز سامتولس-س-output_aligned > output_aligned.bam '،
سامتولس رمدوب-ق output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. الأمر الأول، عرض، تغيير تنسيق سام في شكل سوق بكارا للأسلحة التي يتم فرزها بعد ذلك. ثم يتم تطبيق خيار رمدوب في الملف أم تم فرزها. بشكل اختياري واحد ضبط على ما يلي في موقع الإدراج ينقول، كما هو موضح في ورقة أتاك-seq الأصلي 1. ويتم ذلك باستخدام بيدتولس الأوامر 23 في بيئة يونيكس/لينكس. الأوامر ' بامتوبيد-i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed '، ' شيفتبيد-i الجينوم 4-م-5-ز-ف _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. الأمر الأول، بامتوبيد، تغيير تنسيق أم في شكل السرير الذي يمكن ثم استخدام الأمر شيفتبيد. الملف الجينوم هو ملف محدد في علامة تبويب التي تحتوي على طول كل كروموسوم في الجينوم. وعادة ما يتم إضافة الملف في الدليل بيدتولس. - إجراء استدعاء ذروة استخدام التحليل القائم على نموذج للبرنامج 24 شريحة-seq (MACS2) في بيئة يونيكس/لينكس على الملف سرير تحول مع المعلمات التالية:-نوموديل-اكستسيزي 75-التحول-30. يتم استخدام هذه المعلمات لضبط ما يلي حيث يكون الموقع الإدراج ينقول في منتصف كل قراءة التسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتيجة النهائية لهذا البروتوكول مكتبة seq أتاك من عادة 3-20 نانوغرام/ميليلتر. عند تشغيل في وضع نظام لتحليل سلامة الحمض النووي (انظر الجدول للمواد والمعدات)، أنها تظهر مظهر يشبه سلم2 (الشكل 3A). عادة ما يكون متوسط حجم شظايا من الحمض النووي هو bp ~ 450-530.
مراقبة الجودة الصحيحة المكتبات seq أتاك قبل أداء الجيل التالي تسلسل مهم لتوفير الوقت والمال. أننا نعتبر المكتبات مناسبة للجيل التالي التسلسل (خ ع) عند إثراء عناصر إيجابية من أكثر من 25-و 75-أمثال (للتمهيدي أزواج 3 و 4، على التوالي) بالنسبة إلى عناصر سلبية (الشكل 3B) وعندما تظهر سبق ذكرها نوكليوسومال، الشبيهة بسلم والمظهر. عند تحليل البيانات قبكر، نحن يتم أيضا التحقق من أن القيم الاستبيان المفاهيمي للإشعال مراقبة سلبية وإيجابية مماثلة في التفاعلات مع الحمض النووي الجينوم كقالب وأن تقدر الاستبيان المفاهيمي لمناطق المراقبة السلبية (في التفاعلات مع أتاك-تسلسل الحمض النووي الشظايا) ثابتة بين التجارب. على سبيل المثال، في حالة انخفاض فجأة Cq القيم، أننا نشتبه في أن الأنوية transposed الإفراط وهكذا شظايا من الحمض النووي التي تنشأ من مناطق heterochromatin تمثيلاً زائداً. وعلاوة على ذلك، إذا صورة هلام (التي تم الحصول عليها بحساسية عالية على أساس الشريط التفريد) مكتبات أتاك-seq يدل على وجود المحولات (~ 120 bp)، المفرط الحمض النووي تردي (غالبيتهم من الشظايا ~ 200 bp)، أو الشظايا الكبيرة (ما يزيد على 1 كيلو بايت)، نحن أن عدم الاستمرار في الخطوة خ ع.
وعلاوة على ذلك، نحن دائماً أداء خ ع الأولية التي نهدف ليقرأ 10 مليون كل مكتبة. إذا كانت نتائج هذا التسلسل مرضية (العينة بتمرير كافة المعلمات في ملف التقرير فاستقك ويمكننا الحصول على قمم 1000-2000 بعد إجراء الاتصال الذروة)، المكتبات هي متسلسلة أكثر عمقاً (أكثر من 30 مليون ما يلي/أتاك-seq المكتبة).
في أتاك-seq تجارب على خلايا الثدييات، في أي مكان من ~ 30-70% القراءات التسلسل يمكن أن تأتي من متدنا10. وفي المقابل، الوارد مكتباتنا المعينة للجينوم المتقدرية ما يلي: 6-20%. وهذا أقل من 46 في المائة المبلغ عنها في المكتبة seq أتاك من الخلايا اللمفية CD4 + T البشرية1. بعد إزالة هذه تلويث ما يلي، ونحن مع ترك 7 مليون فريدة من نوعها ما يلي: رسم خريطة للجينوم البشري مرجع (58%-91% من جميع ما يلي:). من هؤلاء، 0.1-كانت القراءات 2 مليون (6.8%-12% من كل القراءات) في قمم أتاك-seq (الشكل 4).
الشكل 1 . سير عمل خطوات التجريبية. تمثيل أهم الخطوات في هذا البروتوكول أتاك-seq. يتم الإشارة إلى نقطة إيقاف بالسداسي الأصفر. ويمثل خطوة اختيارية مع مسدس اللون برتقالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . حساب عدد إضافي من دورات PCR المطلوبة لإثراء المكتبات أتاك-seq النهائي. بكر التضخيم المنحنيات لثلاث مكتبات seq أتاك مختلفة مبينة في الأحمر والأزرق والوردي. ردود فعل التضخيم التوصل إلى هضبة في رفو 2,350 (خط أفقي الأخضر العلوي). عدد دورات PCR إضافية يتقاطع مع رفو 783 (2,350/3) على المنحنى التضخيم. مكتبات اثنين (أحمر وأزرق) تتطلب 8 دورات إضافية التضخيم في حين تتطلب المكتبة الثالث (الوردي) 9 دورات. يظهر قالب عدم التحكم (المجلس الوطني الانتقالي) كالخط الأخضر السفلي. المحور س، رقم دورة. المحور الصادي، وحدات رفو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تحليل مراقبة الجودة لمكتبات أتاك-seq. (أ) نتائج التفريد الآلي القائم على الشريط لتضخيم أتاك-seq المكتبات. L، وسلم؛ أ-د، يكرر مكتبات البيولوجية من الخلايا Th1 و Th2. (ب) تحليل مراقبة الجودة قبكر أتاك-seq المكتبات. تم تضخيم الحمض النووي وأربع مكتبات أتاك-seq أزواج التمهيدي المراقبة السلبية (1 و 2) ومراقبة إيجابية الإشعال (3 و 4). القيم التي يتم الحصول عليها لمكتبات أتاك-seq (أزرق) كان تطبيع أولاً إلى مستويات تضخيم الحمض النووي (مجموعة تعسفاً إلى قيمة 1؛ أحمر). في وقت لاحق، تم تطبيع القيم لمناطق المراقبة الإيجابية لمناطق المراقبة السلبية (الرسم البياني السفلي). وأرسلت إلى تسلسل خ ع المكتبات #1 و #2. وتمثل القيم يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . سنابش مستعرض الجينوم محطة تكرير النفط مناطق الكروماتين موجوداً في الخلايا Th1 و Th2. يتم عرض المسارات أتاك-seq ل NFKB1، جون، CD28، إيفنج (معبراً عنه إلا في Th1) و IL4 والمكاني IL13 (معبراً عنه إلا في Th2) في خلايا Th1 و Th2 (يكرر البيولوجية اثنين لكل منهما). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المخزن المؤقت TD | 50 | ميكروليتر |
| ترانسبوساسي TDE1 | 5 | ميكروليتر |
| المياه خالية من نوكلياسي | 45 | ميكروليتر |
| الحجم الإجمالي | 100 | ميكروليتر |
الجدول 1: التحضير لنقل رد فعل الخليط.
| مكتبة أتاك-seq | 15 | ميكروليتر |
| التمهيدي 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ميكروليتر |
الجدول 2: مكونات مزيج تفاعل PCR الأولى (الخطوة 5.1.1.).
| دورة خطوة | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| ملحق * | 72 درجة مئوية | 5 دقيقة | 1 |
| تمسخ الأولى | 98 درجة مئوية | 30 s | |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 s | 5 |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 s | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 3 دقيقة | |
| عقد | 4 درجة مئوية | ∞ | |
| * هذه الخطوة مطلوب لتمديد كل | |||
| ينتهي الإشعال بعد رد فعل النقل. | |||
الجدول 3: شروط ركوب PCR للتضخيم المكتبة الأولى (الخطوة 5.1.2.)
| الكوة من تفاعل PCR (الخطوة 4.1.1) * | 5 | ميكروليتر |
| التمهيدي 1 (Ad1_noMx) * * | 1 | ميكروليتر |
| التمهيدي 2 | 1 | ميكروليتر |
| مزيج الرئيسي x SYBR 2 * * * | 7.5 | ميكروليتر |
| المياه خالية من نوكلاس | 0.5 | ميكروليتر |
| الحجم الإجمالي | 15 | ميكروليتر |
| * للتحكم غير القالب بدلاً من القالب الحمض النووي إضافة مياه نقية جداً. | ||
| * * التركيز النهائي لكل التمهيدي هو 417 شمال البحر الأبيض المتوسط. | ||
| ويفضل استخدام مزيج الرئيسي ل qPCR. | ||
| وينبغي أن تحتوي على بوليميراز دنتبس، مجكل2وصبغة الفلورسنت. | ||
الجدول 4: إعداد قبكر رد فعل الخليط (الخطوة 5.2.2).
| دورة خطوة | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| تمسخ الأولى | 98 درجة مئوية | 30 s | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 s | 20 |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 s | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 3 دقيقة | |
| عقد | 4 درجة مئوية | ∞ |
الجدول 5: ركوب الدراجات شروط التقييم القائم على qPCR لعدد إضافي من دورات التضخيم (N) (الخطوة 5.2.3.)
| دورة خطوة | درجة الحرارة | الوقت | دورات |
| تمسخ الأولى | 98 درجة مئوية | 30 s | 1 |
| تمسخ | 98 درجة مئوية | 10 s | N |
| الصلب | 63 درجة مئوية | 30 s | |
| ملحق | 72 درجة مئوية | 3 دقيقة | |
| عقد | 4 درجة مئوية | ∞ |
الجدول 6: ركوب الدراجات شروط وبكر تخصيب اليورانيوم الخطوة الأخيرة (خطوة 5.3.).
| لفعل بكر واحدة: | ||
| تخفيف المكتبة للحمض النووي | 2.5 | ميكروليتر |
| 10 ميكرومترات التمهيدي و (F1 أو F2 أو F3 أو F4) * | 0.3 | ميكروليتر |
| 10 ميكرومترات التمهيدي R (R1 أو R2 أو R3 R4) * * | 0.3 | ميكروليتر |
| مزيج الرئيسي x SYBR 2 * * * | 5 | ميكروليتر |
| المياه خالية من نوكلاس | 1.9 | ميكروليتر |
| الحجم الإجمالي | 10 | ميكروليتر |
| * تركيز كل التمهيدي في خليط الرد النهائي هو 300 نانومتر. | ||
| * * إذا كان استخدام التمهيدي F1 مما ينبغي أن يكون الدليل التمهيدي R R1 إلخ. | ||
| استخدام المفضل 2 x ميكس الرئيسية مناسبة للصك قبكر في المختبر الخاص بك. | ||
الجدول 7: شروط رد فعل للتحليل ومراقبة الجودة (الخطوة 7.1.3.).
| الهدف | عينة | يعني Cq | Cq وزارة شؤون المرأة | الكمية النسبية | تطبيع | |
| 1 | مراقبة سلبية | أتاك-seq | 30.39 | 0.11 | 1 | 1.01 |
| جدنا | 30.4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | أتاك-seq | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| جدنا | 30.34 | 0.09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | مراقبة إيجابية | أتاك-seq | 23.27 | 0.03 | 1 | 173.14 |
| جدنا | 30.7 | 0.06 | 0.01 | 1 | ||
| 4 | أتاك-seq | 21.55 | 0.24 | 1 | 750.31 | |
الجدول 8: حساب إثراء إيجابية ضوابط الرقابة السلبية (الخطوة 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول أتاك-seq الموصوفة هنا قد استخدمت بنجاح لتحليل الكروماتين موجوداً في الخلايا الأولية (Th1 البشرية، Th2 الخلايا، وخلايا ب) فضلا عن خطوط الخلايا المستزرعة (MCF10A خلايا سرطان الثدي البشرية والخلايا جليوبلاستوما U261). تطبيق أتاك-seq لأنواع خلايا أخرى قد تتطلب بعض التحسين البروتوكول، ولا سيما في الخطوة تحلل. إذا كان تركيز المنظفات غير الأيونية مرتفع جداً، قد تكون هناك نسبة مئوية أعلى من الميتوكوندريا الحمض النووي التلوث. ويمكن تخفيض هذا بتقليل تركيز المنظفات في المخزن المؤقت لتحلل دون تقليل العائد الأنوية. في تجربتنا، تحلل المخزن المؤقت مع 0.05% منظفات أعطت نتائج مرضية للغاية. وباﻹضافة إلى ذلك، الغزل الأنوية في دلو بديل بدلاً من زاوية ثابتة دوار يسمح تخفيض القوة ز إلى 500، التي خفضت الميتوكوندريا في بيليه. يمكن اختبار الباحثون أيضا أنواع أخرى من المنظفات، على سبيل المثال، ديجيتونين17. ومع ذلك، حتى مع ظروف تحلل الأمثل، تلوث متدنا أمر لا مفر منه. لإزالة تماما متدنا، النظام كريسبر/Cas9 يمكن أن تستخدم15. وفي هذه الحالة، هي المحتضنة أتاك-seq المكتبات مع سجرناس إلى الهدف متدنا ونوكلاس Cas9 لهضم متدنا15.
قد يحد عدد الأنوية المطلوبة لهذا البروتوكول أتاك-seq (100,000) في الحالات التي يكون فيها عدد الخلايا من العينات السريرية النادرة7. أتاك-seq بنجاح حجم وصولاً إلى 5000 والخﻻيا 5001،،من1317 بخفض1،رد فعل المجلد13، تنفيذ تنظيف مع الخرز المغناطيسي بدلاً من أعمدة 13، أو تجنب بتنظيف الخطوة1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ خلية واحدة أتاك-seq (سكاتاك-seq) باستخدام جهاز موائع جزيئية لفصل النوى الفردية16. جدير بالذكر أن أساليب أخرى لقياس إمكانية الوصول الكروماتين، مثل seq الدناز وعدم التدخل-seq، تتطلب المزيد من المواد بداية وبضعة أيام لإجراء التجربة.
الآن على نطاق واسع ويقدر أن التحيزات في مختلف أساليب خ ع هي الظواهر المشتركة25. أحد الأسباب للاختلافات في الكروماتين مختلفة إمكانية الوصول إلى تدابير هو خطوة الانقسام الانزيمية25. فقد ثبت أن الدناز أنا يظهر الانقسام والتحيز26 والآن من المسلم به أن ترانسبوساسي Tn5 يظهر الانقسام والأفضلية، وكذلك27. لحسن الحظ، يمكن تحديد التحيز المحتمل حسابياً باستخدام خط أنابيب مراقبة الجودة مثل تشيلين28. مصدر آخر مشترك من التحيز هو PCR التضخيم الخطوة20،25. ويتجلى هذا كثيرا ما بتحيز للتضخيم الغنية GC شظايا25. نظراً للتحيز يزيد مع كل خطوة التضخيم بكر، نحن لا تتجاوز 9 دورات إضافية (ن) في النهائي [بكر] تضخيم مكتبات أتاك-seq.
نسبة السليم بين ترانسبوساسي Tn5 ونوى أمر حاسم لنجاح seq أتاك2. وجود فائض إنزيم سيؤدي إلى "عبر تبديل" في الخلفية عالية والمكاني غير قابل للوصول. وهذا ينعكس في التضخيم عالية من مناطق المراقبة السلبية في الخطوة مراقبة الجودة قبكر. وجود فائض نويات سيؤدي إلى "وكيل النقل". وفي هذه الحالة، سيؤدي إلى مواقع بعيدة جداً من الانقسام في عدد أقل من شظايا تضخيم بكر وتعقد مكتبة منخفضة. لتحديد عدد الأنوية بدقة، قدمنا خطوة إضافية في عد الأصوات بعد تحلل الخلية وقبل رد فعل النقل.
إمكانية الوصول إلى الكروماتين طبقة تنظيمية جينية هامة إذ أنه يسمح نشاط النسخ المنظمين في مواقع محددة الجينوم. وهكذا تسلسل الحمض النووي ضمن التشكيل الجانبي موجوداً الكروماتين يوفر ثروة من المعلومات حول مواضع الهوية والهدف من عشرات عوامل النسخ الممكنة. الجمع بين هذه المعلومات (التي تم الحصول عليها من أتاك-seq) مع ملف تعريف تعبير الجيش الملكي النيبالي يسمح تركيز على عوامل النسخ ذات الصلة التي يمكن تحليلها أيضا برقاقة seq13،22. وبالإضافة إلى ذلك، فقط 10% من مجمع الأشكال المتعددة المرتبطة بالمرض في الجينوم الترميز30. ومن ثم تطبيق أتاك-seq للعينات السريرية يمكن أن تكشف عن المتغيرات غير الترميز هي العناصر التنظيمية التي قد تؤثر على تنظيم الجينات في حالة المرض (على سبيل المثال، في الذئبة الحمامية المجموعية8). ونأمل أن هذا البروتوكول أتاك-seq سيساعد ويشجع المحققين المهتمين استخدام هذا الأسلوب قوية للنهوض البحوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل معتمد من قبل "مؤسسة العلوم إسرائيل" (منحة 748/14)، ومنح "ماري كوري التكامل" (CIG)-FP7-الناس-20013-CIG-618763 والأساسية برنامج التخطيط و "لجنة الميزانية" و "مؤسسة العلوم إسرائيل" منح رقم 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
