Summary
Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine in combinatie met high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een genoom-brede methode aan het licht brengen van toegankelijke chromatine. Dit is een stapsgewijze ATAC-seq-protocol, van moleculaire aan computationele uiteindelijk geoptimaliseerd voor menselijke lymfocyten (Th1/Th2). Dit protocol kan worden aangenomen door onderzoekers zonder voorafgaande ervaring in volgorde van volgende-generatie methoden.
Abstract
Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine met hoge gegevensdoorvoer sequencing (ATAC-seq) is een methode die wordt gebruikt voor de identificatie van open (toegankelijk) regio's van de chromatine. Deze regio's vertegenwoordigen regelgevende DNA elementen (bijvoorbeeld, initiatiefnemers, versterkers, locus controle regio's, isolatoren) welke transcriptie factoren binden. Toewijzing van het landschap toegankelijk chromatine is een krachtige aanpak voor blootleggen actieve regelgevende elementen over het genoom. Deze informatie dient als een onbevooroordeelde benadering voor het ontdekken van het netwerk van relevante transcriptiefactoren en mechanismen van de structuur van de chromatine waaraan gen expressie programma's. ATAC-seq is een robuuste en gevoelige alternatief voor DNase ik overgevoeligheid analyse in combinatie met de volgende-generatie sequentie (DNase-seq) en formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen (FAIRE-seq) voor genoom-brede analyse van de chromatine toegankelijkheid en de sequencing van micrococcal nuclease-gevoelige sites (MNase-seq) om te bepalen nucleosoom positionering. We presenteren een gedetailleerde ATAC-seq protocol geoptimaliseerd voor menselijke primaire immune d.w.z. CD4 +-lymfocyten cellen (T-helper 1 (Th1) en Th2 cellen). Dit uitgebreide protocol begint met de oogst van de cel, dan beschrijft de moleculaire procedure van chromatine tagmentation, bereiding van de monsters voor de volgende generatie sequencing, en bevat ook methoden en overwegingen voor de computationele analyses gewend het interpreteren van de resultaten. Bovendien, om te besparen tijd en geld, introduceerden we kwaliteitscontrole maatregelen voor de beoordeling van de bibliotheek van de ATAC-seq voorafgaand aan het rangschikken. Nog belangrijker is, kunnen de beginselen die in dit protocol gepresenteerd de aanpassing ervan aan andere menselijke immuun en niet-immuun primaire cellen en cellijnen. Deze richtsnoeren zullen ook bruikbaar zijn voor laboratoria die niet vakkundig met de volgorde van de volgende generatie methoden zijn.
Introduction
ATAC-seq1,2 is een krachtige methode waarmee identificatie van regelgevende3 open chromatine-regio's en nucleosoom positionering. Deze informatie wordt afgeleid van de locatie, identiteit en activiteiten van transcriptiefactoren toegepast. De gevoeligheid van de methode voor het meten van kwantitatieve verschillen in de structuur van de chromatine maakt de studie van de activiteit van de chromatine factoren, met inbegrip van chromatine remodelers modifiers, alsmede de transcriptionele activiteit van RNA polymerase II1. ATAC-seq biedt dus een krachtige en onbevooroordeelde benadering voor het ontcijferen van de mechanismen die transcriptionele verordening in elk celtype van belang regeren. We beschrijven van de aanpassing van ATAC-seq aan primaire menselijke Th1 en Th2 cellen.
ATAC-seq, hyperactieve Tn5 transposase geladen met adapters voor volgende-generatie sequencing (NGS) paren DNA fragmentatie met tagging van DNA met adapters (dat wil zeggen, het proces van "tagmentation")1. Na PCR versterking zijn de resulterende DNA-bibliotheken klaar voor de volgende generatie sequencing (Figuur 1). De preferentiële tagmentation voor toegankelijk chromatine is gedetecteerd door de analyse van lokale verrijking van ATAC-seq sequencing luidt als volgt.
De korte experimentele procedure en de behoefte aan minder grondstof, ten opzichte van andere methoden voor het meten van de chromatine toegankelijkheid en nucleosomal positionering zoals DNase-seq4, FAIRE-seq5en MNase-seq6, heeft het gebruik van ATAC-seq bevorderd in meerdere biologische systemen, met inbegrip van menselijke primaire cellen1,7 en klinische monsters8, evenals eencellige organismen9, planten10, fruitvliegen11 , en diverse zoogdieren12.
De identiteit van de transcriptie factoren die aan toegankelijk loci gebonden zijn kunnen worden ontdekt door het analyseren van de verrijking van hun bindende reeks motieven of ATAC-seq combineren met chromatine immunoprecipitation (ChIP) gevolgd door high-throughput DNA sequencing) ChIP-seq). Deze aanpak ingeschakeld de identificatie van geslacht-specifieke transcriptiefactoren belangrijk voor Haematopoiese in13van de muis. De onbevooroordeelde en mondiale aard van ATAC-seq kunt studeren genregulatie in organismen waarvoor reagentia zoals antilichamen ChIP p.a. niet beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld, evolutionaire variaties in cis-regelgevende gebieden zijn geïdentificeerd door het bestuderen van de craniale neurale kamcellen van mensen en chimpansees14, developmental variaties in regelgevende elementen tijdens de vroege muis embryogenese15, veranderingen in de regelgevende landschap tijdens een levenscyclus van eencellige C. owzarzaki9, en de evolutie van de initiatiefnemers en versterkers over 20 zoogdieren soorten12.
ATAC-seq ook behulpzaam geweest voor het meten van toegankelijkheid van de chromatine in afzonderlijke cellen, aldus onthullende variabiliteit binnen cel populaties, die meestal genoom-brede studies7,16 ontwijkt. ATAC-seq kan bovendien worden gebruikt om te bestuderen van de veranderingen die zich in de regelgevende gebieden DNA in ziekten voordoen, waarin monsters zeldzaam zijn. Bijvoorbeeld, ATAC-seq kan worden gebruikt om te studeren van veranderingen in de regelgevende landschap tijdens de eerste verschijnselen van acute myeloïde leukemie (AML)17 of Ras-gedreven oncogenese11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle procedures werden goedgekeurd door institutionele review board van Bar-Ilan Universiteit en het protocol volgt de richtsnoeren van de Commissie houdende goedkeuring van de experimenten.
1. zuivering van naïeve menselijke CD4 + cellen en polarisatie tot T-Helper 1 (Th1) en Th2 cellen
Opmerking: hier beschrijven we de procedure vanaf bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). De eerste stap bestaat uit het isoleren van CD4 + cellen met behulp van microbeads en kolommen die normaal gesproken geven ons meer dan 95% van CD4 +-cellen. Deze stap kan echter variëren volgens het voorkeursprotocol voor in elk lab. Het protocol voor T-cel activatie en polarisatie werd van Jenner et al. gewijzigd (2009) 18. isolatie van CD4 + cellen uit 10 miljoen PBMCs geeft aanleiding tot 4-6 miljoen van CD4 +-cellen. Ze zijn opgesplitst in twee maatkolven geteeld onder Th1 en Th2 polariserende voorwaarden opbrengst 3-5 miljoen Th1 en Th2 cellen binnen een week.
Opmerking: Cool-down de centrifuge tot 4 ° C voordat.
- Ontdooien 1 mL van menselijke PBMCs (10 7 cellen) in een tube van 50 mL met 10 mL van RPMI medium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine, 2 mM L-glutamine en 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met een steriele 25 mL pipet in 15 mL aangevuld RPMI voedingsbodem. De cellen (met steriele 25 mL pipet) overbrengen in een maatkolf van de cultuur T75.
- Laat de cellen overnachting in een bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- De zwevende cellen met een steriele 25 mL pipet overbrengen in tube 50 mL. Celaantal en levensvatbaarheid bepalen door trypan blauwe uitsluiting.
- Isoleren CD4 + cellen uit 10 miljoen leven niet-aanhanger PBMCs door positieve selectie met behulp van CD4 + microbeads en kolommen volgens de fabrikant ' s aanbevelingen (Zie Tabel van materialen/uitrusting) met de volgende wijzigingen: 10 7 PBMCs zijn gelabeld met 30 µL van CD4 microbeads in 120 µL van 0,5% BSA in PBS.
- Activeren de CD4 + T cellen gedurende 72 uur door rhIL-2 (10 ng/mL), plaat-gebonden anti-CD3 (5 µg/mL) en oplosbare anti-CD28 (2 µg/mL). Voor Th1 polarisatie, voeg rhIL-12 (20 ng/mL) en anti-IL-4 (10 µg/mL). Voor Th2 polarisatie, voeg rhIL-4 (40 ng/mL) en anti-IFN-γ (10 µg/mL).
- Cultuur van de cellen voor extra 7 dagen in de aanwezigheid van rhIL-2 (10 ng/mL) en de dezelfde polariserende cytokinen (rhIL-12 voor Th1 en Th2 rhIL-4).
2. Kernen isolatie
Opmerking: ATAC-seq wordt uitgevoerd met intact kernen. Lysis buffer met 0,05% nonylphenyl polyethyleenglycol was (Zie Tabel van materialen/uitrusting) voor het isoleren van de kernen van primaire menselijke Th1 en Th2 cellen gekalibreerd. Het is raadzaam om deze stap met de laboratoriumreagentia en cellen kalibreren. Een overmaat van onbeschadigde cellen van onvoldoende wasmiddel vermindert de efficiency van de reactie van de omzetting. Efficiëntie lysis van de cel wordt bepaald door het aantal kernen (trypan blauw positieve cellen) ten opzichte van het totale aantal cellen.
Opmerking: Bereiden de lysis-buffermengsel (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2). Cool-down een centrifuge met een swing-emmer rotor tot en met 4 ° C. de cellen in een centrifuge swing-emmer in plaats van een vaste hoek centrifuge pillering vermindert celkernen/verlies. Om te voorkomen dat de kernen of cel verlies, Pipetteer zorgvuldig wanneer het supernatant teruggooi.
- Toevoegen verse nonylphenyl polyethyleenglycol (om een eindconcentratie van 0,05%) en 100 x proteaseinhibitors (om een eindconcentratie van 1 x) aan de koude lysis buffer onmiddellijk vóór gebruik. Houd de buffer op ice.
- Aantal T-cellen om te bepalen hun bedrag en levensvatbaarheid trypan blauwe methode. Levensvatbaarheid die lager is dan 90% resulteert in hogere aspecifieke spijsvertering.
- Overdracht 0,5 x 10 6 T cellen (Th1 of Th2) tot 1,5 mL slangen. Spin down bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing. Spin down bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 1 mL van de cel van koude lysis-buffermengsel (met polyethyleenglycol nonylphenyl en proteaseinhibitors). Houd de buis op ijs. Pipet zachtjes te voorkomen dat de kernen.
- Snel nemen 10 µL en cellen met een geautomatiseerde cel teller tellen terwijl de microtube met lysed cellen op het ijs is. Deze stap mag niet meer dan vijf minuten om te voorkomen beschadiging van de kernen. Ten minste 80% van de cellen moeten worden lysed.
- Doorgaan onmiddellijk met de reactie van de omzetting. Houd de bereid kernen op de ice.
3. Omzetting reactie
Opmerking: In deze stap, geïsoleerde kernen worden geïncubeerd met prokaryote Tn5 transposase (TDE1) geladen met adapters voor NGS sequencing. Hyperactieve Tn5 gelijktijdig fragmenten van DNA en ligates adapters in toegankelijke regio's van het genoom (tagmentation proces). De verhouding tussen de kernen en Tn5 transposase is essentieel voor preferentiële decollete op toegankelijk chromatine. Dit protocol is gekalibreerd voor 100.000 kernen in een 100 μl reactie volume. Echter, de reactie kan worden teruggeschroefd.
- Temperatuur instellen in een thermische shaker tot 37 ° C.
- Transfer 100.000 kernen naar een microtube 1,5 mL.
- Centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en zachtjes de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
- De omzetting reactie onderdelen toevoegen aan de kernen als aangegeven in tabel 1.
- Resuspendeer door zachte pipetteren.
- Laat de reactie van de omzetting in een thermische shaker bij 37 ° C gedurende 30 minuten inwerken met zacht schudden (500 rpm).
Opmerking: DNA Cleanup wordt uitgevoerd door solid-phase omkeerbare immobilisatie kralen 19 (Zie Tabel van materialen/uitrusting) of PCR zuivering kolommen. Aan het einde van het opruimen, elueer de DNA fragmenten in 20 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8. EDTA voorkomen in de buffer elutie.
4. PCR verrijking van ATAC-seq bibliotheken
Opmerking: deze stap is gericht op het versterken van de ATAC-seq bibliotheek d.w.z., DNA-fragmenten met ingevoegde adapters. Dat het mengen van verschillende ATAC-seq-bibliotheken in de dezelfde volgorde van de volgende generatie lane (" multiplex ") gebruik geïndexeerde Primer 1 (Ad1_noMx) 1 voor alle monsters, en een andere geïndexeerd (barcoded) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) 1 voor elk monster. De primer sequenties vindt u in de aangevuld Tabel van materialen/uitrusting.
- Eerste PCR versterking
Opmerking: de concentratie van de werken van Primer 1 (Ad1_noMx) en Primer 2 is 25 µM. Alle de inleidingen zijn verdund uit oorspronkelijke voorraad van 100 µM tot 25 µM. In elk van de PCR reacties, Primer-1 (Ad1_noMx) en slechts één van de geïndexeerde Primer 2 te gebruiken.- De componenten van de PCR reactie als aangegeven in tabel 2 toevoegen aan een steriele PCR buis.
- Plaats PCR buisvideo in een thermische cycler en het uitvoeren van PCR versterking met behulp van de fietsen voorwaarden gedetailleerd in tabel 3.
- Beoordeling van aantal extra versterking cycli
Opmerking: het aantal extra cycli van PCR voldoende hoeveelheid bibliotheek fragmenten f moet opleverenof een succesvolle sequencing van de volgende generatie uitvoert, terwijl geminimaliseerd om te vermijden GC en grootte bias 20. De bepaling van het aantal PCR cycli (N) vereist voor optimale bibliotheek fragment versterking ervan gebeurt door kwantitatieve PCR (qPCR).- Verdun inleidingen 1 (Ad1_noMx) en 2 (gebruikt voor de versterking van de eerste bibliotheek) van 25 µM tot 6,25 µM.
- Aan optiektubus PCR of een plaat de onderdelen toevoegt, zoals vermeld in tabel 4.
- Plaats in een qPCR-instrument en de cyclus als aangegeven in tabel 5.
- Voor het inschatten van het vereiste aantal extra versterking cycli (N), plot cyclus nummer op de x-as en de relatieve fluorescentie (RFU) op de y-as.
- Het aantal extra versterking cycli (N) is 1/3 van het aantal cycli waartegen de reactie van qPCR het plateau bereikt. Figuur 2 geeft voorbeelden voor drie ATAC-seq-bibliotheken die plateau op ~ 2,350 relatieve fluorescentie eenheden, RFU (dikke groene lijn bereikt). Het aantal cycli van PCR waarin een derde van het maximale bedrag (783 RFU, gemarkeerd op y-as) wordt versterkt komt overeen met 8 cycli voor twee van de bibliotheken (rood en blauw amplificatie curven) en 9 cycli van PCR voor de derde bibliotheek (roze).
- Laatste PCR versterking
- versterken de resterende 45 µL van het PCR-reactie. Plaats een buis van de PCR versterking reactie van stap 4.1.2 in een thermische cycler met. Voer het programma van de PCR beschreven in tabel 6. Gebruik de vooraf bepaalde (stap 4.2.5) aantal amplificatie cycli (N).
5. Het formaat van de selectie van de bibliotheken van de ATAC-Seq
Opmerking: In onze ervaring, grootte selectie van versterkte ATAC-seq bibliotheken verbetert volgende-generatie rangschikkend resultaten omdat het elimineert ultrahoog moleculair gewicht bibliotheek fragmenten uit de definitieve ATAC-seq library.
Opmerking: De magnetische kralen opwarmen tot kamertemperatuur 30 min vóór gebruik toestaan.
Bereiden van verse 70% ethanol in nuclease-vrij water.
- Resuspendeer de magnetische kralen door het mengen van.
- Nuclease-gratis water toevoegt aan de bibliotheken van de ATAC-seq (verkregen in stap 4.3.1.) en breng 100 µL.
- Toevoegen 50 µL (0,5 x) van de geresuspendeerde DNA-bindende magnetische kralen aan 100 µL van versterkte bibliotheken. Meng door pipetteren op en neer ten minste 10 keer. Monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Indien nodig, snel spin down de slangen.
- Plaats de buis op een passende magnetische stand gedurende 2 minuten om te scheiden van de magnetische kralen van de bovendrijvende substantie. Na 2 min, overbrengen in het supernatant een nieuwe microtube.
- Meet het volume van het supernatans dat door pipetteren en toevoegen van 0.7 x van magnetische kralen. Meng door pipetteren op en neer ten minste 10 keer.
- Laat 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Plaats op een magnetische staan gedurende 2 minuten
- Na de 2 min incubatie, verwijder het supernatant. Toevoegen van 200 µL vers gemaakte 70% ethanol te wassen van de kralen, terwijl de buizen zijn op de magnetische stand.
- Houden de microtube aan de magneet voor 30 s en vervolgens negeren de ethanol. Herhaal stap 5.7.for twee definitieve ethanol wast.
- Verwijderen van de resterende ethanol en laat die de kralen luchtdroog gedurende 5 minuten, terwijl de buis aan de magneet is. Indien nodig, kort draaien de microtube. Verwijderen van de sporen van ethanol met een uiteinde van de pipet p10.
- Verwijder de microtube uit de magneet en voeg 22 µL van 10 mM Tris-HCl, pH 8. Doen niet elueer de ATAC-seq bibliotheken in buffer met EDTA.
- De buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur incuberen en plaatst u vervolgens op de magnetische stand.
- Wanneer de oplossing duidelijk is, 20 µL van geëlueerd bibliotheken overbrengen in een nieuwe steriele microtube.
- Winkel de grootte geselecteerd ATAC-seq bibliotheken bij -20 ° C.
6. Analyse van de kwaliteit van de ATAC-Seq-bibliotheken
- validatie van de kwaliteit van ATAC-seq bibliotheken door Real-Time PCR
Opmerking: het is belangrijk om te evalueren van de signaal / ruisverhouding van de bibliotheken van de ATAC-seq voorafgaand aan de volgende generatie sequencing. Dit wordt gedaan door het bepalen van de relatieve hoeveelheid DNA-fragmenten van toegankelijk en ontoegankelijk loci met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR). De ontoegankelijke loci (negatieve controle, chr1:48, 137, 860-48,137,934 en chr1:193, 093, 748-193,093,827) zijn versterkt door primerparen 1 en 2. De toegankelijke loci (positieve controle, chr19:30, 336, 166-30,336,253 en chr19:11546154-11546237) zijn versterkt door primerparen 3 en 4. Positieve en negatieve loci werden van chromatine toegankelijkheid (DHS-seq) profielen van menselijke CD4 + cellen (ENCODE toetredingen ENCSR000EQE en ENCSR000EQG) gedefinieerd. Negatieve primer 1 is gelegen in een grote hétérochromatique intergenic regio (230 kb van TRADB2 en 88 kb van FOXD2). Negatieve controle regio 2 is in binnen de eerste intron van CDC73 gen. Positieve primer paar 3 is in een regio van de open chromatine stroomafwaarts van het gen cycline E (CCNE1) terwijl positieve primer paar 4 is gecentreerd in de promotor van proteïne kinase C substraat 80K-H (PRKCSH). Nog belangrijker is, vertonen deze controle loci een vergelijkbaar patroon van toegankelijkheid andere menselijke celtypes van het coderen project 3, suggereren dat ze kunnen worden toegepast om te controleren van ATAC-seq bibliotheken uit een breed spectrum van menselijke celtypes. Primer efficiëntie en specificiteit van alle primerparen werd gecontroleerd door de qPCR op een seriële verdunning van genomic DNA (van menselijke Th-cellen) en een smeltende kromme analyse van verkregen versterkte producten.- Isoleren van genomic DNA met behulp van een commercieel beschikbare kit (Zie Tabel van materialen/uitrusting).
- Verdun de versterkte ATAC-seq bibliotheek 1:10 (1 µL bibliotheek + 9 µL van nuclease-gratis water) en genomic DNA te ~ 5 ng/µL.
- Bereiden reactiemengsel (tabel 7) voor elk paar positieve en negatieve controle primer, rekening houdend met dat de reacties worden uitgevoerd in drievoud.
- In qPCR thermische cycler volgens het protocol aanbevolen door qPCR master mix leverancier Incubate.
- Analyseren de resultaten in qPCR instrument ' s software (Zie Tabel van materialen/uitrusting). Kies genomic DNA als controlemonster. De verkregen waarden vertegenwoordigen een verrijking van toegankelijke regio's (versterkt door positieve controle inleidingen). Een voorbeeld is weergegeven in tabel 8.
Opmerking: Schatting van de gemiddelde bibliotheek grootte en concentratie: de grootteverdeling van DNA-fragmenten van ATAC-seq bibliotheken wordt bepaald door de hoge gevoeligheid geautomatiseerde elektroforese systemen volgens de fabrikant ' s instructies. Het is raadzaam voor het meten van de concentratie van het monster op een Fluorimeter met behulp van dsDNA ultragevoelige kit en ten minste 2 µL van elk DNA-monster.
Opmerking: Next-generation sequencing - voorafgaand aan de bibliotheken multiplexing, de molarity van elke ATAC-seq-bibliotheek te berekenen met behulp van de formule: (ng/µL x 10 6) / (660 x gemiddelde bibliotheek fragment lengte). Streven naar > 30 miljoen leest van elke ATAC-seq-bibliotheek te beoordelen van de open chromatine regio's in menselijke specimens. Als u bepalen wilt of de bibliotheek goed genoeg voor NGS sequencing is, in eerste instantie streven naar 10 miljoen ~ leest (5% van de sequencing baan op DNA sequencing instrument in snelle run modus). Houd er rekening mee dat als u wilt afleiden nucleosoom positionering, gekoppeld-eind rangschikken nodig 1 is.
7. Analyse van de resultaten verkregen Next-Generation Sequencing
- afleiden van de kwaliteit van de sequencing leest door de inspectie van de FastQC bestanden, afzonderlijk voor elke bibliotheek.
- Uitlijnen de leest aan menselijke referentie genoom (hg19 assemblage) met behulp van Bowtie 21 software in de Unix/Linux omgeving. De opdracht is ' bowtie -m 1 - q -S genoom directory reads.fastq output_aligned.sam '. Genoom directory staat voor de map waarin de genoom-indexen van Bowtie zijn opgeslagen. De parameter -m 1 is voor het niet toestaan van uitlijning van leest om meer dan één locus in het genoom - q voor het invoerbestand dat fastq opgemaakt zijn moet, -S is voor de uitvoer in SAM indeling.
- Verwijder dubbele leest met SAMtools 22 rmdup optie in de Unix/Linux omgeving. De opdrachten zijn ' samtools bekijken -S output_aligned.sam -b | samtools sorteren -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. De eerste opdracht, weergave, wordt de opmaak van de SAM in BAM-formaat dat is vervolgens gesorteerd op volgorde. De optie van rmdup wordt vervolgens toegepast op de gesorteerde BAM-bestand. Optioneel kunt een het luidt voor het transposon invoeging site, zoals beschreven in de oorspronkelijke ATAC-seq papier 1. Dit wordt gedaan met BEDtools opdrachten 23 in de Unix/Linux omgeving. De opdrachten zijn ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genoom > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. De eerste opdracht, bamTobed, wordt de opmaak van de BAM naar BED formaat, die vervolgens kan worden gebruikt voor de opdracht shiftBed. Het genoom-bestand is een bestand met scheidingstekens tabblad waarin de lengte van elk chromosoom in het genoom. Het bestand wordt meestal toegevoegd in de map BEDtools. - Uitvoeren piek bellen met behulp van model-gebaseerde analyse van ChIP-seq (MACS2) 24 software in de Unix/Linux omgeving op het verplaatste bestand van het BED met de volgende parameters:--nomodel--extsize 75--shift -30. Deze parameters worden gebruikt het luidt als volgt aanpassen zodat de transposon invoeging site in het midden van elke volgorde lezen is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het eindresultaat van dit protocol is een bibliotheek van de ATAC-seq van meestal 3-20 ng/µL. Wanneer uitvoeren op een systeem voor de analyse van de integriteit van het DNA (Zie Tabel van materialen/uitrusting), ze tonen ladder-achtige verschijning2 (figuur 3A). De gemiddelde grootte van DNA-fragmenten is meestal ~ 450-530 bp.
Goede controle van de kwaliteit van de bibliotheken van de ATAC-seq vóór het uitvoeren van de volgende generatie sequencing is belangrijk om tijd en geld besparen. Wij overwegen de bibliotheken geschikt voor de volgende generatie sequencing (NGS) wanneer de verrijking van positieve controle meer dan 25 - en 75 keer is (voor primer een paar 3 en 4, respectievelijk) ten opzichte van de negatieve controles (figuur 3B) en wanneer ze tonen de eerder vermeldden nucleosomal, ladder-achtige verschijning. Bij het analyseren van qPCR gegevens, zijn we ook verifiëren dat de Cq-waarden voor negatieve en positieve controles inleidingen vergelijkbaar in de reacties met de genomic DNA als een sjabloon zijn en dat de Cq voor de negatieve controle regio's (in de reacties met DNA van ATAC-seq waarden fragmenten) zijn constant tussen de experimenten. Bijvoorbeeld in het geval van plotseling lagere Cq waarden vermoeden we dat de kernen overdreven getransponeerde werden en dus DNA-fragmenten afkomstig uit heterochromatin regio's oververtegenwoordigd zijn. Bovendien, als het beeld van de gel (verkregen door hoog-gevoeligheids tape gebaseerde elektroforese) van ATAC-seq bibliotheken duidt op de aanwezigheid van de adapters (~ 120 bp), buitensporige aantasting van het DNA (de meerderheid van de fragmenten zijn ~ 200 bp), of grote fragmenten (meer dan 1 kb), wij de NGS stap zou niet blijven.
Daarnaast voeren wij altijd eerste NGS waarin we naar 10 miljoen leest per bibliotheek streven. De resultaten van deze volgorde bent bevredigend (het monster geeft alle parameters in FastQC rapportbestand en kunnen we 1000-2000 pieken krijgen na het uitvoeren van de piek bellen), de bibliotheken zijn sequenced dieper (meer dan 30 miljoen leest/ATAC-seq bibliotheek).
In de ATAC-seq experimenten op zoogdiercellen overal van ~ 30-70% van de gesequenceerd luidt kunnen afkomstig zijn uit mtDNA10. In tegenstelling, onze bibliotheken opgenomen 6-20% leest toegewezen aan het mitochondriaal genoom. Dit is lager dan de gerapporteerde 46% in de bibliotheek van de ATAC-seq van menselijke CD4 + T-lymfocyten1. Na het elimineren van deze verontreiniging van leest, bleven we met unieke leest ~ 7-32 miljoen toe te wijzen aan het menselijk genoom van referentie (58-91% van alle leest). Van deze, 0.1 - waren 2 miljoen leest (6,8% - 12% van alle luidt) in de ATAC-seq pieken (Figuur 4).
Figuur 1 . Workflow van experimentele stappen. Vertegenwoordiging van de belangrijkste stappen in dit protocol ATAC-seq. Stoppen punten zijn aangegeven door gele zeshoeken. Een optionele stap wordt vertegenwoordigd met een oranje zeshoek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Berekening van het aantal extra cycli van PCR vereist voor de definitieve verrijking van ATAC-seq bibliotheken. PCR versterking curven voor drie verschillende ATAC seq bibliotheken staan in rood, blauw en roze. De versterking reacties bereikt een plateau op 2.350 RFU (bovenste groene horizontale lijn). Het aantal extra cycli van PCR kruist met 783 RFU (2,350/3) op de curve versterking. Twee bibliotheken (rood en blauw) vereisen 8 extra versterking cycli, terwijl de derde bibliotheek (roze) 9 cycli vereist. Non-template besturingselement (NTC) wordt weergegeven als de lagere groene lijn. X-as, cyclus nummer. Y-as, RFU eenheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Kwaliteitscontrole analyse van ATAC-seq bibliotheken. (A) resultaten van tape gebaseerde geautomatiseerde Elektroforese van versterkte ATAC-seq-bibliotheken. L, ladder; A-D, Bibliotheken van biologische herhaalt uit Th1 en Th2 cellen. (B) de analyse van de kwaliteitscontrole van het qPCR van ATAC-seq bibliotheken. Genomic DNA en vier ATAC-seq bibliotheken werden versterkt door negatieve controle primerparen (1 en 2) en de positieve controle inleidingen (3 en 4). De verkregen waarden voor ATAC-seq bibliotheken (blauw) werden eerst op de niveaus van de amplificatie van genomic DNA genormaliseerd (willekeurig ingesteld op een waarde van 1; rood). Waarden voor de positieve controle regio's werden vervolgens genormaliseerd naar de negatieve controle regio's (onderste grafiek). Bibliotheken #1 en #2 werden gestuurd om NGS sequencing. De waarden vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Genome browser snapsh ots van toegankelijk chromatine regio's in cellen Th1 en Th2. ATAC-seq nummers worden weergegeven voor NFKB1, JUN, CD28, IFNG (uitgedruktin alleen Th1) en IL4 en IL13 (uitgedruktin alleen Th2) loci in Th1 en Th2 cellen (twee biologische wordt herhaald voor elk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| TD buffer | 50 | ΜL |
| TDE1 transposase | 5 | ΜL |
| Nuclease-gratis water | 45 | ΜL |
| Totaal volume | 100 | ΜL |
Tabel 1: Voorbereiding van omzetting reactiemengsel.
| ATAC-seq bibliotheek | 15 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabel 2: Onderdelen van de eerste PCR reactie mix (stap 5.1.1.).
| CYCLUS STAP | TEMPERATUUR | TIJD | CYCLI |
| Verlenging * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 30 s | |
| Denaturatie | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Gloeien | 63 ° C | 30 s | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 3 min | |
| Houd | 4 ° C | ∞ | |
| * Deze stap is vereist om uit te breiden | |||
| einden van de inleidingen na omzetting reactie. | |||
Tabel 3: PCR fietsen voorwaarden voor versterking van de eerste bibliotheek (stap 5.1.2.)
| Aliquot van PCR reactie (stap 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) ** | 1 | ΜL |
| Primer 2 | 1 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 7.5 | ΜL |
| Nuclease-gratis water | 0,5 | ΜL |
| Totaal volume | 15 | ΜL |
| * Niet-sjabloon instellen in plaats van de DNA-sjabloon toevoegen Ultra zuiver water. | ||
| ** De eindconcentratie van elke primer is 417 nM. | ||
| Gebruik de voorkeur master mix voor qPCR. | ||
| Polymerase, dNTPs MgCl2en fluorescente kleurstof moet bevatten. | ||
Tabel 4: Bereiding van het reactiemengsel qPCR (stap 5.2.2).
| CYCLUS STAP | TEMPERATUUR | TIJD | CYCLI |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Gloeien | 63 ° C | 30 s | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 3 min | |
| Houd | 4 ° C | ∞ |
Tabel 5: Fietsen voorwaarden voor qPCR gebaseerde assesment van extra aantal amplificatie cycli (N) (stap 5.2.3.)
| CYCLUS STAP | TEMPERATUUR | TIJD | CYCLI |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturatie | 98 ° C | 10 s | N |
| Gloeien | 63 ° C | 30 s | |
| Uitbreiding | 72 ° C | 3 min | |
| Houd | 4 ° C | ∞ |
Tabel 6: Fietsen voorwaarden voor de uiteindelijke PCR verrijking stap (5.3.).
| Voor een enkele PCR reactie: | ||
| Verdunning van de bibliotheek van genomic DNA | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 of F2 of F3 of F4) * | 0.3 | ΜL |
| 10 μM Primer R (R1 of R2 of R3 of R4) ** | 0.3 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 5 | ΜL |
| Nuclease-gratis water | 1.9 | ΜL |
| Totaal volume | 10 | ΜL |
| * De uiteindelijke concentratie voor elke primer in het reactiemengsel is 300 nM. | ||
| ** Als primer F1 dan de R-primer R1 enz moet. | ||
| Gebruik liever 2 x master mix geschikt voor het instrument van de qPCR in uw laboratorium. | ||
Tabel 7: Reactie voorwaarden voor QC analyse (stap 7.1.3.).
| Doel | Monster | Bedoel Cq | CQ SEM | Relatieve hoeveelheid | Genormaliseerd | |
| 1 | Negatieve controle | ATAC-seq | 30.39 | 0.11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30.4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0.09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | Positieve controle | ATAC-seq | 23.27 | 0.03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30,7 | 0,06 | 0,01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21,55 | 0,24 | 1 | 750.31 | |
Tabel 8: Berekening van de verrijking van de positieve controle op negatieve controles (stap 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol van de ATAC-seq hier beschreven is met succes werkzaam zijn voor de analyse van toegankelijk chromatine in primaire cellen (menselijke Th1, Th2 cellen en B-cellen) alsmede de gekweekte cellijnen (MCF10A van menselijke borstkankercellen en U261 glioblastoma cellen). ATAC-seq toe te passen op andere celtypes kan eisen sommige protocolverbetering, vooral in de lysis stap. Als de concentratie van niet-ionogene wasmiddel te hoog is, is er mogelijk een hoger percentage van mitochondriaal DNA besmetting. Dit kan worden verminderd door het verlagen van de detergenten concentratie in de lysis-buffermengsel zonder vermindering van de opbrengst van de kernen. In onze ervaring gaf lysis-buffermengsel met 0,05 procent van wasmiddel het meest bevredigende resultaten. Daarnaast draaien de kernen in een swing-emmer in plaats van vaste hoek rotor toegestaan vermindering van de G-kracht tot 500, die de mitochondriën in de pellet verminderd. Onderzoekers kunnen ook andere soorten detergentia, bijvoorbeeld, digitonin17testen. Nochtans, zelfs met geoptimaliseerde lysis voorwaarden, mtDNA besmetting is onvermijdelijk. Om het mtDNA volledig te verwijderen, kunnen de CRISPR/Cas9-systeem gebruikte15. In dit geval worden ATAC-seq bibliotheken geïncubeerd met sgRNAs target mtDNA te Cas9 nuclease te verteren mtDNA15.
Het aantal kernen vereist voor dit protocol ATAC-seq (100.000) kan worden beperkt in gevallen waar celaantal van klinische monsters schaars7 is. ATAC-seq heeft met succes vergroot of verkleind tot 5.000 en 500 cellen1,13,17 doordat de reactie volume1,13, uitvoeren van Schijfopruiming met magnetische kralen in plaats van met kolommen 13, of vermijden de opschonen stap1. Bovendien, kan eencellige ATAC-seq (scATAC-seq) worden uitgevoerd met behulp van een microfluidic-apparaat om te scheiden van individuele atoomkernen16. Met name, vereisen andere methoden voor het meten van de chromatine toegankelijkheid, zoals DNase-seq en FAIRE-seq, meer grondstof en een paar dagen voor het uitvoeren van het experiment.
Het wordt nu alom gewaardeerd dat vertekeningen in verschillende NGS methoden gemeenschappelijke verschijnselen25 zijn. Een van de oorzaken van deze verschillen in verschillende chromatine toegankelijkheid maatregelen is de enzymatische decollete stap25. Het is gebleken dat DNase I decollete bias26 toont en nu wordt erkend dat Tn5 transposase decollete voorkeur toont evenals27. Gelukkig kan de potentiële bias rekenkundig worden geïdentificeerd door middel van een pijpleiding van de kwaliteitscontrole zoals ChiLin28. Een andere gemeenschappelijke bron van bias is de PCR versterking stap20,25. Dit manifesteert zich vaak als een bias voor de amplificatie van GC-rijke25 fragmenten. Aangezien de bias met elke stap van PCR versterking verhoogt, we doen niet hoger zijn dan 9 extra cycli (N) de definitieve PCR versterking van ATAC-seq bibliotheken.
De juiste verhouding tussen Tn5 transposase en kernen is essentieel voor succesvolle ATAC-seq2. Een overmaat van enzym zou leiden tot "over omzetting" in ontoegankelijke loci en hoge achtergrond. Dit wordt weerspiegeld in de hoge versterking van de negatieve controle regio's in de qPCR kwaliteitscontrole stap. Een overmaat van kernen zou leiden tot "onder omzetting". In dit geval ver decollete sites zal leiden tot minder PCR-versterkte fragmenten en lage bibliotheek complexiteit. Om te bepalen van het aantal kernen nauwkeurig, introduceerden we een extra tellen stap na lysis van de cel en vóór de omzetting reactie.
Chromatine toegankelijkheid is een belangrijke epigenetische regelgevende laag, als hierdoor de activiteit van transcriptie regelgevers op specifieke genomic locaties. De opeenvolging van DNA binnen het profiel toegankelijk chromatine biedt dus een schat aan informatie over de identiteit en doel loci van tientallen mogelijk transcriptiefactoren. Het combineren van deze informatie (verkregen door de ATAC-seq) met een RNA expressie profiel maakt een focus op de relevante transcriptiefactoren die verder kunnen worden geanalyseerd door ChIP-seq13,22. Daarnaast zijn slechts 10% van de ziekte-geassocieerde polymorfismen in de codering genoom30. ATAC-seq dus toe te passen op klinische monsters kan onthullen welke van de niet-coderende varianten zijn regelgevende elementen die invloed kunnen hebben op genregulatie in de deelstaat de ziekte (bijvoorbeeld systemische lupus erythematosus8). Wij hopen dat dit protocol ATAC-seq zal helpen en interesse onderzoekers stimuleren met deze krachtige methode om hun onderzoek vooraf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Israël Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie integratie verlenen (CIG) - FP7-mensen-20013-CIG-618763 en CORE programma van de Planning en budgettering Comité en The Israel Science Foundation verlenen nr. 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
