Summary
Analysen for Transposase tilgjengelig Chromatin kombinert med høy gjennomstrømming sekvensering (ATAC-seq) er en genomet-bred å avdekke tilgjengelig chromatin. Dette er en trinnvis ATAC-seq-protokollen fra molekylær til den endelige beregningsorientert analysen, optimalisert for menneskelig lymfocytter (Th1/Th2). Denne protokollen kan vedtas av forskere uten tidligere erfaring i neste generasjons sekvensering metoder.
Abstract
Analysen for Transposase tilgjengelig Chromatin med høy gjennomstrømming sekvensering (ATAC-seq) er en metode som brukes til å identifisere åpne (tilgjengelig) regioner i chromatin. Disse regionene representerer regulatoriske DNA elementer (f.eks, arrangører, enhancers, locus kontroll områder, isolatorer) til hvilke transkripsjon faktorer binde. Kartlegging tilgjengelig chromatin landskapet er en kraftig metode for avdekke aktive regulatoriske elementer over genomet. Denne informasjonen fungerer som en upartisk metode for nettverket av relevante transkripsjonsfaktorer og mekanismer for chromatin struktur som styrer gene expression programmer. ATAC-seq er et robust og sensitive alternativ til DNase jeg overfølsomhet analyse kombinert med neste generasjons sekvensering (DNase-seq) og formaldehyd-assistert isolering av regulatoriske elementer (FAIRE-seq) for genomet-omfattende analyse av chromatin tilgjengelighet og sekvensering av micrococcal nuclease-sensitive områder (MNase-seq) til å angi nucleosome plassering. Vi presenterer en detaljert ATAC-seq protokollen optimert for menneskelig primære immunceller dvs CD4 + lymfocytter (T helper 1 (Th1) og Th2 celler). Denne omfattende protokollen begynner med cellen harvest, så beskriver molekylær prosedyren for chromatin tagmentation, prøve forberedelse til neste generasjons sekvensering, og inneholder også metoder og betraktninger om beregningsformelen analyser til Tolk resultatene. Videre, for å spare tid og penger, vi introdusert kvalitetskontroll tiltak for å vurdere ATAC-seq biblioteket før sekvensering. Viktigere, tillater prinsippene i denne protokollen tilpasningen til andre menneskelige immunforsvar og ikke-immune primære celler og linjer. Disse retningslinjene vil også være nyttig for laboratorier som ikke er god med neste generasjons sekvensering metoder.
Introduction
ATAC-seq1,2 er en robust metode som gjør identifisering av regulatoriske3 åpne chromatin regioner og nucleosome plassering. Denne informasjonen brukes inferring plasseringen, identitet og aktiviteten til transkripsjonsfaktorer. Metodens følsomhet for å måle kvantitative variasjoner i chromatin-strukturen kan studere aktiviteten chromatin faktorer, inkludert chromatin remodelers og modifikatorer, samt transcriptional aktiviteten til RNA polymerase II1. Dermed gir ATAC-seq en kraftig og upartiske tilnærming for å tyde mekanismer som styrer transcriptional regulering i en celle type av interesse. Vi beskriver tilpasningen av ATAC-seq primære menneskelige Th1 og Th2 celler.
I ATAC-seq, hyperaktiv Tn5 transposase lastet med adaptere for neste generasjons sekvensering (NGS) par DNA fragmentering koding av DNA med adaptere (dvs., "tagmentation" prosessen)1. Etter PCR forsterkning er resulterende DNA bibliotekene klar for neste generasjons sekvensering (figur 1). Den privilegerte tagmentation av tilgjengelig chromatin oppdages av analyse av lokale berikelse av ATAC-seq sekvensering.
Den korte eksperimentelle prosedyren og krav for mindre utgangsmaterialet, i forhold til andre metoder for å måle chromatin tilgjengelighet og nucleosomal plassering som DNase-seq4, FAIRE-seq5og MNase-seq6, har fremmet bruken av ATAC-seq i flere biologiske systemer inkludert primær menneskeceller1,7 og klinisk prøver8, samt encellede organismer9, planter10, frukt fluer11 , og ulike pattedyr12.
Identiteten til transkripsjon faktorer som er bundet til tilgjengelig loci kan bli avdekket av analysere anriking av deres bindende sekvens motiver eller kombinere ATAC-seq med chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming DNA sekvensering ( ChIP-seq). Denne tilnærmingen aktivert identifikasjon av slektslinje kundespesifikk transkripsjonsfaktorer viktig for hematopoiesis i musen13. Objektivt og globale natur ATAC-seq kan studere genet regulering i organismer som reagenser som antistoffer for ChIP analyse ikke er tilgjengelige. For eksempel evolusjonære variasjoner i cis-regulatoriske regioner har blitt identifisert ved å studere skallen neural crest celler fra mennesker og sjimpanser14, utviklingsmessige variasjoner i regulatoriske elementer under tidlig musen embryogenesis15, endringer i det regulatoriske landskapet under en livssyklus av encellede C. owzarzaki9og utviklingen av arrangørene og enhancers over 20 pattedyr arter12.
ATAC-seq har også vært medvirkende for å måle chromatin tilgjengelighet i enkeltceller, dermed avslørende variasjon i celle populasjoner, som vanligvis omgår genomet hele studier7,16. I tillegg kan ATAC-seq brukes å studere endringene som skjer i DNA regulatoriske regioner i sykdomstilstander, som eksempler er sjeldne. For eksempel ATAC-seq kan brukes til å studere endringer i det regulatoriske landskapet under utbruddet av akutt myelogen leukemi (AML)17 eller Ras-drevet oncogenesis11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret i Bar-Ilan-universitetet og protokollen følger retningslinjene gitt av godkjenne eksperimenter.
1. rensing av naiv CD4 + menneskeceller og polarisering T Helper 1 (Th1) og Th2 celler
Merk: her beskriver vi prosedyren fra frosne menneskelige perifert blod mononukleære celler (PBMCs). Det første trinnet består av aisolering CD4 + celler ved hjelp av microbeads og kolonner som vanligvis gi oss mer enn 95% av CD4 + celler. Dette trinnet kan imidlertid variere i henhold til foretrukne protokollen i hver lab. Protokollen for T celle aktivering og polarisering ble endret fra Jenner et al. (2009) 18. isolering av CD4 + celler fra 10 millioner PBMCs gir opphav til 4-6 millioner av CD4 + celler. De er delt inn i to flasker og dyrket under Th1 og Th2 polariserende forhold gir 3-5 millioner Th1 og Th2 celler i bare en uke.
Merk: kjølig ned sentrifuge 4 ° c før.
- Tine 1 mL av menneskelig PBMCs (10 7 celler) i et 50 mL rør som inneholder 10 mL av RPMI medium med 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-glutamin og 10% inaktivert fosterets bovin serum. Sentrifuge på 500 x g for 5 min. Fjern nedbryting og resuspend cellene med en bakteriefri 25 mL pipette i 15 mL av supplert RPMI medium. Overføre cellene (med sterilt 25 mL pipette) til en MT75 kultur kolbe.
- La cellene over natten i en fuktet inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Overføre flytende cellene med en pipette sterilt 25 mL til 50 mL tube. Bestemme celle nummer og levedyktighet ved trypan blå eksklusjon.
- Isolere CD4 + celler fra 10 millioner bor ikke-tilhenger PBMCs av positiv utvalg ved hjelp av CD4 + microbeads og kolonner ifølge produsenten ' s anbefalinger (se Tabell av materialer/utstyr) med følgende modifikasjoner: 10 7 PBMCs er merket med 30 µL av CD4 microbeads i 120 µL av 0,5% BSA i PBS.
- Aktivere CD4 + T celler for 72 h rhIL-2 (10 ng/mL), plate-bundet anti-CD3 (5 µg/mL) og løselig anti-CD28 (2 µg/mL). For Th1 polarisasjon, legge rhIL-12 (20 ng/mL) og anti-IL-4 (10 µg/mL). For Th2 polarisasjon, legger rhIL-4 (40 ng/mL) og anti-IFN-γ (10 µg/mL).
- Kultur cellene i flere 7 dager i nærvær av rhIL-2 (10 ng/mL) og samme polariserende cytokiner (rhIL-12 for Th1 og rhIL-4 Th2).
2. Kjerner isolasjon
Merk: ATAC-seq utføres med intakt kjerner. Lysis buffer inneholder 0,05% nonylphenyl polyetylenglykol ble (se Tabell av materialer/utstyr) kalibrert for å isolere kjerner fra primære menneskelige Th1 og Th2 celler. Anbefales kalibrering dette trinnet med laboratoriet reagenser og celler. Et overskudd av intakt celler fra utilstrekkelig vaskemiddel reduserer effektiviteten av transponering reaksjonen. Cellen lysis effektivitet bestemmes av hvor mange kjerner (trypan blå positiv celler) i forhold til det totale antallet celler.
Merk: Forberede lyseringsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2). Kjølig ned en sentrifuge med en swing-bøtte rotoren til 4 ° C. Pelleting cellene i en swing-bøtte sentrifuge i stedet for en fast vinkel sentrifuge reduserer cellen/kjerner tap. Unngå kjerner eller cellen tap, Pipetter forsiktig når forkaster nedbryting.
- Add frisk nonylphenyl polyetylenglykol (til en siste konsentrasjon på 0,05%) og 100 x proteasehemmere (til en siste konsentrasjon av 1 x) til kald lyseringsbuffer umiddelbart før bruk. Holde bufferen på ice.
- Count T-cellene for å fastslå deres beløp og levedyktighet ved hjelp trypan blå metoden. Levedyktighet som er lavere enn 90% resulterer i høyere uspesifisert fordøyelsen.
- Overføring 0.5 x 10 6 T celler (Th1 eller Th2) til 1,5 mL microtubes. Nedspinning på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend celle pellet i 1 mL av kaldt fosfat-bufret (PBS) saltvann. Nedspinning på 500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend celle pellet i 1 mL av kaldt lyseringsbuffer (inneholder nonylphenyl polyetylenglykol og proteasehemmere). Holde røret på is. Pipetter forsiktig for å unngå å forstyrre kjerner.
- Raskt ta 10 µL og telle celler med en automatisert celle teller mens microtube med lysed celler er på is. Dette trinnet må ikke overstige fem minutter for å unngå skade kjerner. Minst 80% av cellene skal være lysed.
- Fortsett umiddelbart med transponering reaksjonen. Hold forberedt kjerner på ice.
3. Transponering reaksjon
Merk: I dette trinnet isolert kjerner er ruges med prokaryote Tn5 transposase (TDE1) lastet med adaptere for NGS sekvensering. Hyperaktiv Tn5 samtidig fragmenter DNA og ligates kort i tilgjengelige regioner i genomet (tagmentation prosess). Forholdet mellom kjerner og Tn5 transposase er avgjørende for fortrinnsrett cleavage på tilgjengelige chromatin. Denne protokollen er kalibrert for 100.000 kjerner i en 100 μL reaksjon volum. Men reaksjonen kan skaleres ned.
- Sette temperaturen i en termisk shaker til 37 ° C.
- Overføre 100.000 kjerner til en 1,5 mL microtube.
- Sentrifuge 500 x g for 10 min 4 ° C og forsiktig fjerne nedbryting.
- Legge til transponering reaksjon komponentene kjerner som angitt i tabell 1.
- Resuspend av mild pipettering.
- Ruge transponering reaksjonen i en termisk shaker på 37 ° C i 30 min med milde risting (500 rpm).
Merk: DNA opprydding utføres av solid-fase reversibel immobilisering perler 19 (se Tabell av materialer/utstyr) eller PCR rensing kolonner. På slutten av opprydding, elute DNA fragmenter i 20 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 8. Unngå EDTA i elueringsbufferen.
4. PCR anriking av ATAC-seq biblioteker
Merk: dette trinnet er aimed å forsterke ATAC-seq biblioteket dvs DNA fragmenter med innsatte kort. Å tillate blanding av flere ATAC-seq biblioteker i samme neste generasjons sekvensering kjørefelt (" multipleksing ") Bruk ikke er indekserte Primer 1 (Ad1_noMx) 1 for alle prøver, og en annen indeksert (barcoded) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) 1 for hvert utvalg. Primer sekvensene er gitt i supplert Tabell av materialer/utstyr.
- Første PCR forsterkning
Merk: arbeider konsentrasjonen av Primer 1 (Ad1_noMx) og Primer 2 er 25 µM. Alle primerne er utvannet fra opprinnelige lager av 100 µM til 25 µM. I alle PCR reaksjonene, bruke grunning 1 (Ad1_noMx) og bare én av de indekserte Primer 2.- Legge til komponenter i PCR reaksjonen som angitt i tabell 2 slik sterilt PCR.
- Sted PCR rør i en termisk cycler og utføre PCR forsterkning sykling betingelser i tabell 3.
- Vurdering av antall ekstra forsterkning sykluser
Merk: antall ekstra PCR-sykluser bør gi tilstrekkelig mengde biblioteket fragmenter feller en vellykket neste generasjons sekvensering kjører, mens minimert å unngå GC og størrelse bias 20. Fastsettelse av antall PCR sykluser (N) kreves for optimal biblioteket fragment forsterkning gjøres ved kvantitative PCR (qPCR).- Fortynne primere 1 (Ad1_noMx) og 2 (brukes for første bibliotek forsterkning) fra 25 µM 6,25 µM.
- Legge komponentene til optiske PCR rør eller en plate som angitt i Tabell 4.
- Sted i et qPCR instrument og syklus angitt i tabell 5.
- For å beregne antall ekstra forsterkning sykluser (N), plot syklus nummer på x-aksen og relativ fluorescens (RFU) på y-aksen.
- Antall ekstra forsterkning sykluser (N) er 1/3 av antall sykluser som qPCR reaksjonen nådd platået. figur 2 inneholder eksempler for tre ATAC-seq-biblioteker som nådd platå på ~ 2,350 relative fluorescens enheter, RFU (tykk grønn linje). Antall PCR sykluser som en tredjedel av det maksimale beløpet (783 RFU, merket på y-aksen) forsterkes tilsvarer 8 sykluser for to bibliotekene (rød og blå forsterkning kurver) og 9 PCR sykluser for tredje biblioteket (rosa).
- Siste PCR forsterkning
- forsterke den gjenværende 45 µL av PCR reaksjonen. Plass et PCR rør som inneholder forsterkning reaksjon fra trinn 4.1.2 i en termisk cycler. Kjør PCR-programmet beskrevet i tabell 6. Bruke det tidligere fastsatte (trinn 4.2.5) antallet forsterkning sykluser (N).
5. Størrelse utvalg av ATAC-Seq biblioteker
Merk: I vår erfaring, størrelse utvalg av forsterket ATAC-seq biblioteker forbedrer neste generasjons sekvensering resultater fordi det eliminerer molekylvekt biblioteket fragmenter fra den siste ATAC-seq biblioteket.
Merk: Tillater magnetiske perler å varme til romtemperatur 30 min før bruk.
Forberede frisk 70% etanol i nuclease-fritt vann.
- Resuspend de magnetiske perlene ved å blande.
- Legge til nuclease-fritt vann i ATAC-seq bibliotekene (innhentet i trinn 4.3.1.) og få opptil 100 µL.
- Legge til 50 µL (0.5 x) av resuspended DNA-bindende magnetiske perler til 100 µL av forsterket biblioteker. Bland ved pipettering opp og ned minst 10 ganger. Inkuber prøver for 5 min ved romtemperatur. Om nødvendig raskt spinne ned microtubes.
- Sett røret på en passende magnetiske stand i 2 minutter å skille de magnetiske perlene fra nedbryting. Etter 2 min, overføre nedbryting til en ny microtube.
- Måle volumet av nedbryting av pipettering og legge til 0,7 x av magnetiske perler. Blandingen av pipettering opp og ned minst 10 ganger.
- Ruge 5 min ved romtemperatur. Sted på magnetiske standpunkt for 2 min.
- Etter 2 min incubation, forkaste nedbryting. Legge til 200 µL nystekte 70% etanol å vaske perlene mens rørene på magnetiske stand.
- Hold microtube på magnet for 30 s og deretter Forkast etanol. Gjenta trinn 5.7.for to siste etanol vasker.
- Fjerne de gjenværende etanol og la perler air-dry for 5 min mens røret er på magneten. Eventuelt kort spinne microtube. Fjerne spor av etanol med p10 pipette tips.
- Fjerner microtube fra magneten og legge 22 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 8. Ikke elute ATAC-seq bibliotekene i buffer med EDTA.
- Ruge røret i 2 minutter ved romtemperatur og plasser på magnetiske stand.
- Når løsningen er klart, overføre 20 µL av elut biblioteker til en ny sterilt microtube.
- Store størrelsen valgt ATAC-seq biblioteker på -20 ° C.
6. Kvalitet analyse av ATAC-Seq bibliotekene
- validering av kvaliteten på ATAC-seq biblioteker av Real-Time PCR
Merk: det er viktig å vurdere signalet til støyforhold ATAC-seq biblioteker før neste generasjon sekvensering. Dette gjøres ved å bestemme relative DNA fragmenter fra tilgjengelige og utilgjengelige loci bruker kvantitative PCR (qPCR). De utilgjengelige loci (negativ kontroll, chr1:48, 137, 860-48,137,934 og chr1:193, 093, 748-193,093,827) er forsterket av primer par 1 og 2. De tilgjengelige loci (positiv kontroll, chr19:30, 336, 166-30,336,253 og chr19:11546154-11546237) er forsterket av primer par 3 og 4. Positive og negative loci ble definert fra chromatin tilgjengelighet (DHS-seq) profiler av menneskelige CD4 + celler (kode tiltredelser ENCSR000EQE og ENCSR000EQG). Negativ primer 1 ligger i en stor heterochromatic intergenisk region (230 kb fra TRADB2 og 88 kb fra FOXD2). Negativ kontroll område 2 ligger i den første intron av CDC73 genet. Positiv primer par 3 er en åpen chromatin regionen nedstrøms Cyclin E (CCNE1) genet mens positiv primer par 4 midtstilles i arrangøren av protein kinase C substrat 80K-H (PRKCSH). Viktigere, viser disse kontroll loci et lignende mønster for tilgjengelighet i andre menneskelige celletyper fra kode prosjekt 3, noe som tyder på at de kan brukes til å overvåke ATAC-seq biblioteker fra et bredt spekter av menneskelig celletyper. Primer-effektivitet og spesifisitet av alle primer par ble bekreftet av qPCR på en seriell fortynning av genomisk DNA (fra Th menneskeceller) og en smeltende curve analyse av innhentet forsterket produkter.- Isolere genomisk DNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit (se Tabell av materialer/utstyr).
- Fortynne den forsterkede ATAC-seq biblioteket 1:10 (1 µL biblioteket + 9 µL nuclease uten vann) og genomisk DNA til ~ 5 ng/µL.
- Forberede reaksjonsblandingen (Tabell 7) for hvert positive og negative kontroll primer par, tatt i betraktning at reaksjonene er utført i tre eksemplarer.
- Incubate i qPCR termiske cycler i henhold til protokollen anbefales qPCR master mix leverandøren.
- Analysere resultatene i qPCR instrument ' s programvare (se Tabell av materialer/utstyr). Velg genomisk DNA som en kontroll prøven. Innhentet verdiene representerer en berikelse av tilgjengelige regioner (forsterket av positiv kontroll primere). Et eksempel er vist i tabell 8.
Merk: Beregning av gjennomsnittlig biblioteket størrelse og konsentrasjon: størrelsesDistribusjon av DNA fra ATAC-seq biblioteker bestemmes av høy følsomhet automatiserte geleelektroforese systemer ifølge produsenten ' s instruksjoner. Det anbefales å måle eksempel konsentrasjonen på en fluorometer med dsDNA høy følsomhet kit og minst 2 µL av hver DNA-prøve.
Merk: Neste generasjons sekvensering - før multipleksing bibliotekene, beregne molarity for hver ATAC-seq-biblioteket ved hjelp av formelen: (ng/µL x 10 6) / (660 x gjennomsnittlig biblioteket fragmentere lengde). Mål for > 30 millioner leser av hvert ATAC-seq bibliotek å vurdere åpen chromatin regioner i prøver fra mennesker. Hvis du ønsker å finne ut om biblioteket er godt nok for NGS sekvensering, opprinnelig sikte på ~ 10 millioner leser (5% av sekvensering kjørefelt på DNA sekvensering instrument i rask kjøremodus). Husk at for å antyde nucleosome plassering, sammen-end sekvensering er nødvendige 1.
7. Analyse av innhentet neste generasjons sekvensering resultatene
- antyde kvaliteten i sekvensering lyder ved å undersøke FastQC filer, separat for hvert bibliotek.
- Justerer lest til menneskelig referanse genomet (hg19 montering) bruke Bowtie 21 programvare i Unix/Linux-miljø. Kommandoen ' bowtie -m 1 - q -S genomet katalogen reads.fastq output_aligned.sam '. Genomet katalogen står for mappen der genomet indeksene av Bowtie lagres. Parameteren -m 1 er for ikke tillater justering av til flere locus i genomet - q er for inndatafilen som skal være i fastq format, -S er for utdataene i SAM format.
- Fjerne dupliserte leser bruker SAMtools 22 rmdup alternativet i Unix/Linux-miljø. Kommandoene er ' samtools vise -S output_aligned.sam -b | samtools sortere -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Den første kommandoen, visning, endrer SAM formatet til BAM-format som er deretter sortert. Alternativet for rmdup brukes deretter sortert BAM filen. Man kan eventuelt justere lest for transposon innsetting området, som beskrevet i den opprinnelige ATAC-seq papir 1. Dette gjøres ved å bruke BEDtools kommandoer 23 i Unix/Linux-miljø. Kommandoene er ' bamToBed -jeg output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -jeg output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genomet > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Den første kommandoen, bamTobed, endrer BAM formatet til SENG-format som kan brukes for kommandoen shiftBed. Filen genom er en kategorien tabulatordelt fil som inneholder lengden på hver kromosom i genomet. Filen legges vanligvis i mappen BEDtools. - Utføre peak kall bruker modellbasert analyse av ChIP-seq (MACS2) 24 programvare i Unix/Linux-miljøet på skiftet SENG filen med følgende parametere:--nomodel--extsize 75 - Skift -30. Disse parameterne brukes til å justere lest slik at transposon innsetting site i hver sekvensering lese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det endelige utfallet av denne protokollen er en ATAC-seq bibliotek av vanligvis 3-20 ng/µL. Når kjører på et system for DNA integritet analyse (se Tabell av materialer/utstyr), de viser stigen utseende2 (figur 3A). Den gjennomsnittlige størrelsen på DNA fragmenter er vanligvis ~ 450-530 bp.
Riktig kvalitetskontroll av ATAC-seq biblioteker før du utfører neste generasjons sekvensering er viktig å spare tid og penger. Vi anser bibliotekene egnet for neste generasjons sekvensering (NGS) når anriking av positiv kontroller er mer enn 25 - og 75 ganger (for innføring par 3 og 4, henholdsvis) i forhold til negative kontroller (figur 3B), og når de viser den tidligere omtalte nucleosomal, stigen-lignende utseende. Når du analyserer qPCR data, bekrefter vi også at Cq verdiene for negative og positive kontroll primere er like i reaksjonene med genomisk DNA som en mal, og at Cq verdier for regionene negativ kontroll (i reaksjonene med ATAC-seq DNA fragmenter) er konstant mellom forsøkene. For eksempel i tilfelle av plutselig lave Cq verdier mistenker vi at kjerner var over ombyttede og dermed DNA fragmenter fra heterochromatin regioner er overrepresentert. Videre, hvis gel bildet (fås ved høy følsomhet kassettbasert geleelektroforese) av ATAC-seq biblioteker indikerer tilstedeværelse av adaptere (~ 120 bp), overdreven DNA degradering (fleste fragmenter er ~ 200 bp), eller store fragmenter (over 1 kb), vi ville ikke fortsette til NGS trinn.
I tillegg utfører vi alltid første NGS der vi mål for 10 millioner leser per bibliotek. Hvis resultatene av denne sekvensering tilfredsstillende (prøven passerer alle parametrene i FastQC rapportfilen og vi kan få 1000-2000 topper etter at peak ringer), bibliotekene er sekvensert dypere (mer enn 30 millioner leser/ATAC-seq biblioteket).
I ATAC-seq eksperimenter på pattedyrceller, hvor som helst fra ~ 30-70% i sekvensert lyder kan komme fra mtDNA10. I kontrast, inneholdt vår biblioteker 6-20% leser tilordnet mitokondrie genomet. Dette er lavere enn den rapporterte 46% i ATAC-seq biblioteket fra menneskelige CD4 + T-lymfocytter1. Etter eliminere disse forurensende leser, var vi igjen med ~ 7-32 millioner unike leser tilordning til referanse menneskelige genomet (58% - 91% av alle leser). Fra disse, 0.1 - var 2 millioner leser (6,8% - 12% av alle leser) i ATAC-seq topper (Figur 4).
Figur 1 . Arbeidsflyt av eksperimentelle trinnene. Representasjon av store skritt i denne ATAC-seq protokollen. Stoppe poeng angis av gule sekskantene. Et valgfritt trinn er representert med en oransje sekskant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Beregning av antall PCR sykluser kreves for siste anriking av ATAC-seq biblioteker. PCR forsterkning kurver for tre forskjellige ATAC seq biblioteker vises i rød, blå og rosa. Forsterkning reaksjonene nådd et platå på 2,350 RFU (øvre grønn vannrett linje). Antall ekstra PCR sykluser skjærer med 783 RFU (2,350/3) på forsterkning kurven. To bibliotek (rød og blå) krever 8 ekstra forsterkning sykluser mens tredje biblioteket (rosa) krever 9 sykluser. Non-mal kontroll (NTC) vises som den nedre grønne linjen. X-aksen, syklus nummer. Y-aksen, RFU enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Kvalitetskontroll analyse av ATAC-seq biblioteker. (A) resultatene av kassettbasert automatisert geleelektroforese av forsterket ATAC-seq-bibliotekene. L, stigen; A-D, biblioteker av biologiske gjentar fra Th1 og Th2 celler. (B) qPCR kvalitetskontroll analyse av ATAC-seq biblioteker. Genomic DNA og fire ATAC-seq biblioteker ble forsterket av negativ kontroll primer par (1 og 2) og positiv kontroll primere (3 og 4). Innhentet verdiene for ATAC-seq biblioteker (blå) var først normalisert forsterkning nivåer av genomisk DNA (vilkårlig satt til verdien 1, rød). Deretter var verdiene for regionene positiv kontroll normalisert til regionene negativ kontroll (nederste diagram). Biblioteker #1 og #2 ble sendt til NGS sekvensering. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Genomet nettleser snapsh ots tilgjengelig chromatin regioner i cellene Th1 og Th2. ATAC-seq spor vises for NFKB1, JUN, CD28, IFNG (uttrykt i Th1) og IL4 IL13 (uttrykt i Th2) loci i Th1 og Th2 celler (to biologiske gjentas for hver). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| TD buffer | 50 | ΜL |
| TDE1 transposase | 5 | ΜL |
| Nuclease-fritt vann | 45 | ΜL |
| Totalt volum | 100 | ΜL |
Tabell 1: Utarbeidelse av transponering reaksjonsblandingen.
| ATAC-seq bibliotek | 15 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabell 2: Komponenter i første PCR reaksjonen blanding (trinn 5.1.1.).
| SYKLUS TRINN | TEMPERATUR | TID | SYKLUSER |
| Filtypen * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Første rødsprit | 98 ° C | 30 s | |
| Rødsprit | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Avspenning | 63 ° C | 30 s | |
| Utvidelse | 72 ° C | 3 min | |
| Hold | 4 ° C | ∞ | |
| * Dette trinnet er nødvendig for å utvide både | |||
| endene av primerne etter transponering reaksjon. | |||
Tabell 3: PCR sykling betingelser for første bibliotek forsterkning (trinn 5.1.2.)
| Aliquot PCR reaksjon (trinn 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) ** | 1 | ΜL |
| Primer 2 | 1 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 7.5 | ΜL |
| Nuclease-fritt vann | 0,5 | ΜL |
| Totalt volum | 15 | ΜL |
| * For ikke-mal kontrollen i stedet for malen DNA legge svært rent vann. | ||
| ** Siste konsentrasjonen av hver primer er 417 nM. | ||
| Bruk foretrukket master miks for qPCR. | ||
| Den bør inneholde utvalg, dNTPs, MgCl2og fluorescerende fargestoff. | ||
Tabell 4: Utarbeidelse av qPCR reaksjonsblandingen (trinn 5.2.2).
| SYKLUS TRINN | TEMPERATUR | TID | SYKLUSER |
| Første rødsprit | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Rødsprit | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Avspenning | 63 ° C | 30 s | |
| Utvidelse | 72 ° C | 3 min | |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
Tabell 5: Sykling betingelser for qPCR-basert assesment av ekstra forsterkning sykluser (N) (trinn 5.2.3.)
| SYKLUS TRINN | TEMPERATUR | TID | SYKLUSER |
| Første rødsprit | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Rødsprit | 98 ° C | 10 s | N |
| Avspenning | 63 ° C | 30 s | |
| Utvidelse | 72 ° C | 3 min | |
| Hold | 4 ° C | ∞ |
Tabell 6: Sykling betingelser for siste PCR berikelse trinn (trinn 5.3.).
| For en enkelt PCR reaksjon: | ||
| Fortynning av biblioteket av genomisk DNA | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 eller F2 eller F3 eller F4) * | 0,3 | ΜL |
| 10 μM Primer R (R1 eller R2 eller R3 eller R4) ** | 0,3 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 5 | ΜL |
| Nuclease-fritt vann | 1.9 | ΜL |
| Totalt volum | 10 | ΜL |
| * Den endelige konsentrasjonen av hver primer i reaksjonsblandingen er 300 nM. | ||
| ** Hvis bruker primer F1 enn R primer skal R1 osv. | ||
| Bruk foretrukket 2 x master mix egnet qPCR instrumentet i ditt laboratorie. | ||
Tabell 7: Reaksjonen forhold for QC analyser (trinn 7.1.3.).
| Mål | Eksempel | Mener Cq | Cq SEM | Relative antallet | Normalisert | |
| 1 | Negativ kontroll | ATAC-seq | 30.39 | 0,11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30,4 | 0,16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30,3 | 0,18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0.09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | Positiv kontroll | ATAC-seq | 23.27 | 0,03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30,7 | 0,06 | 0,01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21.55 | 0.24 | 1 | 750.31 | |
Tabell 8: Beregning av anriking av positiv kontroll over negative kontroller (trinn 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq protokollen beskrevet her har vært vellykket ansatt for analyse av tilgjengelige chromatin i primære celler (menneskelige Th1, Th2 celler og B-celler) og de kultiverte cellelinjer (MCF10A menneskelige brystkreft celler og U261 glioblastom celler). Bruke ATAC-seq andre celletyper kan kreve noen protokollen optimalisering, spesielt i lyse trinn. Hvis konsentrasjonen av ikke-ioniske vaskemiddel er for høy, kan det være en høyere prosentandel av Mitokondrielt DNA forurensning. Dette kan reduseres ved å redusere vaskemiddel konsentrasjonen i lyseringsbuffer uten å redusere kjerner avkastningen. I vår erfaring ga lyseringsbuffer 0,05% av vaskemiddel de mest tilfredsstillende resultatene. I tillegg spinning kjerner i en swing-bøtte i stedet for fast vinkel rotoren tillatt å redusere G force til 500, som redusert mitokondrier i pellet. Forskerne kan også teste andre typer vaskemidler, for eksempel digitonin17. Men selv med optimalisert lysis forhold er mtDNA forurensning uunngåelig. For å fjerne mtDNA, kan CRISPR/Cas9 systemet brukes15. I dette tilfellet er ATAC-seq biblioteker ruges med sgRNAs målet mtDNA og Cas9 nuclease å fordøye mtDNA15.
Antall kjerner kreves for denne ATAC-seq-protokollen (100,000) kan begrense i tilfeller der celle nummer fra klinisk prøver knappe7. ATAC-seq er vellykket skalert ned til 5000 og 500 celler1,13,17 ved å redusere den reaksjonen volume1,13, utfører opprydding med magnetiske perler i stedet for med kolonner 13, eller unngå rengjøring trinn1. I tillegg kan encellede ATAC-seq (scATAC-seq) utføres med en microfluidic enhet for å skille personlige kjerner16. Spesielt, krever andre metoder for å måle chromatin tilgjengelighet, som DNase-seq og FAIRE-seq, mer utgangsmaterialet og noen dager å utføre eksperimentet.
Det er nå allment verdsatt at skjevheter i ulike NGS metoder er vanlige fenomener25. En av årsakene for variasjoner i forskjellige chromatin tilgjengelighet tiltak er enzymatisk cleavage trinn25. Det har vist at DNase jeg viser cleavage bias26 og nå det er anerkjent at Tn5 transposase viser cleavage preferanse samt27. Heldigvis kan potensielle skjevhet identifiseres beregningsmessig ved hjelp av en kvalitetskontroll rørledning som ChiLin28. En annen vanlig kilde til skjevhet er PCR forsterkning trinn20,25. Dette forekommer ofte som en skjevhet for forsterkningen på GC-rik fragmenter25. Siden bias øker med hvert PCR forsterkning trinn, overskrider vi ikke 9 ytterligere sykluser (N) i siste PCR forsterkning av ATAC-seq biblioteker.
De riktige forholdet mellom Tn5 transposase og kjerner er avgjørende for vellykket ATAC-seq2. Et overskudd av enzymet ville føre til "over transponering" utilgjengelig loci og høye. Dette gjenspeiles i høy forsterkning av negativ kontroll regioner i qPCR kvalitetskontroll trinn. Et overskudd av kjerner ville føre til "under transponering". I dette tilfellet vil for Fjern cleavage nettsteder resultere i færre PCR-forsterket fragmenter og lav biblioteket kompleksitet. For å bestemme antall kjerner nøyaktig, introdusert vi et ekstra telling trinn etter celle lyse og før transponering reaksjonen.
Chromatin tilgjengelighet er et viktig epigenetic regulatoriske lag som det tillater aktiviteten til transkripsjon regulatorer på bestemte genomisk steder. Derfor gir DNA sekvensen i tilgjengelig chromatin profilen et vell av informasjon om identitet og målet loci titalls mulig transkripsjonsfaktorer. Kombinere denne informasjonen (fås ved ATAC-seq) med en RNA uttrykk profil lar fokus på de aktuelle transkripsjonsfaktorer som kan analyseres videre av ChIP-seq13,22. I tillegg er bare 10% av sykdomsassosierte polymorfismer i koding genomet30. Dermed bruke ATAC-seq klinisk prøver kan avsløre hvilke varianter av ikke-koding er regulatoriske elementer som kan påvirke genet regulering i sykdom tilstand (for eksempel som systemisk lupus erythematosus8). Vi håper at denne ATAC-seq-protokollen vil hjelpe og oppmuntre interessert etterforskerne bruke denne kraftige metoden for å fremme sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie integrering gi (CIG) - FP7-folk-20013-CIG-618763 og jeg-kjernen Program for planlegging og budsjettering komiteen og The Israel Science Foundation gir nei 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
