Summary
Ensayo para cromatina transposasa accesible junto con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método de genoma cromatina accesible de descubrir. Se trata de un protocolo de ATAC-seq paso a paso, desde el molecular al final análisis computacional, optimizado para los linfocitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo puede ser adoptada por los investigadores sin experiencia previa en métodos de secuenciación de próxima generación.
Abstract
Ensayo de cromatina transposasa accesible con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método utilizado para la identificación de regiones (accesibles) abiertas de la cromatina. Estas regiones representan ADN elementos reguladores (por ejemplo, promotores, potenciadores, locus control regiones, aisladores) a que transcripción factores unen. Cartografía del paisaje de la cromatina accesible es un enfoque poderoso para descubrir elementos reguladores activos en todo el genoma. Esta información sirve como un enfoque imparcial para descubrir la red de factores de transcripción relevantes y mecanismos de la estructura de la cromatina que regulan programas de expresión génica. ATAC-seq es una alternativa robusta y sensible a la ADNasa I Análisis de hipersensibilidad junto con la secuenciación de próxima generación (DNasa-seq) y asistido por el formaldehído aislamiento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para el análisis del genoma de la cromatina accesibilidad y a la secuenciación de sitios sensibles a la nucleasa micrococcal (MNase-seq) para determinar el posicionamiento del nucleosoma. Presentamos un protocolo detallado de ATAC-seq optimizado para humano inmune primario de las células por ejemplo CD4 + linfocitos (helper T 1 (Th1) y las células Th2). Este protocolo integral comienza con la cosecha de la célula, luego describe el procedimiento molecular de la cromatina tagmentation, preparación de muestras para secuenciación de próxima generación y también incluye métodos y consideraciones para el análisis computacional utilizado para interpretar los resultados. Además, para ahorrar tiempo y dinero, introducido medidas de control de calidad para evaluar la biblioteca ATAC-seq antes de la secuencia. Lo importante, los principios presentados en este protocolo permiten su adaptación a otros las células humanas inmunes y no inmunes primarios y líneas celulares. Estas pautas también será útiles para laboratorios que no son expertos en métodos de secuenciación de próxima generación.
Introduction
ATAC-seq1,2 es un método robusto que permite la identificación del regulador3 regiones de cromatina abierta y posicionamiento de nucleosoma. Esta información se aplica para inferir la ubicación, identidad y actividad de factores de transcripción. Sensibilidad del método para la medición de las variaciones cuantitativas en la estructura de la cromatina permite el estudio de la actividad de factores de la cromatina, remodeladores de cromatina y modificadores, así como la actividad transcripcional del RNA polimerasa II1. Así ATAC-seq proporciona un enfoque imparcial y poderoso para descifrar los mecanismos que rigen la regulación transcripcional en cualquier tipo de célula de interés. Se describe la adaptación de ATAC-seq a células Th1 y Th2 humanas primarias.
En ATAC-seq, hiperactiva Tn5 transposasa cargado con adaptadores para secuenciación de próxima generación (NGS) parejas fragmentación del ADN con el marcaje de ADN con adaptadores (es decir, el proceso de "tagmentation")1. Tras amplificación por PCR, las bibliotecas de ADN resultantes están listas para secuenciación de próxima generación (figura 1). El tagmentation preferencial de la cromatina accesible es detectado por el análisis del enriquecimiento local de Lee de la secuencia seq ATAC.
El procedimiento experimental corto y el requisito de menos material de partida, en comparación con otros métodos para medir la accesibilidad de la cromatina y posicionamiento nucleosomal como DNasa-seq4, FAIRE-seq5y MNase-seq6, ha promovió el uso de ATAC-seq en varios sistemas biológicos como células primarias humanas1,7 y8de las muestras clínicas, así como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de la fruta11 y varios mamíferos12.
La identidad de la transcripción de factores que están limitados a lugares accesibles pueden ser descubiertos por analizar el enriquecimiento de sus motivos de secuencia de unión o combinación de ATAC-seq con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) seguida de alto rendimiento (de secuenciación de ADN ChIP-seq). Este enfoque permitió la identificación de factores de transcripción específicos del linaje importantes de hematopoyesis en ratón13. El carácter imparcial y global de ATAC-seq permite estudiar la regulación de los genes en organismos que no están disponibles reactivos, tales como anticuerpos para el análisis de la viruta. Por ejemplo, variaciones evolutivas en cis-se han identificado regiones reguladoras mediante el estudio de las células de cresta neural craneal de los seres humanos y los chimpancés14, desarrollo variaciones en elementos reguladores durante temprano ratón embriogénesis de15, cambios en el panorama regulatorio durante un ciclo de vida de unicelulares owzarzaki C.9y la evolución de los promotores y potenciadores en mamíferos 20 especies12.
ATAC-seq también ha sido instrumental para la medición de accesibilidad de la cromatina en las células, así revela la variabilidad dentro de poblaciones celulares, que generalmente evade genoma estudios7,16. Además, ATAC-seq puede utilizarse para estudiar los cambios que se producen en regiones reguladoras de DNA en condiciones de enfermedad, en la cual las muestras son raras. Por ejemplo, ATAC-seq puede utilizarse para estudiar los cambios en el panorama regulatorio durante el inicio de la leucemia mieloide aguda (AML)17 o Ras-conducido de la oncogénesis11.
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Protocol
todos los procedimientos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Bar Ilan y el protocolo sigue pautas proporcionadas por el Comité de aprobación de los experimentos de.
1. purificación de ingenuo CD4 + las células humanas y polarización T Helper 1 (Th1) y las células Th2
Nota: aquí se describe el procedimiento a partir de las células mononucleares de sangre periférica humana congelada (PBMCs). El primer paso consiste en aislar las células CD4 + con microesferas y columnas que generalmente dan nosotros más del 95% de células CD4 +. Sin embargo, este paso puede variar según el protocolo recomendado: en cada laboratorio. El protocolo de activación de la célula T y la polarización fue modificado de Jenner et al. (2009) 18. aislamiento de CD4 + células de 10 millones de PBMCs de da lugar a 4 millones de células CD4 +. Se divide en dos matraces y cultivadas en Th1 y polarización Th2 condiciones rendimiento 3 millones células Th1 y Th2 en sólo una semana.
Nota: enfriar el centrifugar a 4 ° C antes de empezar.
- ML 1 descongelar de PBMCs humanos (10 7 células) en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de Medio RPMI suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 10% suero bovino fetal inactivado por calor. Centrifugar a 500 x g por 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender las células con una pipeta estéril 25 mL en 15 mL de Medio RPMI suplementado. Transferencia de las células (con una pipeta de 25 mL estéril) a un matraz de cultivo T75.
- Deja las células durante la noche en una incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO 2).
- Transferir las células flotantes con una pipeta 25 mL estéril para tubo de 50 mL. Determinar el numero de celular y viabilidad por exclusión del azul tripán.
- Aislar CD4 + células de 10 millones vive no adherente PBMCs por selección positiva con CD4 + microesferas y columnas según el fabricante ' recomendaciones de s (véase Tabla de materiales y equipos) con las siguientes modificaciones: 10 7 PBMCs están marcados con 30 μl de microesferas de CD4 en 120 μl de 0.5% de BSA en PBS.
- Activan las células T CD4 + 72 h de rhIL-2 (10 ng/mL), enlazado a la placa anti-CD3 (5 μg/mL) y anti-CD28 soluble (2 μg/mL). Para la polarización Th1, añadir rhIL-12 (20 ng/mL) y anti-IL-4 (10 μg/mL). Para la polarización Th2, añadir rhIL-4 (40 ng/mL) y anti-IFN-γ (10 μg/mL).
- Las células de la cultura para otros 7 días en presencia de rhIL-2 (10 ng/mL) y las mismas citoquinas polarizantes (rhIL-12 de Th1 y Th2 rhIL-4).
2. Aislamiento de núcleos
Nota: ATAC-seq se realiza con núcleos intactos. Lysis buffer que contiene 0,05% nonylphenyl polietilenglicol (véase Tabla de materiales y equipos) se calibró para aislar los núcleos de las células humanas primarias de la Th1 y Th2. Recomendamos este paso con las células y reactivos de laboratorio de calibración. Un exceso de células intactas de detergente insuficiente disminuye la eficiencia de la reacción de transposición. Eficacia de lisis de la célula es determinada por el número de núcleos (las células positivas trypan azul) con respecto al número total de células.
Nota: Preparar el tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl 2). Enfriar una centrífuga con un rotor de columpio-cubo a 4 ° C. las células en una centrifugadora de swing-cubo en lugar de una centrífuga de ángulo fijo de granulación reduce la pérdida de núcleos de célula. Para evitar los núcleos o pérdida de la célula, pipetee cuidadosamente cuando descartando el sobrenadante.
- Agregar nonylphenyl fresco polietilenglicol (a una concentración final de 0.05%) y 100 x inhibidores de la proteasa (para una concentración final de 1 x) en el búfer de lisis fría inmediatamente antes del uso. Mantener el buffer en hielo.
- Las células de T de conteo para determinar su cantidad y viabilidad utilizando el método de azul tripán. Viabilidad que es menor que 90% de resultados en mayor digestión inespecífica.
- Transferencia de 0.5 x 10 6 T células (Th1 o Th2) en microtubos de 1.5 mL. Desactivación a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado de células en 1 mL de frío con tampón fosfato (PBS) una solución salina. Desactivación a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón de lisis frío (contiene polietilenglicol nonylphenyl e inhibidores de la proteasa). Mantenga el tubo en hielo. Pipeta suavemente para evitar distorsionar los núcleos.
- Tomar 10 μl y contar las células con un contador de células automatizado mientras el microtubo con las células sometidas a lisis en hielo rápidamente. Este paso no debe exceder de cinco minutos para evitar daños en los núcleos. Por lo menos el 80% de las células debe ser lisis.
- Continuar inmediatamente con la reacción de transposición. Mantener los núcleos dispuestos en el hielo.
3. Reacción de transposición
Nota: en este paso, núcleos aislados se incuban con procariótico Tn5 transposasa (TDE1) cargado con adaptadores para la secuencia de NGS. Hiperactiva Tn5 simultáneamente fragmentos de ADN y ligates adaptadores en regiones accesibles del genoma (proceso tagmentation). La relación entre núcleos y Tn5 transposasa es crítica para escote preferencial en cromatina accesible. Este protocolo está calibrado para 100.000 núcleos en un volumen de reacción de 100 μL. Sin embargo, la reacción puede ser reducida.
- Temperatura en una coctelera termal a 37 ° C.
- 100.000 transferencia de núcleos en un microtubo de 1.5 mL.
- Centrifugar a 500 x g por 10 min a 4 ° C y con cuidado quite el sobrenadante.
- Añadir los componentes de la reacción de transposición a los núcleos como especificado en la tabla 1.
- Resuspender mediante pipeteo suave.
- Incubar la reacción de transposición en una coctelera termal a 37 ° C por 30 min con suave agitación (500 rpm).
Nota: Limpieza de ADN se realiza por inmovilización reversible fase sólida granos 19 (véase Tabla de materiales y equipos) o PCR purificación columnas. Al final de la limpieza, eluir los fragmentos de ADN en 20 μl de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitar el EDTA en el tampón de elución.
4. Enriquecimiento de la polimerización en cadena de ATAC-seq bibliotecas
Nota: este paso se pretende amplificar los ATAC-seq biblioteca es decir, fragmentos de ADN con los adaptadores de insertado. Para permitir la mezcla de varias bibliotecas de ATAC-seq en el mismo carril de secuenciación de última generación (" multiplexación ") uso cartilla 1 (Ad1_noMx) 1 para todas las muestras y otra indexadas (con código de barras) cartilla 2 (Ad 2.1-2.24) 1 para cada muestra. Las secuencias de la cartilla se proporcionan en el suplido de Tabla de materiales y equipos.
- Amplificación PCR inicial
Nota: la concentración de trabajo de la cartilla 1 (Ad1_noMx) y Primer 2 es 25 μm. Los cebadores se diluyen de la acción original de 100 μm a 25 μm. En todas las reacciones de polimerización en cadena, utilice la cartilla 1 (Ad1_noMx) y sólo uno de los 2 Primer indexadas.- Agregar los componentes de la reacción de PCR como especificado en la tabla 2 a un tubo estéril de la PCR.
- PCR lugar tubo en un termociclador y realizar la amplificación por PCR utilizando el ciclismo condiciones detalladas en la tabla 3.
- Evaluación del número de ciclos de amplificación adicional
Nota: el número de ciclos PCR adicionales debe producir una cantidad suficiente de biblioteca fragmentos fo una secuencia de generación exitosa ejecutar, mientras que reduce al mínimo para evitar GC y tamaño diagonal 20. La determinación del número de ciclos PCR (N) necesaria para la amplificación del fragmento de biblioteca óptima se realiza por PCR cuantitativa (qPCR).- Diluir cartillas 1 (Ad1_noMx) y 2 (utilizado para la amplificación inicial de la biblioteca) de 25 μm a 6,25 μm.
- Añadir los componentes ópticos tubos PCR o una placa como se indica en el cuadro 4.
- En un instrumento de qPCR y ciclo especificado en tabla 5.
- Para estimar el número de ciclos de amplificación adicional (N), parcela número del ciclo en el eje x y la fluorescencia relativa (RFU) en el eje y. Ciclos de
- la cantidad de amplificación adicional (N) es 1/3 del número de ciclos en que la reacción de qPCR alcanzó la meseta. figura 2 proporciona ejemplos para tres bibliotecas de ATAC-seq que alcanzaron la meseta ~ 2.350 unidades de fluorescencia relativa, RFU (línea verde gruesa). El número de ciclos PCR en el cual se amplifica un tercio de la cantidad máxima (RFU 783, marcado en el eje y) corresponde a 8 ciclos de dos de las bibliotecas (curvas de amplificación de rojo y azul) y 9 ciclos PCR para la tercer biblioteca (rosa).
- Amplificación PCR final
- amplificar las restantes 45 μl de la reacción de PCR. Coloque un tubo PCR que contiene la reacción de amplificación del paso 4.1.2 en un termociclador. Ejecute el programa PCR descrito en la tabla 6. Utilice el número previamente determinado (paso 4.2.5) de ciclos de amplificación (N).
5. Tamaño de selección de bibliotecas de ATAC-Seq
Nota: en nuestra experiencia, selección del tamaño de bibliotecas de ATAC-seq amplificadas mejora resultados de secuenciación de próxima generación ya que elimina fragmentos de biblioteca de alto peso molecular de la Biblioteca de ATAC-seq final.
Nota: Deje que las bolas magnéticas a temperatura ambiente 30 minutos antes de su uso.
Preparar fresca 70% de etanol en agua libre de nucleasa.
- Suspender las bolas magnéticas mediante la mezcla de.
- Añadir agua libre de nucleasa a las bibliotecas de ATAC-seq (obtenidas en paso 4.3.1.) y llevar hasta 100 μl.
- Añadir 50 μl (0,5 x) de granos magnéticos resuspendidos de ADN a 100 μl del amplificado bibliotecas. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces. Incubar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente. Si es necesario, girar rápidamente por los microtubos.
- Coloque el tubo sobre un soporte magnético apropiado durante 2 min separar las bolas magnéticas en el sobrenadante. Después de 2 min, transferir el sobrenadante a un microtubo nuevo.
- Medir el volumen del sobrenadante mediante pipeteo y añadir 0,7 x de bolas magnéticas. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces.
- Incubar 5 min a temperatura ambiente. Lugar en un soporte magnético para 2 minutos
- Incubación de después de los 2 minutos, descartar el sobrenadante. Añadir etanol al 70% 200 μL recién hechos para lavar los granos mientras que los tubos están en el soporte magnético.
- Mantener el microtubo en el imán durante 30 s y descartar entonces el etanol. Repita el paso 5.7.for dos lavados de etanol final.
- Eliminar completamente el resto de etanol y dejar que los granos deje secar al aire durante 5 minutos mientras que el tubo está en el imán. Si es necesario, girar brevemente el microtubo. Eliminar los restos de etanol con una pipeta p10.
- Quitar el microtubo del imán y agregar 22 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8. No eluir las bibliotecas ATAC-seq en tampón que contiene EDTA.
- Incubar los tubos durante 2 min a temperatura ambiente y luego coloque en el soporte magnético.
- Cuando la solución esté clara, transferir μl 20 bibliotecas eluídas a un nuevo microtubo estéril.
- Tienda el tamaño seleccionado bibliotecas ATAC-seq-20 ° C.
6. Análisis de la calidad de las bibliotecas de ATAC-Seq
- validación de la calidad de las bibliotecas ATAC-seq por PCR en tiempo real
Nota: es importante evaluar la relación señal a ruido de las bibliotecas de ATAC-seq antes de próxima generación secuencia. Esto se hace mediante la determinación de la cantidad relativa de fragmentos de ADN de loci accesibles e inaccesibles mediante PCR cuantitativa (qPCR). Los lugares inaccesibles (control negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 y chr1:193, 093, 748-193,093,827) son amplificadas por pares de la cartilla 1 y 2. Los loci accesibles (control positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 y chr19:11546154-11546237) son amplificadas por pares cartilla 3 y 4. Loci positivos y negativos se definieron perfiles de accesibilidad (DHS-seq) de la cromatina de células CD4 + humanas (ENCODE accesiones ENCSR000EQE y ENCSR000EQG). Primer negativo 1 está situado en una región intergénica heterochromatic grande (230 kb de TRADB2 y 88 kb de FOXD2). Control negativo región 2 está en el primer intrón del gen CDC73. Positivo primer par 3 es dentro de una región de cromatina abierta corriente abajo del gen ciclina E (CCNE1) mientras par primer positivo 4 se centra en el promotor de la proteína quinasa C sustrato 80K-H (PRKCSH). Lo importante, estos loci de control muestran un patrón similar de la accesibilidad en otros tipos de células humanas del proyecto ENCODE 3, sugiriendo que pueden ser aplicados para monitorear ATAC-seq bibliotecas de un amplio espectro de tipos de células humanas. Primer eficiencia y especificidad de todos los pares de la cartilla fue verificado por qPCR en una dilución seriada de la DNA genomic (a partir de células humanas de la Th) y un análisis de curva de fusión de productos amplificados obtenidos.- Aislar ADN genómico utilizando comercialmente disponible kit (véase Tabla de materiales y equipos).
- Diluir la ATAC-seq amplificado biblioteca 1:10 (1 μl librería + 9 μl de agua libre de nucleasas) y el ADN genómico a ~ 5 ng/μl.
- Preparar la mezcla de reacción (Tabla 7) para cada par de la cartilla de control positivo y negativo, teniendo en cuenta que las reacciones se llevan a cabo por triplicado.
- Incubar en qPCR termociclador según el protocolo recomendado por qPCR master mix proveedor.
- Analizar los resultados en qPCR instrumento ' software de s (véase Tabla de materiales y equipos). Elegir el ADN genómico como una muestra de control. Los valores obtenidos representan un enriquecimiento de las regiones accesibles (amplificados por cartillas de control positivo). Un ejemplo se muestra en la Tabla 8.
Nota: Estimación del tamaño de la biblioteca media y concentración: la distribución de tamaño de fragmentos de ADN de ATAC-seq bibliotecas está determinada por sistemas de electroforesis automatizada de alta sensibilidad según el fabricante ' instrucciones. Es aconsejable medir la concentración de la muestra en un fluorómetro usando dsDNA kit de alta sensibilidad y por lo menos 2 μl de cada muestra de ADN.
Nota: Secuenciación de próxima generación - antes de las bibliotecas de la multiplexación, calcular la molaridad de cada biblioteca de ATAC-seq utilizando la fórmula: (ng/μl x 10 6) / (660 x media biblioteca fragmento de longitud). Busca > Lee 30 millones de cada biblioteca de ATAC-seq para evaluar la cromatina abierta regiones de muestras humanas. Si desea determinar si la biblioteca es suficiente para la secuencia de NGS, inicialmente como objetivo Lee 10 millones (5% de la línea de la secuencia en instrumento de secuenciación de DNA en modo carrera rápido). Tenga en cuenta que para deducir nucleosoma posicionamiento, secuencia final emparejado es necesario 1.
7. Análisis de los resultados de secuenciación de próxima generación obtenidos
- deducir la calidad de las lecturas de secuenciación mediante la inspección de los archivos FastQC, por separado para cada biblioteca.
- Alinee la lee al genoma humano de referencia (hg19 Asamblea) utilizando Bowtie 21 software en el entorno Unix/Linux. El comando es ' pajarita -m 1 - q -S genoma directorio reads.fastq output_aligned.sam '. Directorio de genoma representa la carpeta donde se almacenan los índices de genoma de corbatín. El parámetro -m 1 es para no permitir que la alineación de Lee a más de un lugar geométrico en genoma, - q es para el archivo de entrada que debe estar en formato fastq -S es para la salida que está en formato SAM.
- Quitar duplicado Lee con SAMtools 22 rmdup opción en el entorno Unix/Linux. Los comandos son ' samtools ve output_aligned.sam -b -S | samtools tipo -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. El primer comando, vista, cambia el formato de SAM en formato de BAM que entonces se ordena. La opción de rmdup se aplica sobre el archivo clasificado de BAM. Opcionalmente se puede ajustar la Lee para el sitio de inserción del transposón, como se describe en el papel original de ATAC-seq 1. Esto se hace usando BEDtools comandos 23 en el entorno Unix/Linux. Los comandos son ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i genoma de output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. El primer comando, bamTobed, cambia el formato de la BAM en formato de cama que puede utilizarse para el comando shiftBed. El genoma es un archivo delimitado de ficha que contiene la longitud de cada cromosoma en el genoma. El archivo se agrega generalmente en el directorio BEDtools. - Realizar llamadas de pico mediante el análisis basado en el modelo de ChIP-seq (MACS2) 24 software en el entorno Unix/Linux el archivo cambiado de puesto de la cama con los siguientes parámetros:--nomodel--extsize 75--cambio -30. Estos parámetros se utilizan para ajustar las lecturas para que el sitio de inserción del transposón está en el centro de cada secuencia de la lectura.
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Representative Results
El resultado final de este protocolo es una biblioteca de ATAC-seq de típicamente 3-20 ng/μl. Cuando se ejecuta en un sistema de análisis de integridad de ADN (véase Tabla de materiales y equipos), muestran apariencia de escalera2 (Figura 3A). El tamaño promedio de fragmentos de ADN es típicamente ~ 450-530 bp.
Adecuado control de calidad de las bibliotecas de ATAC-seq antes de realizar la secuenciación de próxima generación es importante para ahorrar tiempo y dinero. Consideramos que las bibliotecas adecuadas para secuenciación de próxima generación (NGS) cuando el enriquecimiento de los controles positivos de más de 25 - y 75 veces (para primer pares 3 y 4, respectivamente) en comparación con los controles negativos (figura 3B) y cuando muestran la se mencionó anteriormente nucleosomal, escalera-como aspecto. Al analizar datos qPCR, también estamos verificando que los valores de Cq para cartillas de control positivos y negativos son similares en las reacciones con el ADN genómico como plantilla y que la Cq valores para las regiones de control negativo (en las reacciones con el ADN de ATAC-seq fragmentos) son constantes entre los experimentos de. Por ejemplo, en el caso de repente menores valores de Cq, sospechamos que los núcleos eran demasiado transpuestos y así fragmentos de ADN procedentes de regiones de heterocromatina están sobrerrepresentados. Por otra parte, si la imagen de gel (obtenida por electroforesis de basados en cinta de alta sensibilidad) de las bibliotecas de ATAC-seq indica la presencia de los adaptadores (~ 120 bp), excesiva degradación del ADN (la mayoría de los fragmentos son ~ 200 bp), o grandes fragmentos (más de 1 kb), no seguiría el paso NGS.
Además, siempre realizamos NGS inicial en el cual buscamos lecturas 10 millones por biblioteca. Si los resultados de esta secuencia son satisfactorios (la muestra pasa todos los parámetros FastQC en archivo de informe y podemos obtener picos de 1000-2000 después de realizar llamadas de pico), las bibliotecas están ordenadas más profundamente (más de 30 millones de lecturas/ATAC-seq biblioteca).
En ATAC-seq experimentos en células de mamífero, en cualquier lugar de ~ 30-70% de la secuencia Lee puede venir del mtDNA10. Por el contrario, nuestras bibliotecas contienen Lee de 6-20% asignado al genoma mitocondrial. Esto es menor que el reportado 46% en la biblioteca de ATAC-seq de humano de los linfocitos T CD4 +1. Después de eliminar estos contaminantes Lee, nos quedamos con 7 millones Lee única asignación para el genoma humano de referencia (58% - 91% de todas las lecturas). De éstos, 0.1 - Lee 2 millones (6.8% - 12% de todas las lecturas) estaban en ATAC-seq picos (figura 4).
Figura 1 . Flujo de trabajo de medidas experimentales. Representación de los principales pasos de este protocolo de ATAC-seq. Puntos de parada se indican mediante hexágonos amarillos. Un paso opcional se representa con un hexágono naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Cálculo del número de ciclos PCR necesaria para el enriquecimiento final de ATAC-seq bibliotecas adicional. Curvas de amplificación de PCR de tres bibliotecas de seq ATAC diferentes se muestran en rojo, azul y rosa. Las reacciones de amplificación alcanzaron una meseta en 2.350 RFU (línea horizontal verde superior). El número de ciclos PCR adicionales intersecta con 783 RFU (2.350/3) en la curva de amplificación. Dos bibliotecas (rojas y azul) requieren 8 ciclos de amplificación adicional, mientras que la tercera biblioteca (rosa) requiere 9 ciclos. Control (NTC) de la plantilla no se muestra como la línea verde inferior. Eje x, número del ciclo. Eje, unidades de la RFU. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Análisis de control de calidad de las bibliotecas de ATAC-seq. (A) resultados de la electroforesis automatizada basados en cinta de bibliotecas de ATAC-seq amplificadas. L, escala; A-D, bibliotecas de biológico repite de células Th1 y Th2. (B) análisis de control de calidad de qPCR de ATAC-seq bibliotecas. Cuatro bibliotecas de ATAC-seq y ADN genómico fueron amplificadas por pares de la cartilla de control negativo (1 y 2) y las cartillas de control positivo (3 y 4). Los valores obtenidos para las bibliotecas de ATAC-seq (azul) primero se normalizaron los niveles de amplificación de ADN genómico (establecida arbitrariamente en un valor de 1; rojo). Posteriormente, se normalizaron los valores de las regiones de control positivo a las regiones de control negativo (gráfico inferior). Bibliotecas de #1 y #2 fueron enviadas a la secuencia de NGS. Los valores representan la media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Navegador de genoma snapsh ots de regiones accesibles de la cromatina en las células Th1 y Th2. Pistas de ATAC-seq se muestran NFKB1, JUN, CD28, IFNG (expresada sólo en Th1) y IL4 y IL13 (expresada sólo en Th2) loci en células Th1 y Th2 (biológico dos repeticiones para cada uno). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Buffer de TD | 50 | ΜL |
| Transposasa TDE1 | 5 | ΜL |
| Agua libre de nucleasas | 45 | ΜL |
| Volumen total | 100 | ΜL |
Tabla 1: Preparación de la mezcla de reacción de transposición de.
| Biblioteca de ATAC-seq | 15 | ΜL |
| Cartilla 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabla 2: Componentes de la mezcla de reacción PCR inicial (paso 5.1.1.).
| PASO DE CICLO | TEMPERATURA | TIEMPO | CICLOS DE |
| Extensión * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | 5 |
| De recocido | 63 ° C | 30 s | |
| Extensión | 72 ° C | 3 min | |
| Mantenga | 4 ° C | ∞ | |
| * Este paso es necesaria ampliar tanto | |||
| extremos de las bases después de la reacción de transposición. | |||
Tabla 3: Condiciones ciclo PCR para la amplificación inicial de la biblioteca (paso 5.1.2.)
| Alícuota de reacción de PCR (paso 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Cartilla 1 (Ad1_noMx) ** | 1 | ΜL |
| Cartilla 2 | 1 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 7.5 | ΜL |
| Agua libre de nucleasas | 0.5 | ΜL |
| Volumen total | 15 | ΜL |
| Para el control de plantilla no en lugar de la plantilla de la DNA añadir agua ultra pura. | ||
| ** La concentración final de cada cartilla es 417 nM. | ||
| Uso recomendado: mezcla principal para qPCR. | ||
| Debe contener polimerasa, dNTPs, MgCl2y colorante fluorescente. | ||
Tabla 4: Preparación de mezcla de reacción de qPCR (paso 5.2.2).
| PASO DE CICLO | TEMPERATURA | TIEMPO | CICLOS DE |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | 20 |
| De recocido | 63 ° C | 30 s | |
| Extensión | 72 ° C | 3 min | |
| Mantenga | 4 ° C | ∞ |
Tabla 5: Ciclismo condiciones para la evaluación basada en qPCR de más número de ciclos de amplificación (N) (paso 5.2.3.)
| PASO DE CICLO | TEMPERATURA | TIEMPO | CICLOS DE |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | N |
| De recocido | 63 ° C | 30 s | |
| Extensión | 72 ° C | 3 min | |
| Mantenga | 4 ° C | ∞ |
Tabla 6: Ciclismo condiciones para el paso de enriquecimiento PCR final (paso 5.3.).
| Para una sola reacción de PCR: | ||
| Dilución de la biblioteca de ADN genómico | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 o F2 o F3 o F4) * | 0.3 | ΜL |
| 10 μM Primer R (R1 o R2 o R3 o R4) ** | 0.3 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 5 | ΜL |
| Agua libre de nucleasas | 1.9 | ΜL |
| Volumen total | 10 | ΜL |
| * La concentración final de cada cartilla de la mezcla de reacción es de 300 nM. | ||
| ** Si uso primer F1 de la cartilla de R debe ser R1 etcetera. | ||
| Uso preferido 2 x master mix adecuado para el instrumento de qPCR en su laboratorio. | ||
Tabla 7: Condiciones de reacción para el análisis de control de calidad (paso 7.1.3.).
| Blanco | Muestra | Quiere decir Cq | CQ SEM | Cantidad relativa | Normalizado | |
| 1 | Control negativo | ATAC-seq | 30.39 | 0.11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30.4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0.09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | Control positivo | ATAC-seq | 23.27 | 0.03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30.7 | 0.06 | 0.01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21.55 | 0.24 | 1 | 750.31 | |
Tabla 8: Cálculo del enriquecimiento de controles positivos, controles negativos (paso 7.1.5.).
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Discussion
El protocolo de ATAC-seq descrito aquí se ha empleado con éxito para el análisis de la cromatina accesible en células primarias (humano Th1, Th2 células y células B) así como las líneas de cultivo de células (células de cáncer de mama humanas MCF10A y células de glioblastoma U261). Aplicación de ATAC-seq a otros tipos celulares puede requerir algunos optimización de protocolo, especialmente en el paso de lisis. Si la concentración de detergente no iónico es demasiado alta, puede haber un porcentaje mayor de contaminación del ADN mitocondrial. Esto se puede reducir disminuyendo la concentración de detergente en el buffer de lisis sin reducir el rendimiento de los núcleos. En nuestra experiencia, el tampón de lisis con 0.05% de detergente dio los resultados más satisfactorios. Además, girando el núcleo en un cubo de swing en vez de rotor de ángulo fijo permitida reducir la fuerza de G a 500, que redujo las mitocondrias en el sedimento. Los investigadores también pueden probar otros tipos de detergentes, por ejemplo, digitonin17. Sin embargo, aún con condiciones optimizadas de lisis, mtDNA contaminación es inevitable. Para quitar por completo el ADNmt, el sistema CRISPR/Cas9 puede ser utilizado15. En este caso, bibliotecas de ATAC-seq se incuban con sgRNAs blanco mtDNA y nucleasa Cas9 para digerir mtDNA15.
El número de núcleos necesarios para este protocolo de ATAC-seq (100.000) se puede limitar en casos donde el numero de celular de muestras clínicas es escasos7. ATAC-seq ha sido exitosamente escalado hasta 5.000 y 500 células1,13,17 reduciendo el volumen de reacción1,13, realizar limpieza con granos magnéticos en lugar de con columnas 13, o evitar el paso de limpieza1. Además, puede realizarse sola célula ATAC-seq (scATAC-seq) usando un dispositivo de microfluidos para separar núcleos individuales16. En particular, otros métodos para medir la accesibilidad de la cromatina, como la DNasa-seq y FAIRE-seq, requieren más material de partida y unos días más para realizar el experimento.
Ahora es muy apreciado que los sesgos en diversos métodos NGS son fenómenos comunes25. Una de las causas de las variaciones en las medidas de accesibilidad diferentes cromatina es la hendidura enzimática paso25. Se ha demostrado que la DNasa I muestra escote diagonal26 y ahora se reconoce que el Tn5 transposasa muestra preferencia de escote así27. Afortunadamente, los posibles sesgos pueden identificarse computacionalmente mediante el uso de una tubería de control de calidad como ChiLin28. Otra fuente común de sesgo es de20,de paso de amplificación de PCR25. Esto con frecuencia se manifiesta como un sesgo para la amplificación de GC-ricos fragmentos25. Puesto que el sesgo aumenta con cada paso de amplificación de PCR, no exceder 9 ciclos adicionales (N) en la amplificación de PCR final de ATAC-seq bibliotecas.
La proporción adecuada entre Tn5 transposasa y núcleos es fundamental para éxito de ATAC-seq2. Un exceso de enzima conduciría a "más de transposición" en inaccesibles y de gran fondo. Esto se refleja en la alta amplificación de las regiones de control negativo en el paso de control de calidad de qPCR. Un exceso de núcleos daría lugar a "insuficiente transposición". En este caso, sitios de escote muy lejano resultará en menos fragmentos amplificados por PCR y la biblioteca baja complejidad. Para determinar con precisión el número de núcleos, hemos introducido un paso adicional de la cuenta después de la lisis celular y antes de la reacción de transposición.
Accesibilidad de cromatina es una capa de regulación epigenética importante ya que permite la actividad de los reguladores de la transcripción en localizaciones genómicas específicas. Así, la secuencia de ADN dentro del perfil de cromatina accesible ofrece una gran cantidad de información sobre los lugares geométricos de identidad y el destino de decenas de factores de transcripción posible. La combinación de esta información (obtenida por ATAC-seq) con un perfil de expresión de RNA permite un enfoque en los factores de transcripción correspondientes que pueden analizarse más por ChIP-seq13,22. Además, sólo el 10% de polimorfismos asociados a la enfermedad están en la codificación del genoma30. Así la aplicación ATAC-seq para muestras clínicas puede revelar cual de las variantes de codificación no son elementos regulatorios que pueden afectar la regulación de los genes en el estado de enfermedad (por ejemplo, en el lupus eritematoso sistémico8). Esperamos que este protocolo de ATAC-seq se ayudar y animar a los investigadores interesados a utilizar este poderoso método para avanzar en su investigación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie de integración otorga (CIG) - FP7-gente-20013-CIG-618763 y I-CORE programa de planificación y Comisión de presupuesto y el Israel Science Foundation beca nº 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
