Summary
Analisi per Transposase-accessibile della cromatina accoppiato con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo di genoma per scoprire accessibile della cromatina. Questo è un protocollo di ATAC-seq passo dopo passo, da molecolari all'analisi computazionale del finale, ottimizzato per i linfociti umani (Th1/Th2). Questo protocollo può essere adottato da ricercatori senza precedente esperienza nei metodi di sequenziamento di nuova generazione.
Abstract
Dosaggio per cromatina Transposase-accessibile con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è un metodo utilizzato per l'identificazione di regioni aperte (accessibile) della cromatina. Queste regioni rappresentano elementi di DNA regolatori (ad es., promotori, enhancers, locus control regioni, Isolatori) a cui trascrizione si legano fattori. Il paesaggio di cromatina accessibile la mappatura è un approccio potente per scoprire elementi regolatori attivi in tutto il genoma. Questa informazione serve come un approccio imparziale per scoprire la rete di fattori di trascrizione pertinenti e meccanismi della struttura della cromatina che governano programmi di espressione genica. ATAC-seq è un'alternativa robusta e sensibile alla dnasi analisi di ipersensibilità accoppiato con formaldeide-assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE-seq) per l'analisi del genoma della cromatina e sequenziamento di nuova generazione (DNasi-seq) accessibilità e per il sequenziamento di micrococcal siti sensibili nucleasi (MNase-seq) per determinare il posizionamento nucleosoma. Vi presentiamo un dettagliato protocollo di ATAC-seq ottimizzato per cellule umane primarie immuni cioè CD4 + linfociti (T helper 1 (Th1) e cellule Th2). Questo protocollo completo inizia con la raccolta delle cellule, quindi descrive la procedura molecolare di cromatina tagmentation, preparazione del campione per il sequenziamento di nuova generazione e include anche metodi e considerazioni per l'analisi computazionali utilizzati per interpretare i risultati. Inoltre, per risparmiare tempo e denaro, abbiamo introdotto misure di controllo di qualità per valutare la libreria ATAC-seq prima del sequenziamento. Importante, i principi esposti nel presente protocollo consentono il suo adattamento ad altre cellule primarie umane immuni e non immuni e linee cellulari. Queste linee guida sarà anche utile per i laboratori che non sono abili con metodi di sequenziamento di nuova generazione.
Introduction
ATAC-seq1,2 è un metodo affidabile che consente l'identificazione di regioni di cromatina aperta regolamentare3 e posizionamento nucleosoma. Questa informazione viene applicata per dedurre la posizione, identità e attività di fattori di trascrizione. Sensibilità del metodo di misurazione quantitativa delle variazioni nella struttura cromatinica permette lo studio dell'attività dei fattori della cromatina, compreso remodelers della cromatina e modificatori, come pure l'attività trascrizionale di RNA polimerasi II1. Così ATAC-seq fornisce un approccio potente e imparziale per decifrare i meccanismi che governano la regolazione trascrizionale in qualsiasi tipo di cellula di interesse. Descriviamo l'adattamento di ATAC-seq per cellule umane primarie di Th1 e Th2.
ATAC-seq, iperattivo Tn5 transposase caricato con adattatori per frammentazione del DNA di sequenziamento di nuova generazione (NGS) coppie con la codifica del DNA con adattatori (cioè, il processo di "tagmentation")1. In seguito l'amplificazione di PCR, le librerie di DNA risultante sono pronte per il sequenziamento di nuova generazione (Figura 1). Il tagmentation preferenziale della cromatina accessibile viene rilevato dall'analisi dell'arricchimento locale di letture di sequenziamento ATAC-seq.
La breve procedura sperimentale e requisito per meno materiale di partenza, rispetto al altri metodi per misurare l'accessibilità della cromatina e posizionamento nucleosomal dnasi-seq4, FAIRE-seq5e MNase-seq6, ha promosso l'uso di ATAC-seq in più sistemi biologici tra cui cellule primarie umane1,7 e campioni clinici8, così come organismi unicellulari9, piante10, mosche della frutta11 e vari mammiferi12.
L'identità della trascrizione, fattori che sono associati ai loci accessibile possono essere scoperta dalla analizzando l'arricchimento dei loro motivi di sequenza di associazione o combinando ATAC-seq con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da (sequenziamento del DNA di alto-rendimento ChIP-seq). Questo approccio ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione lineage-specifici importanti per l'ematopoiesi in mouse13. La natura imparziale e globale di ATAC-seq permette di studiare la regolazione genica negli organismi per i quali i reagenti come gli anticorpi per l'analisi di ChIP non sono disponibili. Ad esempio, variazioni di evolutive in cis-regioni regolarici sono state identificate attraverso lo studio di cellule neurali craniche della cresta da esseri umani e scimpanzé14, variazioni inerenti allo sviluppo di elementi regolatori durante primo mouse l'embriogenesi15, cambia nel panorama normativo durante un ciclo di vita di unicellulari owzarzaki c.9e l'evoluzione dei promotori e rinforzatori attraverso 20 mammifero specie12.
ATAC-seq è stato strumentale per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, così rivelando variabilità all'interno di popolazioni di cellule, che solitamente sfugge genoma studi7,16. Inoltre, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti che si verificano in condizioni di malattia, in cui i campioni sono rari nelle regioni regolatrici del DNA. Ad esempio, ATAC-seq può essere utilizzato per studiare i cambiamenti nel panorama normativo durante l'insorgenza della leucemia mieloide acuta (AML)17 o Ras-driven oncogenesi11.
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Protocol
tutte le procedure sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Bar Ilan e il protocollo segue linee guida fornite dal comitato che approva gli esperimenti.
1. purificazione di ingenuo CD4 + cellule umane e polarizzazione di cellule Th2 e T Helper 1 (Th1)
Nota: Qui descriviamo la procedura a partire da cellule mononucleari del sangue periferico umano congelato (PBMCs). Il primo passo consiste nell'isolare le cellule CD4 + utilizzando microsfere e colonne che di solito dare noi più del 95% delle cellule di CD4 +. Tuttavia, questo passaggio può variare secondo il protocollo preferito in ogni laboratorio. Il protocollo per l'attivazione delle cellule T e la polarizzazione è stato modificato da Jenner et al. (2009) 18. isolamento di CD4 + cellule da 10 milioni PBMCs dà luogo a 4 milioni di cellule CD4 +. Sono diviso in due boccette e cresciuti sotto Th1 e di polarizzazione Th2 condizioni ottenendo 3 milioni cellule Th1 e Th2 in appena una settimana.
Nota: raffreddare la centrifuga a 4 ° C prima di iniziare.
- Scongelare 1 mL di PBMCs umano (10 7 cellule) in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di medium RPMI supplementato con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e siero bovino fetale inattivati 10%. Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con una pipetta sterile 25 mL in 15 mL di medium RPMI completato. Trasferire le cellule (con una pipetta sterile 25 mL) in un pallone di cultura T75.
- Lasciare le celle durante la notte in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
- Trasferire le cellule galleggiante con una pipetta sterile da 25 mL per tubo da 50 mL. Determinare il numero di cell e attuabilità di esclusione del blu di trypan.
- Isolare CD4 + cellule da 10 milioni vivono antiaderente PBMCs di selezione positiva utilizzando microsfere di CD4 + e colonne secondo il produttore ' consigli s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) con i seguenti modifiche: 10 7 PBMCs sono etichettati con 30 µ l di microsfere di CD4 in 120 µ l di 0,5% BSA in PBS.
- Per attivare le cellule T CD4 + per 72 h rhIL-2 (10 ng/mL), associato a piastra anti-CD3 (5 µ g/mL) e solubile anti-CD28 (2 µ g/mL). Per polarizzazione Th1, aggiungere rhIL-12 (20 ng/mL) e anti-IL-4 (10 µ g/mL). Per polarizzazione Th2, aggiungere rhIL-4 (40 ng/mL) e anti-IFN-γ (10 µ g/mL).
- Le cellule della coltura per ulteriori 7 giorni in presenza di rhIL-2 (10 ng/mL) e le stesse citochine polarizzante (rhIL-12 per Th1 e rhIL-4 per Th2).
2. Isolamento di nuclei
Nota: ATAC-seq viene eseguita con i nuclei intatti. Lysis buffer contenente 0,05% nonylphenyl polietilenglicole (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) è stato calibrato per isolare nuclei da cellule umane primarie di Th1 e Th2. Si consiglia di calibrare questo passaggio con i reagenti di laboratorio e le cellule. Un eccesso di cellule intatte da detersivo insufficiente diminuisce l'efficienza della reazione di trasposizione. Efficienza di lisi delle cellule è determinata dal numero dei nuclei (cellule positive del blu di trypan) rispetto al numero totale delle cellule.
Nota: Preparare il tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 millimetri di NaCl, 3 mM MgCl 2). Raffreddare una centrifuga con rotore a battente-benna a 4 ° C. cubettatura le cellule in una centrifuga di swing-secchio invece di una centrifuga ad angolo fisso riduce la perdita di nuclei e delle cellule. Per evitare i nuclei o perdita delle cellule, Pipettare attentamente quando scartare il surnatante.
- Aggiungi fresco nonylphenyl polietilenglicole (a una concentrazione finale di 0.05%) e inibitori della proteasi (a una concentrazione finale di 1 x) per il buffer di lisi freddo immediatamente prima dell'uso: 100x. Mantenere il buffer su Ice.
- Cellule di T totali per determinarne la quantità e la redditività mediante metodo del blu di trypan. Vitalità che è inferiore al 90% di risultati superiore non specifico digestione.
- Trasferimento 0,5 x 10 6 T cellule (Th1 o Th2) per microprovette da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di freddo tampone fosfato salino (PBS) soluzione. Rotazione verso il basso a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi freddo (contenente nonylphenyl polietilene glicole e inibitori della proteasi). Tenere il tubo sul ghiaccio. Pipetta delicatamente per evitare di interrompere i nuclei.
- Rapidamente prendere 10 µ l e contare le celle con un contatore di cellule automatizzato mentre nella microprovetta con le cellule lisate è il ghiaccio. Questo passaggio non deve superare i cinque minuti per evitare di danneggiare i nuclei. Almeno l'80% delle cellule dovrebbe essere lisati.
- Continua immediatamente con la reazione di trasposizione. Mantenere i nuclei preparati sul ghiaccio.
3. Reazione di trasposizione
Nota: In questo passaggio, nuclei isolati sono incubati con procariotiche Tn5 transposase (TDE1) caricato con adattatori per il sequenziamento NGS. Tn5 iperattivo, contemporaneamente, frammenti di DNA e lega adattatori in regioni accessibili del genoma (processo tagmentation). Il rapporto tra nuclei e Tn5 transposase è critico per la scissione preferenziale alla cromatina accessibile. Questo protocollo è calibrato per 100.000 nuclei in un volume di reazione 100 μL. Tuttavia, la reazione può essere ridimensionata.
- Set temperatura in uno shaker termale a 37 ° C.
- Trasferire 100.000 nuclei ad una microprovetta 1,5 mL.
- Centrifuga a 500 x g per 10 min a 4 ° C e delicatamente rimuovere il supernatante.
- Aggiungere i componenti di reazione di trasposizione dei nuclei come specificato nella tabella 1.
- Risospendere pipettando delicato.
- Incubare la reazione di trasposizione in uno shaker termale a 37 ° C per 30 min con lieve agitazione (500 giri/min).
Nota: Pulizia del DNA viene eseguita da fase solida reversibile immobilizzazione perline 19 (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature) o colonne di purificazione di PCR. Al termine della pulizia, eluire i frammenti di DNA in 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitare di EDTA in tampone di eluizione.
4. Arricchimento di PCR delle librerie ATAC-seq
Nota: questo passaggio si rivolge per amplificare i frammenti di ATAC-seq libreria cioè DNA con adattatori inseriti. Per consentire la miscelazione di diverse librerie di ATAC-seq nella stessa corsia di sequenziamento di nuova generazione (" multiplexing ") uso meno Primer 1 (Ad1_noMx) 1 per tutti i campioni, e una diversa indicizzati (codice a barre) 2 Primer (Ad 2.1-2.24) 1 per ogni campione. Le sequenze dell'iniettore sono fornite nell' completati Tabella di materiali/attrezzature.
- L'amplificazione di PCR iniziale
Nota: la concentrazione di lavoro di Primer 1 (Ad1_noMx) e 2 Primer è 25 µM. Tutti i primer sono diluiti da originale stock di 100 µM a 25 µM. In tutte le reazioni di PCR, utilizzare Primer 1 (Ad1_noMx) e solo uno dei 2 Primer indicizzata.- Aggiungere i componenti della reazione PCR come specificato nella tabella 2 in una provetta sterile da PCR.
- Posto PCR tubo in un termociclatore ed eseguire l'amplificazione di PCR utilizzando i ciclismo condizioni dettagliate nella tabella 3.
- Valutazione del numero di cicli di amplificazione aggiuntiva
Nota: il numero di ulteriori cicli di PCR dovrebbe produrre sufficienti quantità di libreria frammenti fo un successo sequenziamento di nuova generazione esegue, mentre ridotti al minimo per evitare GC e taglia bias 20. La determinazione del numero di cicli PCR (N) richiesti per l'amplificazione del frammento biblioteca ottimale avviene mediante PCR quantitativa (qPCR).- Diluire 1 Primer (Ad1_noMx) e 2 (usato per l'amplificazione iniziale Biblioteca) da 25 µM a 6.25 µM.
- Aggiungere i componenti a tubi ottici di PCR o un piatto, come indicato nella tabella 4.
- Posto in un ciclo come specificato nella tabella 5 e strumento di qPCR.
- Per stimare il numero di cicli di amplificazione aggiuntiva (N), tracciare il numero di cicli sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y.
- Il numero di amplificazione ulteriore cicli (N) è 1/3 del numero di cicli in cui la reazione di qPCR raggiunto il plateau. Figura 2 fornisce esempi per tre librerie di ATAC-seq che raggiungessero plateau a ~ 2.350 unità relativa fluorescenza, RFU (linea verde spessa). Il numero di cicli PCR in cui un terzo dell'importo massimo (783 RFU, segnato sull'asse y) è amplificato corrisponde a 8 cicli per due delle librerie (curve di amplificazione rosso e blu) e 9 cicli PCR per la libreria terza (rosa).
- L'amplificazione di PCR finale
- amplificare il restante 45 µ l della reazione PCR. Inserire un tubo PCR contenente la reazione di amplificazione dal punto 4.1.2 in un termociclatore. Eseguire il programma PCR descritto nella tabella 6. Utilizzare il numero di determinati in precedenza (punto 4.2.5) di cicli di amplificazione (N).
5. Taglia selezione delle biblioteche di ATAC-Seq
Nota: nella nostra esperienza, selezione della dimensione di amplificato ATAC-seq librerie migliora risultati di sequenziamento di nuova generazione perché Elimina frammenti di libreria ad alto peso molecolare dalla finale ATAC-seq biblioteca.
Nota: Lasciare i branelli magnetici a temperatura ambiente 30 min prima dell'uso.
Preparare fresco etanolo al 70% in acqua priva di nucleasi.
- Risospendere i branelli magnetici mescolando.
- Aggiungere acqua priva di nucleasi per le librerie di ATAC-seq (ottenute al punto 4.3.1.) e portare fino a 100 µ l.
- Aggiungere 50 µ l (0.5 x) di sedimento biglie magnetiche di legame al DNA a 100 µ l di amplificato librerie. Mescolare pipettando su e giù almeno 10 volte. Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente. Se necessario, ruota velocemente giù le microprovette.
- Inserire il tubo su un appropriato supporto magnetico per 2 min separare i branelli magnetici dal surnatante. Dopo 2 minuti, trasferire il surnatante ad una nuova microprovetta.
- Misurare il volume del surnatante pipettando e aggiungere 0,7 x di biglie magnetiche. Mix pipettando su e giù almeno 10 volte.
- Incubare 5 min a temperatura ambiente. Posto su un supporto magnetico per 2 min.
- Dopo il 2 min di incubazione, scartare il surnatante. Aggiungere 200 µ l preparata etanolo al 70% per lavare le perle mentre i tubi sono su supporto magnetico.
- Tenere il conetti sul magnete per 30 s e poi scartare l'etanolo. Ripetere il passaggio 5.7.for due lavaggi di etanolo finale.
- Rimuovere completamente le rimanenti etanolo e lasciare che asciugare all'aria le perline per 5 min mentre il tubo è sul magnete. Se necessario, girare brevemente nella microprovetta. Rimuovere le tracce di etanolo con una punta di pipetta p10.
- Rimuovere la provetta dal magnete e 22 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8. Non eluire le librerie di ATAC-seq in tampone contenente EDTA.
- Incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e poi mettete sul supporto magnetico.
- Quando la soluzione è limpida, trasferire una nuova microprovette sterili 20 µ l di librerie eluite.
- Store la dimensione selezionata ATAC-seq librerie a -20 ° C.
6. Analisi della qualità delle librerie ATAC-Seq
- convalida della qualità dell'ATAC-seq librerie di Real-Time PCR
Nota: è importante valutare il rapporto segnale-rumore delle librerie ATAC-seq prima della prossima generazione sequenziamento. Questo viene fatto determinando la relativa quantità di frammenti di DNA da loci accessibile e inaccessibili mediante PCR quantitativa (qPCR). I loci inaccessibili (controllo negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 e chr1:193, 093, 748-193,093,827) sono amplificati da coppie di primer 1 e 2. I loci accessibili (controllo positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 e chr19:11546154-11546237) sono amplificati da coppie di primer 3 e 4. Loci positivi e negativi sono stati definiti dai profili di accessibilità (DHS-seq) cromatina delle cellule CD4 + umane (ENCODE adesioni ENCSR000EQE ed ENCSR000EQG). Negativo iniettore 1 si trova in una grande regione intergenica heterochromatic (230 kb da TRADB2 e 88 kb da FOXD2). Regione di controllo negativo 2 è all'interno del primo introne del gene CDC73. A valle del gene di Cyclin E (CCNE1) mentre la coppia di primer positivo 4 positivo coppia di primer 3 è all'interno di una regione aperta della cromatina è centrato all'interno il promotore della proteina chinasi C substrato 80K-H (PRKCSH). D'importanza, questi loci di controllo mostrano un modello simile di accessibilità in altri tipi di cellule umane del progetto ENCODE 3, suggerendo che possono essere applicate per monitorare ATAC-seq librerie da un ampio spettro di tipi della cellula umana. Primer efficienza e specificità di tutte le coppie di primer è stata verificata da qPCR su una diluizione seriale di DNA genomic (da cellule umane Th) e un'analisi della curva di fusione dei prodotti amplificati ottenuti.- Isolare DNA genomico utilizzando un disponibili in commercio kit (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature).
- Diluire l'ATAC-seq amplificato libreria 01:10 (1 µ l libreria + 9 µ l di acqua priva di nucleasi) e DNA genomico a ~ 5 ng / µ l.
- Preparare la miscela di reazione (tabella 7) per ogni coppia di primer di controllo positivi e negativi, tenendo conto che le reazioni vengono eseguite in triplice copia.
- Incubare in termociclatore qPCR secondo il protocollo consigliato dal fornitore di mix master qPCR.
- Analizzare i risultati in qPCR strumento ' software s (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature). Scegliere il DNA genomico come un campione di controllo. I valori ottenuti rappresentano un arricchimento delle regioni accessibili (amplificati di primer di controllo positivo). Un esempio è illustrato nella tabella 8.
Nota: Stima della libreria di media dimensione e concentrazione: la distribuzione delle dimensioni dei frammenti del DNA dalle librerie di ATAC-seq è determinata dai sistemi automatizzati elettroforesi ad alta sensibilità secondo il produttore ' s istruzioni. Si consiglia di misurare la concentrazione del campione su un fluorometro utilizzando kit di dsDNA ad alta sensibilità e almeno 2 µ l di ciascun campione di DNA.
Nota: Sequenziamento di nuova generazione - prima del funzionamento in multiplex le librerie, calcolare la molarità di ciascuna libreria di ATAC-seq utilizzando la formula: (ng / µ l x 10 6) / (660 x libreria media frammento lunghezza). Obiettivo per > 30 milioni letture di ciascuna libreria di ATAC-seq per valutare la cromatina aperta regioni di campioni umani. Se si desidera determinare se la libreria è abbastanza buona per il sequenziamento NGS, inizialmente obiettivo per letture 10 milioni (5% della corsia di sequenziamento a strumento di sequenziamento del DNA in modalità di esecuzione rapida). Tenete a mente che per dedurre nucleosoma posizionamento, accoppiato-fine sequenziamento è necessaria 1.
7. Analisi dei risultati di sequenziamento Next-Generation ottenuti
- dedurre la qualità del sequenziamento legge controllando i file FastQC, separatamente per ogni libreria.
- Allineare le letture al genoma umano riferimento (Assemblea hg19) utilizzando Bowtie 21 software in ambiente Unix/Linux. Il comando è ' bowtie -m 1 - q -S genoma directory reads.fastq output_aligned.sam '. Directory di genoma sta per la cartella dove sono memorizzati gli indici di genoma di Bowtie. Il parametro -m 1 è per non permettere che l'allineamento di letture per più di un locus nel genoma, - q è per il file di input che deve essere nel formato fastq -S è per l'output in formato SAM.
- Rimuovere duplicate letture utilizzando SAMtools 22 rmdup opzione in ambiente Unix/Linux. I comandi sono ' samtools Mostra output_aligned.sam -b -S | samtools ordinare -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Il primo comando, Visualizza, cambia il formato di SAM in formato BAM che viene quindi ordinata. L'opzione di rmdup è quindi applicato il file ordinato di BAM. Opzionalmente si possono regolare le letture per il sito di inserzione del trasposone, come descritto nell'originale carta di ATAC-seq 1. Questa operazione viene eseguita utilizzando BEDtools i comandi 23 in ambiente Unix/Linux. I comandi sono ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i genoma di output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Il primo comando, bamTobed, cambia il formato BAM in formato letto, che può quindi essere utilizzato per il comando di shiftBed. Il file di genoma è un file delimitato da tabulazioni che contiene la lunghezza di ciascun cromosoma nel genoma. Di solito viene aggiunto il file nella directory BEDtools. - Eseguire chiamate di picco mediante analisi basata su modello di ChIP-seq (MACS2) 24 software nell'ambiente di Unix/Linux sul file letto spostato con i seguenti parametri: - nomodel - extsize 75-- spostamento -30. Questi parametri vengono utilizzati per regolare le letture, in modo che il sito di inserzione del trasposone è al centro di ogni lettura di sequenziamento.
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Representative Results
Il risultato finale di questo protocollo è una libreria di ATAC-seq di in genere 3-20 ng / µ l. Quando eseguito su un sistema per l'analisi dell'integrità del DNA (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature), essi mostrano la scala-come l'apparenza2 (Figura 3A). La dimensione media dei frammenti del DNA è in genere ~ 450-530 bp.
Controllo di qualità adeguata delle librerie ATAC-seq prima di eseguire il sequenziamento di nuova generazione è importante per risparmiare tempo e denaro. Consideriamo che le librerie adatto per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) quando l'arricchimento dei controlli positivi è più di 25 e 75 volte (per primer coppie 3 e 4, rispettivamente) rispetto al controllo negativo (Figura 3B) e quando mostrano la in precedenza nucleosomal, scala-come aspetto. Quando si analizzano dati qPCR, stiamo anche verificando che i valori di Cq per primer di controllo positivi e negativi sono simili nelle reazioni con il DNA genomico come modello e che il Cq valori per le regioni di controllo negativo (nelle reazioni con ATAC-seq DNA frammenti) sono costanti tra gli esperimenti. Ad esempio, nel caso di valori di Cq improvvisamente inferiori, abbiamo il sospetto che i nuclei erano over-trasposti e così sono sovrarappresentati frammenti di DNA provenienti dalle regioni di eterocromatina. Inoltre, se l'immagine di gel (ottenuto mediante elettroforesi su nastro ad alta sensibilità) delle librerie ATAC-seq indica la presenza di adattatori (~ 120 bp), eccessiva degradazione del DNA (la maggior parte dei frammenti sono ~ 200 bp), o frammenti di grandi dimensioni (superiori a 1 kb), abbiamo non vorrei continuare con il passaggio NGS.
Inoltre, eseguiamo sempre NGS iniziale in cui miriamo per 10 milioni letture al biblioteca. Se i risultati di questa sequenza sono soddisfacenti (il campione passa tutti i parametri nel file di report di FastQC e possiamo ottenere picchi di 1000-2000 dopo l'esecuzione di chiamate di picco), le librerie sono in sequenza più profondamente (biblioteca più di 30 milioni di letture/ATAC-seq).
In ATAC-seq esperimenti sulle cellule di mammiferi, ovunque da ~ 30-70% delle letture in sequenza possono provenire da mtDNA10. Al contrario, le nostre biblioteche contenevano 6-20% letture mappate il genoma mitocondriale. Questo è inferiore il 46% ha segnalato nella libreria ATAC-seq da umano di linfociti T CD4 +1. Dopo aver eliminato questi contaminanti letture, ci hanno lasciato con 7 milioni letture uniche mappatura del genoma umano di riferimento (58% - 91% di tutte le letture). Da questi, 0.1 - letture 2 milioni (6,8% - 12% di tutte le letture) erano in ATAC-seq picchi (Figura 4).
Figura 1 . Flusso di lavoro della procedura sperimentale. Rappresentazione dei principali passi in questo protocollo di ATAC-seq. Punti di arresto sono indicati da esagoni gialli. Un passaggio facoltativo è rappresentato con un arancione di esagono. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Calcolo del numero di cicli PCR necessari per l'arricchimento finale di ATAC-seq librerie aggiuntivo. Curve di amplificazione di PCR per tre diverse librerie di seq ATAC sono mostrate in rosso, blu e rosa. Le reazioni di amplificazione ha raggiunto un plateau a 2.350 RFU (linea orizzontale verde superiore). Il numero di ulteriori cicli di PCR si interseca con 783 RFU (2.350/3) sulla curva di amplificazione. Due biblioteche (rossi e blu) richiedono 8 cicli di amplificazione aggiuntiva mentre la terza raccolta (rosa) richiede 9 cicli. Non-modello di controllo (NTC) è mostrato come la linea verde inferiore. Asse x, numero di cicli. Asse y, unità RFU. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Analisi di controllo di qualità delle biblioteche di ATAC-seq. (A) risultati dell'elettroforesi automatizzata basata su nastro di amplificato ATAC-seq librerie. L, scaletta; A-D, librerie di biologico si ripete da cellule Th1 e Th2. (B) qPCR controllo qualità analisi di librerie ATAC-seq. Il DNA genomico e quattro ATAC-seq librerie sono state amplificate da coppie di primer di controllo negativo (1 e 2) e primer di controllo positivo (3 e 4). I valori ottenuti per le librerie ATAC-seq (blu) in primo luogo sono stati normalizzati per i livelli di amplificazione del DNA genomico (arbitrariamente impostata su un valore di 1; rosso). Successivamente, i valori per le regioni di controllo positivo sono stati normalizzati per le regioni di controllo negativo (grafico inferiore). Librerie di #1 e #2 sono state inviate al sequenziamento NGS. I valori rappresentano la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Genome browser snapshot ots delle regioni di cromatina accessibile in cellule Th1 e Th2. ATAC-seq tracce sono mostrate per NFKB1, JUN, CD28, IFNG (espresso solo in Th1) e IL4 e IL13 (espresso solo in Th2) loci in cellule Th1 e Th2 (biologico due ripetizioni per ciascuno). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Buffer di TD | 50 | ΜL |
| TDE1 transposase | 5 | ΜL |
| Acqua priva di nucleasi | 45 | ΜL |
| Volume totale | 100 | ΜL |
Tabella 1: Preparazione della miscela di reazione di trasposizione.
| ATAC-seq biblioteca | 15 | ΜL |
| Iniettore 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabella 2: Componenti della miscela di reazione PCR iniziale (punto 5.1.1.).
| PASSAGGIO DI CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLI |
| Estensione * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Ricottura | 63 ° C | 30 s | |
| Estensione | 72 ° C | 3 min | |
| Tenere premuto | 4 ° C | ∞ | |
| * Questo passaggio è necessario per estendere entrambe | |||
| estremità dei primer dopo reazione di trasposizione. | |||
Tabella 3: Ciclismo di PCR per l'amplificazione iniziale Biblioteca (passaggio 5.1.2).
| Aliquota di reazione di PCR (punto 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Iniettore 1 (Ad1_noMx) * * | 1 | ΜL |
| Iniettore 2 | 1 | ΜL |
| 2 x SYBR mix master * * * | 7.5 | ΜL |
| Acqua priva di nucleasi | 0,5 | ΜL |
| Volume totale | 15 | ΜL |
| * Per il controllo non template invece il modello di DNA aggiungere acqua ultra-pura. | ||
| * * La concentrazione finale di ogni primer è 417 nM. | ||
| Utilizzare mix master preferito per qPCR. | ||
| Dovrebbe contenere della polimerasi, dNTP, MgCl2e tintura fluorescente. | ||
Tabella 4: Preparazione della miscela di reazione qPCR (punto 5.2.2).
| PASSAGGIO DI CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLI |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Ricottura | 63 ° C | 30 s | |
| Estensione | 72 ° C | 3 min | |
| Tenere premuto | 4 ° C | ∞ |
Tabella 5: Ciclismo condizioni per qPCR-based assesment di ulteriore numero di cicli di amplificazione (N) (passaggio 5.2.3).
| PASSAGGIO DI CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLI |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | N |
| Ricottura | 63 ° C | 30 s | |
| Estensione | 72 ° C | 3 min | |
| Tenere premuto | 4 ° C | ∞ |
Tabella 6: Ciclismo condizioni per il passaggio finale di arricchimento PCR (punto 5.3.).
| Per una singola reazione di PCR: | ||
| Diluizione della biblioteca del DNA genomico | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 o F2 o F3 o F4) * | 0.3 | ΜL |
| 10 μM Primer R (R1 o R2 o R3 e R4) * * | 0.3 | ΜL |
| 2 x SYBR mix master * * * | 5 | ΜL |
| Acqua priva di nucleasi | 1.9 | ΜL |
| Volume totale | 10 | ΜL |
| * La concentrazione finale di ogni primer nella miscela di reazione è di 300 nM. | ||
| * * Se usando primer F1 che il primer R dovrebbe essere R1 ecc. | ||
| Uso preferito 2 x mix master adatto per lo strumento di qPCR nel vostro laboratorio. | ||
Tabella 7: Condizioni di reazione per l'analisi QC (passo 7.1.3.).
| Destinazione | Campione | Significa Cq | CQ SEM | Quantità relativa | Normalizzato | |
| 1 | Controllo negativo | ATAC-seq | 30.39 | 0,11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30.4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0,09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | Controllo positivo | ATAC-seq | 23,27 | 0,03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30,7 | 0,06 | 0,01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21,55 | 0,24 | 1 | 750.31 | |
Tabella 8: Calcolo dell'arricchimento dei controlli positivi sui controlli negativi (passo 7.1.5.).
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Discussion
Il protocollo di ATAC-seq descritto qui è stato impiegato con successo per l'analisi della cromatina accessibile in cellule primarie (umano Th1, Th2 cellule e cellule di B) così come le linee di cellule in coltura (cellule di cancro al seno umane MCF10A e U261 le cellule di glioblastoma). L'applicazione di ATAC-seq per altri tipi di cellule può richiedere alcune ottimizzazione dei protocolli, soprattutto nel passaggio lisi. Se la concentrazione del detergente non ionico è troppo alto, potrebbe trattarsi di una percentuale più elevata di contaminazione da DNA mitocondriale. Questo può essere ridotto facendo diminuire la concentrazione di detersivo nel buffer di lisi senza ridurre la resa di nuclei. Nella nostra esperienza, il buffer di lisi con 0,05% di detersivo ha dato i risultati più soddisfacenti. Inoltre, la filatura dei nuclei in un altalena-secchio invece di rotore ad angolo fisso permesso di ridurre la forza G a 500, che ha ridotto i mitocondri nel pellet. I ricercatori possono anche testare altri tipi di detergenti, per esempio, della digitonina17. Tuttavia, anche con condizioni di lisi ottimizzato, contaminazione del mtDNA è inevitabile. Per rimuovere completamente il mtDNA, il sistema CRISPR/Cas9 può essere usato15. In questo caso, ATAC-seq librerie vengono incubate con sgRNAs a destinazione mtDNA e nucleasi Cas9 a digerire mtDNA15.
Nei casi in cui il numero di cellule da campioni clinici è scarsa7potrebbe limitare il numero dei nuclei necessaria per questo protocollo di ATAC-seq (100.000). ATAC-seq è stato correttamente ridimensionato fino a 5.000 e 500 cellule1,13,17 , riducendo la reazione volume1,13, eseguire la pulitura con i branelli magnetici anziché con colonne 13, o evitando la sottofase1. Inoltre, unicellulare ATAC-seq (scATAC-seq) può essere eseguita utilizzando un dispositivo microfluidico per separare diversi nuclei16. In particolare, altri metodi per misurare l'accessibilità della cromatina, come dnasi-seq e FAIRE-seq, richiedono più materiale di partenza e qualche giorno in più per eseguire l'esperimento.
Ora è ampiamente apprezzato che pregiudizi in diversi metodi di NGS sono comuni fenomeni25. Una delle cause per variazioni nelle misure di accessibilità differenti della cromatina è la scissione enzimatica passo25. È stato indicato che dnasi I Mostra fenditura bias26 e ora è riconosciuto che Tn5 transposase Mostra fenditura preferenza come pure27. Fortunatamente, la polarizzazione potenziale può essere identificata informaticamente utilizzando una pipeline di controllo di qualità come ChiLin28. Un'altra fonte comune di bias è l'amplificazione di PCR passo20,25. Questo si manifesta spesso come un pregiudizio per l'amplificazione di GC-rich frammenti25. Poiché il bias aumenta con ogni fase di amplificazione di PCR, abbiamo non superare 9 ulteriori cicli (N) l'amplificazione di PCR finale delle librerie ATAC-seq.
Il rapporto corretto tra nuclei e Tn5 transposase è critico per successo ATAC-seq2. Un eccesso di enzima porterebbe a "nel corso di recepimento" in luoghi inaccessibili e alta priorità bassa. Questo si riflette nella alta amplificazione delle regioni di controllo negativo in fase di controllo di qualità di qPCR. Un eccesso di nuclei porterebbe a "sotto-recepimento". In questo caso, siti di taglio troppo lontano si tradurrà in meno frammenti PCR-amplificati e libreria bassa complessità. Per determinare con precisione il numero dei nuclei, abbiamo introdotto un ulteriore passaggio di conteggio dopo lisi cellulare e prima della reazione di trasposizione.
L'accessibilità della cromatina è un importante livello di regolamentazione epigenetico come consente l'attività di trascrizione regolatori in specifiche posizioni genomiche. Così, la sequenza di DNA all'interno del profilo di cromatina accessibile fornisce una ricchezza di informazioni circa l'identità e la destinazione loci di decine di fattori di trascrizione possibile. Combinando queste informazioni (ottenute da ATAC-seq) con un profilo di espressione di RNA permette una messa a fuoco sui fattori pertinenti trascrizione che possono essere ulteriormente analizzati mediante ChIP-seq13,22. Inoltre, solo il 10% dei polimorfismi malattia-collegati sono nel genoma codifica30. Quindi per applicare ATAC-seq a campioni clinici può rivelare che delle varianti non codificanti sono elementi regolatori che possono influire sulla regolazione genica nello stato di malattia (ad esempio, nel lupus eritematoso sistemico8). Speriamo che questo protocollo ATAC-seq aiuteranno e incoraggiare i ricercatori interessati a utilizzare questo potente metodo per far progredire la loro ricerca.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione di scienza di Israele (grant 748/14), Marie Curie integrazione concedere (CIG) - 7 ° PQ-persone-20013-CIG-618763 e programma del Planning e Budgeting Comitato e The Israel Science Foundation CORE concedere n. 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
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