Summary
Test för Transposase-tillgänglig kromatin i kombination med hög genomströmning sekvensering (ATAC-seq) är en genome-wide metod att avslöja tillgänglig kromatin. Detta är en steg för steg ATAC-seq protokoll, från molekylär till den slutliga computational analysen, optimerad för humana lymfocyter (Th1/Th2). Detta protokoll kan antas av forskare utan tidigare erfarenhet av nästa generations sekvenseringsmetoder.
Abstract
Analysen för Transposase-tillgänglig kromatin med hög genomströmning sekvensering (ATAC-seq) är en metod som används för identifiering av öppna (tillgänglig) regioner av kromatin. Dessa regioner utgör regulatoriska DNA-element (t.ex., initiativtagare, smakförstärkare, locus kontroll regioner, isolatorer) som transkription faktorer bindas. Mappa tillgänglig kromatin landskapet är en kraftfull metod för avtäckning aktiva tillsyn element hela genomet. Informationen fungerar som en objektiv metod för att upptäcka nätverket av relevanta transkriptionsfaktorer och mekanismer av kromatinstruktur som reglerar gen uttryck program. ATAC-seq är en robust och känsliga alternativ till DNAS jag överkänslighet analys tillsammans med nästa generations sekvensering (DNAS-seq) och formaldehyd-assisted isolering av reglerande element (FAIRE-seq) för genome-wide analys av kromatin tillgänglighet och sekvensering av micrococcal nuclease-känsliga platser (MNase-seq) för att bestämma nukleosomens positionering. Vi presenterar en detaljerad ATAC-seq protokoll optimerad för mänskliga primär immune cells dvs CD4 + lymfocyter (T helper 1 (Th1) och Th2-celler). Denna omfattande protokoll börjar med cellen skörd, sedan beskriver den molekylära arbetsordning kromatin tagmentation, provberedning för nästa generations sekvensering, och också innehåller metoder och överväganden för de computational analyser används för att tolka resultaten. Dessutom, för att spara tid och pengar, införde vi kvalitetskontroll åtgärder för att bedöma ATAC-seq biblioteket före sekvensering. Ännu viktigare, tillåter de principer som presenteras i detta protokoll anpassning till andra mänskliga immun och icke-immun primära celler och cellinjer. Dessa riktlinjer kommer också vara användbart för laboratorier som inte är skicklig med nästa generations sekvenseringsmetoder.
Introduction
ATAC-seq1,2 är en robust metod som möjliggör identifiering av reglerande3 öppen kromatin-regioner och nukleosomens placering. Denna information används för inferring plats, identitet och aktiviteten av transkriptionsfaktorer. Metodens känslighet för att mäta kvantitativa variationer i kromatinstrukturen tillåter studier av aktiviteten av kromatin faktorer, inklusive kromatin remodelers och modifierare, samt transkriptionell aktiviteten av RNA-polymeras II1. ATAC-seq ger således en kraftfull och opartiska förhållningssätt för att dechiffrera mekanismer som reglerar Transkriptionsreglering i någon celltyp av intresse. Vi beskriver en anpassning av ATAC-seq till primära mänskliga Th1 och Th2-celler.
I ATAC-seq, hyperaktiva Tn5 transposase laddad med adaptrar för nästa generations sekvensering (NGS) par DNA-fragmentering med taggning av DNA med adaptrar (dvs, ”tagmentation” processen)1. Efter PCR-amplifiering är resulterande DNA biblioteken redo för nästa generations sekvensering (figur 1). De förmånliga tagmentation av tillgängliga kromatin identifieras genom analys av lokala anrikning av ATAC-seq sekvensering läser.
Kort experimentella förfarandet och krav på mindre utgångsmaterial, i förhållande till andra metoder för att mäta kromatin tillgänglighet och nucleosomal positionering som DNAS-seq4, FAIRE-seq5och MNase-seq6, har främjat användningen av ATAC-seq i flera biologiska system, inklusive människans primära celler1,7 och kliniska prover8, samt encelliga organismer9, växter10, bananflugor11 , och olika däggdjur12.
Identiteten för transkription faktorer som är bundna till tillgänglig loci kan vara avslöjats av analysera anrikningen av sina bindande sekvens motiv eller kombinera ATAC-seq med kromatin immunoprecipitation (ChIP) följt av hög genomströmning DNA sekvensering ( ChIP-seq). Detta tillvägagångssätt aktiverat identifiering av härstamning-specifika transkriptionsfaktorer viktigt för blodbildning i mus13. Den opartiska och globala karaktären hos ATAC-seq kan studera genreglering i organismer som reagens såsom antikroppar för ChIP analys inte finns. Till exempel evolutionära variationer i cis-regulatoriska regioner har identifierats genom att studera kraniala neural crest celler från människor och schimpanser14, utvecklingsmässiga variationer i föreskrivande element under tidig mus embryogenes15, förändringar i regelverk landskapet under en livscykel encelliga C. owzarzaki9, och utvecklingen av projektansvariga och smakförstärkare över 20 däggdjur arter12.
ATAC-seq har också varit avgörande för att mäta kromatin tillgänglighet i enstaka celler, således avslöjande variabilitet inom cellpopulationer, som vanligtvis undviker genome-wide studier7,16. ATAC-seq kan dessutom användas för att studera förändringar som sker i DNA regulatoriska regioner i sjukdomstillstånd, där prover är sällsynta. Till exempel ATAC-seq kan användas för att studera förändringar i regelverk landskapet under uppkomsten av akut myeloisk leukemi (AML)17 eller Ras-driven Onkogenes11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla förfaranden godkändes av institutionella granskningsnämnd Bar Ilan universitetet och protokollet följer riktlinjer som tillhandahålls av kommittén godkänna experimenten.
1. rening av naiva mänskliga CD4 + celler och polarisering T Helper 1 (Th1) och Th2-celler
Obs: här beskriver vi proceduren start från frysta människans perifera mononukleära blodceller (PBMC). Det första steget består av isolera CD4 + celler med mikrokulor och kolumner som vanligtvis ge oss mer än 95% av CD4 +-celler. Men, detta steg kan variera enligt Rekommenderad protokollet i varje labb. Protokollet för T-cellaktivering och polarisering ändrades från Jenner o.a. (2009) 18. isolering av CD4 +-celler från 10 miljoner PBMC ger upphov till 4-6 miljoner av CD4 +-celler. De är uppdelad i två kolvar och odlats under Th1 och Th2 polariserande villkor högproducerande 3-5 miljoner Th1 och Th2-celler inom bara en vecka.
Obs: svalna av centrifugen till 4 ° C före start.
- Tina 1 mL av mänskliga PBMC (10 7 celler) i en 50 mL tub innehållande 10 mL RPMI medium kompletteras med 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-glutamin och 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum. Centrifugera 500 x g i 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna med en steril 25 mL pipett i 15 mL kompletterade RPMI medium. Flytta cellerna (med steril 25 mL pipett) till en T75 kultur mätkolv.
- Lämnar cellerna över natten i en fuktad inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Överför flytande cellerna med en steril 25 mL pipett till 50 mL tub. Bestämma antalet celler och livskraft genom trypan blå uteslutning.
- Isolera CD4 +-celler från 10 miljoner levande icke-anhängare PBMC av positiva urval med hjälp av CD4 + mikrokulor och kolumner enligt tillverkaren ' s rekommendationer (se Tabell av material/utrustning) med följande modifieringar: 10 7 PBMC är märkta med 30 µL av CD4 mikrokulor i 120 µL 0,5% BSA i PBS.
- Aktivera CD4 + T-cellerna för 72 h genom rhIL-2 (10 ng/mL), plattan-bundna anti-CD3 (5 µg/mL) och lösliga anti-CD28 (2 µg/mL). För Th1 polarisering, lägga till rhIL-12 (20 ng/mL) och anti-IL-4 (10 µg/mL). För Th2 polarisering, lägga till rhIL-4 (40 ng/mL) och anti-IFN-γ (10 µg/mL).
- Odla cellerna för ytterligare 7 dagar i närvaro av rhIL-2 (10 ng/mL) och den samma polariserande cytokiner (rhIL-12 för Th1 och rhIL-4 för Th2).
2. Atomkärnor isolering
Obs: ATAC-seq utförs med intakt atomkärnor. Lysis buffert innehållande 0,05% nonylphenyl polyetylenglykol var (se Tabell av material/utrustning) kalibreras för att isolera kärnor från primära mänskliga Th1 och Th2-celler. Vi rekommenderar att kalibrera detta steg med laboratoriereagenser och celler. Ett överskott av intakta celler från otillräcklig mängd tvättmedel minskar effektiviteten i införlivandet reaktionen. Cell lysis effektivitet bestäms av antalet kärnor (trypan blå positiva celler) i förhållande till det totala antalet celler.
Obs: Förbereda lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2). Svalna av en centrifug med en swing-hink rotor till 4 ° C. pelletering cellerna i en swing-hink centrifug istället för en fast vinkel centrifug minskar cellkärna/förlust. Att undvika kärnor eller cellförlust, Pipettera försiktigt när kasta bort supernatanten.
- Lägg färska nonylphenyl polyetylenglykol (till en slutlig koncentration på 0,05%) och 100 x proteashämmare (till en slutlig koncentration av 1 x) till det kalla lyseringsbuffert omedelbart före användning. Hålla bufferten på ice.
- Antal T-celler att bestämma deras belopp och livskraft med trypan blå-metoden. Lönsamhet som är lägre än 90% resulterar i högre icke-specifik matsmältning.
- Överföring 0,5 x 10 6 T celler (Th1 eller Th2) till 1,5 mL mikrorör. Snurra ner vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning. Snurra ner vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL kall lyseringsbuffert (innehållande nonylphenyl polyetylenglykol och proteashämmare). Håll röret på is. Pipetten försiktigt för att inte störa atomkärnor.
- Snabbt ta 10 µL och räkna cellerna med en automatisk cell räknare medan mikroröret med lyserat celler är på is. Detta steg bör inte överstiga fem minuter för att undvika att skada atomkärnor. Minst 80% av cellerna bör vara lyserat.
- Fortsätt omedelbart med införlivandet reaktionen. Hålla den beredda kärnan på ice.
3. Införlivande reaktion
Observera: I detta steg isolerade atomkärnor inkuberas med prokaryota Tn5 transposase (TDE1) lastad med adaptrar för NGS sekvensering. Hyperaktiv Tn5 samtidigt fragment DNA och ligates adaptrar till tillgängliga regioner i genomet (tagmentation process). Förhållandet mellan kärnor och Tn5 transposase är kritiskt för förmånliga klyvning på tillgängliga kromatin. Detta protokoll är kalibrerad för 100.000 atomkärnor i ett 100 μl reaktionsvolym. Dock reaktionen kan skalas.
- Inställd temperatur i en termisk shaker till 37 ° C.
- Överföra 100 000 kärnor till en 1,5 mL mikrorör.
- Centrifugera vid 500 x g under 10 minuter vid 4 ° C och skonsamt avlägsna supernatanten.
- Lägg till införlivande reaktion komponenterna till kärnor som anges i tabell 1.
- Omsuspendera av mild pipettering.
- Inkubera införlivande reaktionen i en termisk shaker vid 37 ° C i 30 min med mild skakar (500 rpm).
Obs: DNA rensningen utförs av fasta fasen reversibel immobilisering pärlor 19 (se Tabell av material/utrustning) eller PCR rening kolumner. I slutet av rensningen, eluera DNA fragmenten i 20 µL av 10 mM Tris-HCl, pH 8. Undvika EDTA i eluering bufferten.
4. PCR-anrikning av ATAC-seq bibliotek
Obs: detta steg syftar till att förstärka ATAC-seq bibliotek dvs DNA fragmenten med infogade adaptrar. Att tillåta blandning av flera ATAC-seq bibliotek i samma nästa generations sekvensering körfält (" multiplexing ") användning inte är indexerade Primer 1 (Ad1_noMx) 1 för alla prover, och en annan indexerade (barcoded) Primer 2 (Ad 2.1-2.24) 1 för varje prov. Primer sekvenser finns i kompletterade Tabell av material/utrustning.
- Inledande PCR-amplifiering
Obs: arbetande koncentrationen av Primer 1 (Ad1_noMx) och Primer 2 är 25 µM. Alla primers späds från ursprungliga lager 100 µm 25 µm. I alla de PCR-reaktionerna, använda Primer 1 (Ad1_noMx) och endast en av indexerade Primer 2.- Lägg till komponenter i PCR-reaktionen som anges i tabell 2 till en steril PCR-röret.
- Plats PCR röret till en termocykel och utför PCR-amplifiering med cykling villkoren i tabell 3.
- Bedömning av antalet ytterligare förstärkning cykler
Obs: antalet ytterligare PCR cykler bör ge tillräcklig mängd bibliotek fragment feller en framgångsrik nästa generations sekvensering kör, medan minimeras för att undvika GC och storlek bias 20. Bestämning av antalet PCR-cykler (N) krävs för optimal bibliotek fragment förstärkning sker genom kvantitativ PCR (qPCR).- Utspädd grundfärg 1 (Ad1_noMx) och 2 (används för inledande bibliotek förstärkning) från 25 µM till 6,25 µM.
- Lägga till komponenter till optiska PCR-rör eller en tallrik som anges i tabell 4.
- Plats i en qPCR instrumentet och cykel som anges i tabell 5.
- För att uppskatta antalet krävs för ytterligare förstärkning cykler (N), tomt cykel nummer på x-axeln och relativa fluorescens (RFU) på y-axeln.
- Antalet ytterligare förstärkning cykler (N) är 1/3 av antalet cykler som qPCR reaktionen nått platån. figur 2 ger exempel för tre ATAC-seq bibliotek som nått platå på ~ 2,350 relativa fluorescens enheter, RFU (tjock grön linje). Antalet PCR cykler där en tredjedel av det maximala beloppet (783 RFU, märkt på y-axeln) förstärks motsvarar 8 cykler för två av biblioteken (röd och Blå förstärkning kurvor) och 9 PCR cykler för tredje biblioteket (rosa).
- Slutliga PCR-amplifiering
- förstärker de återstående 45 µL av PCR-reaktionen. Placera en PCR-röret som innehåller förstärkning reaktion från steg 4.1.2 i en termocykel. Kör programmet PCR beskrivs i tabell 6. Använd tidigare fastställd (steg 4.2.5) antal förstärkning cykler (N).
5. Storlek urval av ATAC-Seq bibliotek
Obs: vår erfarenhet storlek urval av förstärkta ATAC-seq bibliotek förbättrar nästa generations sekvensering resultat eftersom det eliminerar höga molekylvikt bibliotek fragment från den slutliga ATAC-seq bibliotek.
Obs: Tillåta magnetiska pärlor för att värmas till rumstemperatur 30 min innan användning.
Förbereda färska 70% etanol i nuclease-fria vatten.
- Omsuspendera magnetiska pärlor genom att blanda.
- Lägga till nuclease-fritt vatten i ATAC-seq biblioteken (erhålls i steg 4.3.1.) och föra upp till 100 µL.
- Lägga till 50 µL (0,5 x) av återsuspenderade DNA-bindande magnetiska pärlor till 100 µL av förstärkt bibliotek. Blanda genom pipettering upp och ner minst 10 gånger. Inkubera prover för 5 min i rumstemperatur. Om det behövs snabbt snurra ner mikrorör.
- Placera röret på en lämplig magnetisk stå för 2 min att separera de magnetiska pärlorna från supernatanten. Efter 2 min, överför supernatanten till ett nytt mikrorör.
- Mäta volymen av supernatanten genom pipettering och lägga till 0.7 x av magnetiska pärlor. Mix av pipettering upp och ner minst 10 gånger.
- Inkubera 5 min i rumstemperatur. Plats på en magnetisk stå för 2 min.
- Efter the 2 minuters inkubation, Kassera supernatanten. Tillsätt 200 µL nygjorda 70% etanol för att tvätta pärlor medan rören på magnetiska stativet.
- Hålla mikroröret på magneten för 30 s och sedan kassera etanolen. Upprepa steg 5.7.for två slutliga etanol tvättar.
- Helt ta bort återstående etanol och låt pärlorna lufttorka för 5 min när röret är på magneten. Om det behövs kort snurra mikroröret. Ta bort spår av etanol med en p10 pipettspetsen.
- Ta bort mikroröret från magneten och tillsätt 22 µL 10 mm Tris-HCl, pH 8. Inte eluera ATAC-seq biblioteken i buffert som innehåller EDTA.
- Inkubera röret i 2 min i rumstemperatur och sedan placera på magnetiska stativet.
- När lösningen är klar, överför 20 µL av eluerade bibliotek till en ny steril mikrorör.
- Store storlek valde ATAC-seq bibliotek vid -20 ° C.
6. Kvalitetsanalys av ATAC-Seq bibliotek
- validering av kvaliteten på ATAC-seq bibliotek med Real-Time PCR
Obs: det är viktigt att bedöma signal-brusförhållandet ATAC-seq bibliotek innan nästa generations sekvensering. Detta görs genom att bestämma den relativa mängden DNA-fragment från nås och otillgängliga loci med kvantitativ PCR (qPCR). De otillgängliga loci (negativ kontroll, chr1:48, 137, 860-48,137,934 och chr1:193, 093, 748-193,093,827) förstärks av primer par 1 och 2. De tillgängliga loci (positiv kontroll, chr19:30, 336, 166-30,336,253 och chr19:11546154-11546237) förstärks av primer par 3 och 4. Positiva och negativa loci definierades från kromatin tillgänglighet (DHS-seq) profiler av mänskliga CD4 + celler (koda anslutningarna ENCSR000EQE och ENCSR000EQG). Negativa primer 1 ligger i en stor heterochromatic intergenic region (230 kb från TRADB2 och 88 kb från FOXD2). Negativ kontrollregion 2 ligger i den första intron av CDC73-genen. Positiv primer par 3 är inom en öppen kromatin region nedströms av cyklin E (CCNE1) genen medan positiv primer par 4 centreras inom främjare av protein kinase C substrat 80K-H (PRKCSH). Ännu viktigare, visar dessa kontroll-lokus ett liknande mönster av tillgänglighet i andra människors celltyper från koda projektet 3, vilket tyder på att de kan användas för att övervaka ATAC-seq bibliotek från ett brett spektrum av typer av mänskliga celler. Primer effektivitet och specificitet av alla primer par kontrollerades av qPCR på en seriell utspädning av genomisk DNA (från mänskliga Th-celler) och en smältande kurva analys av erhållna förstärkta produkter.- Isolera genomiskt DNA använder en kommersiellt tillgänglig kit (se Tabell av material/utrustning).
- Späd den förstärkta ATAC-seq bibliotek 1:10 (1 µL bibliotek + 9 µL nuclease-fritt vatten) och genomiskt DNA till ~ 5 ng/µL.
- Inför varje positiv och negativ kontroll primer par, med hänsyn till att reaktionerna sker i tre exemplar reaktionsblandningen (tabell 7).
- Inkubera i qPCR termocykel enligt protokollet rekommenderas av qPCR huvudmixen leverantör.
- Analysera resultaten i qPCR instrumentet ' s programvara (se Tabell av material/utrustning). Välj genomiskt DNA som kontrollprov. De erhållna värdena representerar en anrikning av tillgängliga regioner (förstärks av positiv kontroll primrar). Ett exempel visas i tabell 8.
Obs: Uppskattning av genomsnittliga bibliotek storlek och koncentration: storleksfördelning av DNA-fragment från ATAC-seq bibliotek bestäms av hög känslighet automatiserade electrophoresis system enligt tillverkaren ' anvisningar. Det är tillrådligt att mäta prov koncentrationen på en fluorometer med dsDNA hög känslighet kit och minst 2 µL av varje DNA-prov.
Obs: Nästa generations sekvensering - före multiplexing biblioteken, beräkna molariteten av varje ATAC-seq-bibliotek med hjälp av formeln: (ng/µL x 10 6) / (660 x genomsnittliga bibliotek fragment längd). Sikta på > 30 miljoner läser i varje ATAC-seq bibliotek att bedöma öppen kromatin regioner av mänskliga prover. Om du vill avgöra om biblioteket är bra nog för NGS sekvensering, initialt sträva efter ~ 10 miljoner läsningar (5% av sekvensering lane på DNA sekvensering instrument i snabba körningsläge). Tänk på att för att härleda nukleosomens positionering, Parade-end sekvensering är behövs 1.
7. Analys av resultaten erhållits nästa generations sekvensering
- härleda kvaliteten av sekvensering läser genom att inspektera FastQC filer, separat för varje bibliotek.
- Justera den läser mänsklig referens genomet (hg19 församlingen) med Bowtie 21 programvara i Unix/Linux-miljö. Kommandot är ' bowtie -m 1 - q -S genomet katalog reads.fastq output_aligned.sam '. Genomet katalog står för mappen där genomet index av Bowtie lagras. Den parameter -m 1 är inte tillåter justering av läser till mer än en locus i genomet, - q är för den indatafil som ska vara i fastq format, -S är för utdata i SAM format.
- Ta bort duplicerade läsningar med SAMtools 22 rmdup alternativ i Unix/Linux-miljö. Kommandona är ' samtools Visa -S output_aligned.sam -b | samtools sortera -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Det första kommandot, Visa, ändrar SAM i BAM-format som sorteras sedan. Möjlighet att rmdup tillämpas sedan på sorterade BAM filen. Alternativt kan man justera läser för transposon insticksstället, som beskrivs i den ursprungliga ATAC-seq papper 1. Detta görs med hjälp BEDtools kommandon 23 i Unix/Linux-miljö. Kommandona är ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g genomet > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Det första kommandot, bamTobed, ändrar BAM i säng-format som sedan kan användas för kommandot shiftBed. Genomet filen är en tab avgränsad fil som innehåller längden på varje kromosom i genomet. Filen läggs vanligtvis i katalogen BEDtools. - Utför peak samtal med modellbaserad analys av ChIP-seq (MACS2) 24 programvara i Unix/Linux-miljö på skiftade BED filen med följande parametrar:--nomodel--extsize 75--skift -30. Dessa parametrar används för att justera läser så att transposon insticksstället är i mitten av varje sekvensering Läs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slutresultatet av detta protokoll är en ATAC-seq bibliotek med typiskt 3-20 ng/µL. När den körs på ett system för DNA integritet-analys (se Tabell av material/utrustning), de visar stege-liknande utseende2 (figur 3A). Den genomsnittliga storleken på DNA-fragmenten är vanligtvis ~ 450-530 bp.
Ordentlig kvalitetskontroll av ATAC-seq bibliotek innan du utför nästa generations sekvensering är viktigt att spara tid och pengar. Vi anser biblioteken passar nästa generations sekvensering (NGS) när anrikningen av positiva kontroller är mer än 25 och 75 gånger (för primer par 3 och 4, respektive) i förhållande till negativa kontroller (figur 3B) och när de visar den tidigare nämnt nucleosomal, stege-liknande utseende. När man analyserar qPCR data, verifiera vi också att Cq värdena för negativa och positiva kontroll primers är liknande i reaktioner med genomiskt DNA som mall och att Cq värden för Regionkommittén negativ kontroll (i reaktioner med ATAC-seq DNA fragmenten) är konstant mellan experimenten. Till exempel när det gäller plötsligt lägre Cq värden misstänker vi att atomkärnor var alltför införlivade och således DNA-fragment med ursprung från Heterokromatin regioner är överrepresenterade. Dessutom om gel bilden (erhålls av hög känslighet bandbaserad elektrofores) av ATAC-seq bibliotek anger förekomsten av adaptrar (~ 120 bp), överdriven DNA nedbrytning (flesta fragmenten är ~ 200 bp), eller stora fragment (över 1 kb), vi inte skulle fortsätta till NGS steg.
Dessutom utför vi alltid första NGS där vi sikta på 10 miljoner läsningar per bibliotek. Om resultaten av denna sekvensering är tillfredsställande (provet passerar alla parametrar i FastQC rapportfilen och vi kan få 1000-2000 toppar efter utför peak ringer), biblioteken är sekvenserade djupare (mer än 30 miljoner läsningar/ATAC-seq bibliotek).
I ATAC-seq experimenterar på däggdjursceller någonstans från ~ 30-70% av sekvenserade läser kan komma från mtDNA10. Däremot innehöll våra bibliotek 6-20% läser mappas till det mitokondriella genomet. Detta är lägre än den redovisade 46% i ATAC-seq biblioteket från humana CD4 + T-lymfocyter1. Efter att eliminera dessa kontaminerande läsningar, lämnades vi med ~ 7-32 miljoner unika läser mappning till det mänskliga genomet för referens (58% - 91% av alla läser). Från dessa, 0,1 - var 2 miljoner läsningar (6,8% - 12% av alla läser) i ATAC-seq toppar (figur 4).
Figur 1 . Arbetsflödet för experimentell steg. Representation av stora stegen i ATAC-seq protokollet. Stoppa punkter markeras med gul hexagoner. Ett valfritt steg representeras med en orange hexagon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Beräkning av antalet ytterligare PCR cykler krävs för slutliga anrikningen av ATAC-seq bibliotek. PCR-amplifiering kurvor för tre olika ATAC seq bibliotek visas i rött, blått och rosa. Förstärkning reaktionerna nått en platå på 2 350 RFU (övre gröna vågräta linjen). Antalet ytterligare PCR cykler skär med 783 RFU (2,350/3) på förstärkning kurvan. Två bibliotek (röd och blå) kräver 8 ytterligare förstärkning cykler medan det tredje biblioteket (rosa) kräver 9 cykler. Icke-mall kontroll (NTC) visas som den lägsta gröna linjen. X-axeln, cykel nummer. Y-axeln, RFU enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Kvalitetskontroll analys av ATAC-seq bibliotek. (A) resultaten av bandbaserat automatiserat elektrofores av förstärkta ATAC-seq bibliotek. L, stege; A-D, bibliotek av biologiska upprepas från Th1 och Th2-celler. (B) qPCR kvalitetskontroll analys av ATAC-seq bibliotek. Genomiskt DNA och fyra ATAC-seq bibliotek var förstärks av negativ kontroll primer par (1 och 2) och positiv kontroll primers (3 och 4). De erhållna värdena för ATAC-seq bibliotek (blå) var först normaliserade till nivåerna som förstärkning av genomisk DNA (godtyckligt anges till ett värde av 1; röd). Därefter, var värden för regionerna som positiv kontroll normaliserade till de negativa kontrollen regionerna (nedre diagrammet). Bibliotek #1 och #2 skickades till NGS sekvensering. Värdena representerar medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Genomet webbläsare ö ots tillgänglig kromatin regioner i cellerna Th1 och Th2. ATAC-seq spår visas för NFKB1, JUN, CD28, IFNG (uttryckt i Th1) och IL4 och IL13 (uttryckt i Th2) loci i Th1 och Th2-celler (två biologiska repeteras för varje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| TD buffert | 50 | ΜL |
| TDE1 transposase | 5 | ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | 45 | ΜL |
| Totala volymen | 100 | ΜL |
Tabell 1: Beredning av införlivande reaktionsblandningen.
| ATAC-seq bibliotek | 15 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
Tabell 2: Komponenter i inledande PCR-reaktionsblandning (steg 5.1.1.).
| CYKEL STEG | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Förlängning * | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Inledande denaturering | 98 ° C | 30 s | |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Glödgning | 63 ° C | 30 s | |
| Förlängning | 72 ° C | 3 min | |
| Håll | 4 ° C | ∞ | |
| * Detta steg krävs för att utöka både | |||
| ändarna av primers efter införlivandet reaktion. | |||
Tabell 3: PCR-cykling villkoren för inledande bibliotek amplifiering (steg 5.1.2.)
| Delmängd av PCR-reaktionen (steg 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| Primer 1 (Ad1_noMx) ** | 1 | ΜL |
| Primer 2 | 1 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 7.5 | ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | 0,5 | ΜL |
| Totala volymen | 15 | ΜL |
| * För omallade kontroll istället för mallen DNA tillsätt ultrarent vatten. | ||
| ** Varje primer slutliga koncentration är 417 nM. | ||
| Använd Rekommenderad master mix för qPCR. | ||
| Den bör innehålla polymeras, dNTP, MgCl2och fluorescerande färg. | ||
Tabell 4: Beredning av qPCR reaktionsblandningen (steg 5.2.2).
| CYKEL STEG | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Inledande denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Glödgning | 63 ° C | 30 s | |
| Förlängning | 72 ° C | 3 min | |
| Håll | 4 ° C | ∞ |
Tabell 5: Cykling villkor för qPCR-baserad bedömning av ytterligare ett antal förstärkning cykler (N) (steg 5.2.3.)
| CYKEL STEG | TEMPERATUR | TID | CYKLER |
| Inledande denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 ° C | 10 s | N |
| Glödgning | 63 ° C | 30 s | |
| Förlängning | 72 ° C | 3 min | |
| Håll | 4 ° C | ∞ |
Tabell 6: Cykling villkoren för det sista PCR anrikning steget (steg 5.3.).
| För en enda PCR-reaktion: | ||
| Utspädning av biblioteket i genomisk DNA | 2.5 | ΜL |
| 10 μM Primer F (F1 eller F2 eller F3 eller F4) * | 0,3 | ΜL |
| 10 μM Primer R (R1 eller R2 eller R3 eller R4) ** | 0,3 | ΜL |
| 2 x SYBR master mix *** | 5 | ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | 1.9 | ΜL |
| Totala volymen | 10 | ΜL |
| * Varje primer i reaktionsblandningen slutliga koncentration är 300 nM. | ||
| ** Om använder primer F1 än R primer bör R1 etc. | ||
| Använd program 2 x master mix lämpar sig för qPCR instrumentet i ditt laboratorium. | ||
Tabell 7: Reaktion villkor för QC analys (steg 7.1.3.).
| Mål | Prov | Menar Cq | CQ SEM | Relativa kvantitet | Normaliserade | |
| 1 | Negativ kontroll | ATAC-seq | 30.39 | 0,11 | 1 | 1,01 |
| gDNA | 30,4 | 0,16 | 0,99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30,3 | 0,18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0,09 | 0,99 | 1 | ||
| 3 | Positiv kontroll | ATAC-seq | 23.27 | 0,03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30,7 | 0,06 | 0,01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21.55 | 0,24 | 1 | 750.31 | |
Tabell 8: Beräkning av berikning av positiva kontroller över negativa kontroller (steg 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det ATAC-seq-protokollet som beskrivs här har lyckat använts för analys av tillgängliga kromatin i primära celler (mänskliga Th1, Th2 celler och B-celler) samt de odlade cellinjer (MCF10A mänskliga bröstcancer cancerceller och U261 glioblastoma celler). Tillämpa ATAC-seq till andra celltyper kan kräva vissa protokoll optimering, särskilt i Lys steg. Om koncentrationen av icke-joniskt rengöringsmedel är för högt, kan det finnas en högre andel av mitokondrie DNA-kontaminering. Detta kan minskas genom att minska koncentrationen av tvättmedel i lyseringsbuffert utan att minska atomkärnor avkastningen. Vår erfarenhet gav lyseringsbuffert med 0,05% av tvättmedel de mest tillfredsställande resultaten. Dessutom snurrar kärnorna i en swing-hink istället för fast vinkel rotor tillåtet att minska G kraft till 500, vilket minskade mitokondrierna i pelleten. Forskare kan också testa andra typer av rengöringsmedel, till exempel digitonin17. Men även med optimerad lysis villkor är mtDNA kontaminering oundvikliga. Att helt ta bort mtDNA, kan det CRISPR/Cas9-systemet vara används15. I det här fallet inkuberas ATAC-seq bibliotek med sgRNAs till målet mtDNA och Cas9 nuclease att smälta mtDNA15.
Kan begränsa antalet kärnor som krävs för detta ATAC-seq protokoll (100.000) i fall där antalet celler från kliniska prover är knappa7. ATAC-seq har framgångsrikt skalats ned till 5 000 och 500 celler1,13,17 genom att minska den reaktion volym1,13, utför rensning med magnetiska pärlor istället för med kolumner 13, eller undvika rensning steg1. Dessutom kan encelliga ATAC-seq (scATAC-seq) utföras med en mikroflödessystem enhet för att separera enskilda kärnor16. Särskilt, kräver andra metoder för att mäta kromatin tillgänglighet, såsom DNAS-seq och FAIRE-seq, mer utgångsmaterial och några fler dagar att utföra experimentet.
Det är nu allmänt uppskattat att fördomar i olika NGS metoder är vanliga fenomen25. En av orsakerna till variationer i olika kromatin tillgänglighet åtgärder är enzymatisk klyvning steg25. Det har visat att DNAS jag visar klyvning bias26 och nu det är erkänt att Tn5 transposase visar klyvning preferens samt27. Lyckligtvis, den potentiella bias kan identifieras beräkningsmässigt med hjälp av en kvalitetskontroll pipeline såsom ChiLin28. En annan vanlig källa till bias är av PCR-amplifiering steg20,25. Detta yttrar ofta som en bias för förstärkning av GC-rika fragment25. Eftersom bias ökar med varje PCR-amplifiering steg, överstiger vi inte 9 ytterligare cykler (N) i den slutliga PCR-amplifieringen av ATAC-seq bibliotek.
Rätt förhållande mellan Tn5 transposase och atomkärnor är avgörande för framgångsrik ATAC-seq2. Ett överskott av enzym skulle leda till ”över införlivandet” i otillgängliga loci och hög bakgrund. Detta återspeglas i hög förstärkning av Regionkommittén negativ kontroll i steget qPCR kvalitetskontroll. Ett överskott av atomkärnor skulle leda till ”bristande införlivande”. I det här fallet kommer att alltför avlägsen klyvning platser resultera i färre PCR-förstärkta fragment och låg biblioteket komplexitet. För att bestämma antalet kärnor exakt, infört vi ett ytterligare räknar steg efter cell lysis och före införlivandet reaktionen.
Kromatin tillgänglighet är ett viktigt epigenetiska reglerande lager eftersom det tillåter aktiviteten av transkription regulatorer vid specifika genomisk platser. DNA-sekvensen i tillgängliga kromatin-profilen föreskrivs således en mängd information om de identitet och målet loci av tiotals möjligt transkriptionsfaktorer. Kombinera denna information (erhålls av ATAC-seq) med en RNA uttryck profil gör att fokusera på de relevanta transkriptionsfaktorer som kan analyseras vidare av ChIP-seq13,22. Dessutom är endast 10% av sjukdomsassocierade polymorfismer i kodning genomet30. Således gäller ATAC-seq för kliniska prover kan avslöja vilka av de icke-kodande varianterna är på reglerande faktorer som kan påverka genreglering i tillståndet sjukdom (till exempel i systemisk lupus erythematosus8). Vi hoppas att detta ATAC-seq protokoll kommer att hjälpa och uppmuntra intresserade utredarna att använda denna kraftfulla metod för att avancera deras forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie Integration bevilja (CIG) - FP7-personer-20013-CIG-618763 och jag-CORE Program för planering och budgetering kommittén och The Israel Science stiftelse beviljar nr 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
