Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט של יישום rhodamine 123 לזהות את מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (MMP) וללמוד CLIC4 נוקאאוט-induced HN4 תא אפופטוזיס בתוך חוץ גופית. תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות לייזר קונפוקלי סריקה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, נרשם השינוי בזמן אמת של MMP.
Abstract
דלדול של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים (MMP, ΔΨm) נחשב האירוע המוקדם של המפל אפופטוטיים להיפגע. הוא אפילו מופיע לפני מאפייני הגרעין אפופטוטיים להיפגע, כולל כרומטין עיבוי ו- DNA שבירה. ברגע התמוטטויות MMP, תא אפופטוזיס תיזום בלתי הפיך. סדרת lipophilic cationic צבע יכול לעבור דרך קרום התא צבירה בתוך המטריקס של מיטוכונדריון ו לשמש סמן זריחה כדי להעריך את השינוי MMP. בתור אחד של שישה חברי Cl– משפחה ערוץ תאיים (לחץ על כד), CLIC4 משתתף תהליך מוות תא בעיקר דרך השביל מיטוכונדריאלי. כאן נתאר פרוטוקול מפורט כדי למדוד MMP באמצעות ניטור קרינה פלואורסצנטית התנודות של 123 Rhodamine (Rh123), שדרכו אנחנו לומדים אפופטוזיס שנגזרות CLIC4 נוקאאוט. לדון את היתרונות ואת המגבלות של היישום של סריקת לייזר קונפוקלי ושל קרינה פלואורסצנטית רגילה במיקרוסקופ בפירוט, ואנו גם להשוות אותו עם שיטות אחרות.
Introduction
Rh123 הוא צבע cationic פלורסצנטיות, המגישה כמחוון עבור פוטנציאל transmembrane. Rh123 הוא מסוגל לחדור את קרום התא והזנת המטריקס מיטוכונדריאלי בהתאם מהפרש הפוטנציאלים של מבפנים ומבחוץ קרום1. אפופטוזיס מוביל לפגיעה של הקרומיות מיטוכונדריאלי. מיטוכונדריון חדירות מעבר הנקבובית (MPTP) לפתוח ולהוביל להתמוטט של MMP, אשר בתורו תוצאות במהדורה של Rh123 החיצוני של המיטוכונדריה. לבסוף, האות פלורסצנטיות הירוק החזק יזוהו במיקרוסקופ זריחה. זה מתועד היטב כי דלדול של MMP, חדירות הממברנה גבוהות הן סימנים מוקדמים של אפופטוזיס תא2. לכן, ניתן להחיל Rh123 הגילוי של שינוי MMP, המופע של התא אפופטוזיס.
כמו קרצינומה השישית הנפוץ ביותר בעולם, סרטן הראש והצוואר מתדרדר קשות בריאות של אדם3. למרות גישות רבות פותחו בשנים האחרונות, התוצאה הקלינית של הטיפול בחולים הסובלים הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) הוא עדיין לא אידיאלי4. חקר שיטות טיפוליות חדשות ניתן לשפר את הטיפול HNSCC5. תעלות יונים מעורבים תהליכים ביולוגיים רבים להציג תפקיד חשוב בהתפתחות של סוגי סרטן שונים6. השתתפות חלקית או מוחלטת של ערוצי Cl– מעורבים מאוד מאפיינים שונים של טרנספורמציה אמצעים כולל העברת פעיל, שיעור גבוה של התפשטות, invasiveness. לאור זאת, ולחץ כדי לירות, משפחה חלבון הרומן, רשומה כמחלקה המבטיחים של מטרות טיפוליות עבור סרטן טיפול6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו בני משפחת ולחץ כדי לירות, כולל CLIC1, CLIC4 CLIC5, בתרגום כדי הלב מיטוכונדריאלי, הרמה (ROS) מינים חמצן תגובתי upregulated מאת CLIC5, המציין את תפקיד פונקציונלי Cl מיטוכונדריאלי הממוקם - ערוצים אפופטוטיים להיפגע תגובה8. CLIC4, אחד מבני המשפחה ולחץ כדי לירות (הידוע גם בשם mtCLIC P64H1, RS43), נחקר באופן מקיף ביותר על תכונותיו תקנה מוות תאים סרטניים ובמיקום subcellular כולל גולג'י רשתית תוך-פלזמית, מיטוכונדריון-אנוש keratinocytes7,9,10. לפרופיל הביטוי של CLIC4 היה מוסדר על ידי גידול נקרוזה מקדם-α (TNF-α), P53, גירוי חיצוני. ביטוי ו downregulation של CLIC4 לעורר תגובה אפופטוטיים להיפגע בעיקר באמצעות מסלול מיטוכונדריאלי מלווה עם האיזון של בני משפחת Bcl-2, הפעלה של קספאז אשד ולאחר שחרורו של ציטוכרום C11, 12 , 13. לכן, מדידה MMP חיוני לחקור אפופטוזיס הקשורות CLIC4, ומשמש Rh123 כמחוון פלורסצנטיות אידיאלי.
המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט איתור MMP ללמוד CLIC4 נוקאאוט-induced אפופטוזיס בתאים HN4. Rh123 משמש כדי לבחון את השינוי של MMP בדיקה קרינה פלואורסצנטית. תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות לייזר קונפוקלי סריקה קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, התנודות בזמן אמת של MMP ייתכן נפתרה. לדון את היתרונות ואת המגבלות של היישום של לייזר קונפוקלי פלורסצנטיות מיקרוסקופ בפירוט סורק, ואנו גם להשוות אותו עם שיטות אחרות. פרוטוקול זה גם יכול להחיל על מחקרים אחרים הקשורים אפופטוזיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא תרבות, תרביות תאים
-
תרבית תאים
הערה: HN4, קו תא HNSCC, נגזר מחולים עם HNSCC14.- התרבות התאים HN4 של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM, גלוקוז 4.5 g/L) בתוספת 10% סרום שור עוברי ואנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 100 ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL). דגירה תאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
-
תאים תקנים
- יום אחד לפני תרביות תאים, צלחת 5 x 105 תאים 2 מ"ל/טוב של תרבות בינונית ללא אנטיביוטיקה על לוחות 6-. טוב.
- לדלל 100 siRNA pmol CLIC4 או מקושקשות SiRNA ב 250 µL אמצעי אחסון מופחת סרום, בעדינות. לדלל 5 ריאגנט ליפוזום µL ב 250 µL של התקשורת מופחת סרום תקופת דגירה של 5 דק לשלב siRNA מדולל עם הכימית ליפוזום מדולל, לערבב בעדינות ו תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף את התערובת לכל טוב המכיל תאים, בינוני. מערבבים בעדינות במוזיקת הלוח האחורי וושוב. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO במשך 24 שעות לפני שתמשיך עם ההליך הבא של תיוג Rh123. החלף את המדיום עם מדיום הגידול נורמלי 4 שעות לאחר תרביות תאים.
2. Rh123 תיוג
הערה: Rh123 היה מנוצל כדי למדוד את MMP תאים HN41.
- לאחר הטיפול siRNA CLIC4 (סעיף 1), השתמש בתאים HN4. ובכן 6 צלחות לטיפול הבא. כמות HN4 לתאים בכל טוב הוא מספיק כדי לחזור על הניסוי 10 פעמים על coverslips.
- השתמש פינצטה כדי לשים coverslips מעגלית על החלק התחתון של 12-ובכן את לוחיות הרישוי. מספר הצלחות נקבע לפי הנבחנים (איור 1א').
- שים 150 µL של polylysine µg/mL 100 על האמצע של כל coverslip בתוך הלוחות 12-ובכן והמתן 2 דק לשים לב לא לשים polylysine בחוץ coverslips. ואז להסיר את polylysine על ידי pipettor ביסודיות (איור 1B).
- להסיר את המדיום התרבות של תאים HN4 בתוך קערה ומוסיפים 1 מ"ל טריפסין 0.25% כדי לנתק את התאים. לאחר 6 דקות, להוסיף 2 מ"ל בינוני תרבות לנטרל את טריפסין. בעדינות לערבב התאים HN4 על ידי pipettor 5 פעמים, זרע 2-6 х 10 תאים4 על coverslips מעגלית. מניחים בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 (איור 1C).
- לאחר דגירה 8 שעות, דגירה התאים HN4 עם 2 µmol/L Rh123 למשך 40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. מערבבים בעדינות את בינוני שיהיה מספר פעמים כדי להבטיח אפילו חלוקת Rh123 בטווח הבינוני (איור 1D).
- להכין מספיק פתרון תמיסת מלח פיזיולוגית נורמלית (NPSS); כדי להפוך NPSS (mmol/L): 140 NaCl, pH אשלגן כלורי, 1 MgCl2, 1 CaCl2, גלוקוז 10 ו- 5 HEPES, 5 7.4). מחממים עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- השתמש פינצטה כדי להסיר את coverslips. ולשטוף את הנותרים נוזלי דרך הצבת בקצרה על coverslips למאגר NPBS preheated (איור 1E).
- מקם את coverslips בתחתית תא פלדת אל-חלד 500 µL (ראה טבלה של חומרים) עם תחתון coverslip להחלפה 25 מ מ זכוכית אטום במקום על ידי o-ring. לתקן את זה על ידי הידוק את המכסה של התא (איור 1E).
- הוסף 450 µL טרופה NPSS מאגר לתא שהורכב ולשים אמבטיה תחת השדה החזותי של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או סריקת קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 1E) לייזר קונפוקלי.
3. זיהוי של MMP
-
מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות
- הפעל את המיקרוסקופ פלורסצנטיות ההוראות של היצרן.
הערה: מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות הושגה עם מרקורי מנורה סיב אופטי מקור אור, FITC מסנן עבור Rh123 (480/40 עירור סינון, 505 LP ודיקרואיק זוהר מראה, מסנן פליטה 535/40) בטמפרטורת החדר. המטרה X 20 שימש לביצוע הדמיה לחיות תאים. - פתח את תוכנת מערכת ההדמיה, בחר בלחצן "חדש" בסרגל הפקודות כדי להתחיל ניסוי חדש (איור 2א).
- להתאים את שדה הראיה ואת המיקוד כדי לאתר את המיקום של התאים באור לבן.
- לכבות את האור, לחצו על הכפתור כדי לסגור את האור הלבן. לחץ על לחצן "פוקוס" בסרגל הפקודות ובחר "להתחיל תוך התמקדות" להידלק על ידי קרינה פלואורסצנטית. למצוא את המיקום של התאים שוב באמצעות מיקרוסקופ של עירור 507 ננומטר, 529 פליטה מסירה ארוכה ננומטר אורך הגל (ערכה לפני הניסוי). להתאים את שדה הראיה ואת המיקוד שוב אם יש צורך (איור 2B).
- בחר שדה visual המכיל תאים HN4 מופרדים רק 20 עד 30. השינוי של אותות תאיים פלורסצנטיות עבור כל תא יתועדו באופן מדויק.
- ברגע שדה ראייה ברורה מושגת, לחץ "מיקוד קרוב" מהבר המוקד. לחץ על "Acq אחד" מתוך שורת הפקודה כדי לרכוש ערכה אחת של תמונות. לחץ על "אזורים" בסרגל הפקודות, ולחץ על הלחצן "אישור" כדי לערוך מדידה אזורים.
הערה: מהבר לערוך אזור, אזור שונה צורות יכול לשמש בהתאם המחקר. - כדי להתאים עבור צורות שונות של תאים בודדים, בחרו בכלי "עקבות אזור" להקיף את האזור של תא בודד, לחץ פעמיים כאשר סיימת. חזור על התהליך עד כל התאים בעיגול (איור 2C). לחץ על "סיום" ולבחור "שמירת תמונות" כדי לאתר את המיקום שנשמרו.
- לחץ על "Zeroclock"ודחף במהירות F4 כדי להפעיל פיקוח על השינוי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. שיא בזמן אמת שינוי עוצמת קרינה פלואורסצנטית פעם כל 5 s עבור 5 דקות (איור 2D).
- הבסיס הופך יציב, להוסיף 50 µL NPSS מעורבב עם 0.5 µL של 100 mmol/L ATP לחדר הזה דרך pipettor. לזכור לא לגעת תא כדי למנוע הסרת משדה הראיה (איור 2E).
הערה: בתמונה זריחה יירשמו במשך 20 דקות, ואז לסיים הניסוי באמצעות ידני. משך זמן באופן שגרתי סגור במשך 20 דקות על מנת לצפות את כל שינוי זריחה. עם זאת, ידני כדי לעצור את לכידת מוחל כאשר גורמים לא צפויה להשפיע על היציבות של העקומה, או כאשר התהליך כולו לוקח פחות מ 20 דקות.
- הפעל את המיקרוסקופ פלורסצנטיות ההוראות של היצרן.
-
מיקרוסקופ פלורסצנטיות סריקת לייזר קונפוקלי
- להפעיל את לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ פלורסצנטיות ההוראות של היצרן סורק ופתח את תוכנות מצורפות.
הערה: כאן, Rh123 התרגש לייזר ארגון קבע-488 ננומטר, האות הנפלט הוקלט מעל טווח 545-700 nm באמצעות יישום של המסנן TD488/543/633. - לחץ על "אובייקטיבי" תחת תפריט "רכוש" כדי לבחור 63 X / 1.4 נ. א שמן המטרה העדשה. לצפות את הדגימה ולמצוא שדה חזותי ברור תחת השדה אור.
- לחצו על הכפתור "TL/IL" כדי לעבור למצב פלורסצנטיות ולבחור את מסנני קרינה פלואורסצנטית הנכון כדי לאתר את המיקום של התא תחת החושך באמצעות מיקרוסקופ. לדחוף "תריס" כדי להגן על הדגימה כאשר סיימנו עם התצפית.
- תחת תפריט "רכוש", להתאים את הערוץ PMT המתאימים ולחץ על "להשיג" כדי להפעיל את הנתיב אופטי שיוחסו (איור 3א). לחץ על תפריט "תצורת" ובחר "לייזר" כדי לקבוע את סוג לייזר הדרושים. "ארגון" מומלצת עבור פרוטוקול זה (איור 3ב).
- לחץ על "לחיות" לקבל בזמן אמת תמונה ולוודא חזותית שדה מכיל תאים HN4 מופרדים רק 20 עד 30. השינוי של אותות תאיים פלורסצנטיות עבור כל תא יתועדו באופן מדויק.
- בחר "xyt" במצב רכישת המשנה "רכישת" תחת תפריט "רכוש" (איור 3ג'). להגדיר 5 s ו- 20 דקות עבור מרווח הזמן ומשך, בהתאמה. לחץ על"החל" כאשר כל הפרמטרים הם התיישבו.
- תחת תפריט "Quantify", השתמש בכלי "לצייר ריבוי קווים" להקיף את האזור הקלטה של כל תא. בחר "פרופיל" ובחר "התחל" כדי לערוך תצפית. להקליט את השינוי בזמן אמת של עוצמת קרינה פלואורסצנטית במשך 5 דקות (איור 3D - E).
- הבסיס הופך יציב, להוסיף 50 µL NPSS מעורבב עם 0.5 µL של 100 mmol/L ATP לחדר הזה דרך pipettor. לזכור לא לגעת תא כדי למנוע הסרת משדה הראיה.
הערה: בתמונה זריחה יירשמו במשך 20 דקות, ואז השלמת הניסוי.
- להפעיל את לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ פלורסצנטיות ההוראות של היצרן סורק ופתח את תוכנות מצורפות.
4. ניתוח סטטיסטי
-
מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות
- הפעל את המיקרוסקופ פלורסצנטיות באופן שגרתי בעקבות ידני של המפעיל. פתח את תוכנת מערכת ההדמיה ובחר את הלחצן 'פתח' בסרגל הפקודות לפתוח ניסוי שנשמרו. לחץ על "אזורים" 'בסרגל הפקודות' ולחץ על הלחצן "אישור" כדי לערוך מדידה אזורים.
- בחרו בכלי "עקבות אזור" ואת להקיף את האזור של תא בודד לחיצה כפולה כאשר תסיים. חזור על התהליך עד יש כבר הקיף את כל התאים. לחץ על "סיום" ובחר "F4: קדימה" כפתור כדי להשיג מעקב מציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
- לאחר סיום, לחץ על לחצן החץ למטה, הממוקם בפינה הימנית התחתונה של הגרף ולחץ על "הצג גרף נתונים" (איור 2F). לחץ פעמיים על "אישור", בחר בלחצן "יומן נתונים" כדי לפתוח את הממשק של תוכנת עיבוד נתונים. לחץ שוב על "נתוני יומן רישום" ולמצוא שהרשומות של התנודות בזמן אמת של עוצמת קרינה פלואורסצנטית מופיעים בגיליון.
הערה: עבור כל תא, שינויים ב- MMP הוצגו כיחס בין קרינה פלואורסצנטית ביחס עוצמת לפני היישום של ATP או TG (F1/F0). כל נתוני עוצמת קרינה פלואורסצנטית היו הממוצע של 20-30 התאים. נתונים עבור Rh123 מוצגים כמו זאת אומרת ± SE. תוצאות של 2 קבוצות נבדקו על ידי מבחן דו-זנבי עצמאית t ערך P < 0.05 נחשב מובהקות סטטיסטית. תוכנת ניתוח סטטיסטי הוחל על התנהלות של ניתוחים סטטיסטיים בניסוי זה.
-
מיקרוסקופ פלורסצנטיות סריקת לייזר קונפוקלי
- הפעלת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ולהיכנס לתוך התוכנה מצורפות ההוראות של היצרן.
- בחר "אש" כדי לפתוח את ניסוי המוקלט.
- בחרו בכלי "מחסנית פרופיל" תחת תפריט "Quantify", "הכל באחד" לבחור "מיון בתרשימים על-ידי ערוצי ו ROIs."
- השתמש בכלי "צייר מצולע" לאזורים תא מעגל להשגחה.
- בחר בתפריט "גרף", לחץ על הלחצן הימני של העכבר, ובחרו 'לייצא ל- excel' כדי להוסיף את הערכים של פלורסנט בעוצמה לגיליון אלקטרוני. הניתוח הבא הוא עקבי עם קרינה פלואורסצנטית רגילה מיקרוסקופים (איור 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר הנוכחי, Rh123 הוחל כדי לזהות את MMP. בתחילה, תאים HN4 היו תרבותי עבור הבאים ידי קרינה פלואורסצנטית מכתים ניסויים. פינצטה שימשו לשים coverslips מעגלית על החלק התחתון של 6-ובכן צלחות (איור 1א'). Coverslips היו מצופים polylysine במשך 5 דקות, ואז polylysine הסיר באמצעות pipettor (איור 1B). לאחר מכן תאים HN4 היו trypsinized, נזרע על coverslips ממוקמים בחלק התחתון של לוחות 6-. טוב. בשלב הבא, הכמות המתאימה של Rh123 הוסיף ומעורבים טוב (איור 1C-D). אחרי כביסה עם NPSS preheated, coverslip הורכב לחדר הצפייה. הכמות המתאימה של NPSS נוסף עבור הניסוי הבא (איור 1E).
לאחר הניתוח של Rh123 מכתים, מיקרוסקופ פלורסצנטיות משותף והן מיקרוסקופ קונפוקלי שימשו כדי להקליט את זריחה Rh123 בזמן אמת עם שלבים שונים ותוכנות. בשביל המיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות, היה תוכנת הדמיה מופעל כדי ליצור התנסות חדשה. הצמצם נפתח כדי להראות את האור הירוק פלורסצנטיות, המיקוד ואת המיקום הותאמו כדי לקבל שדה visual המתאים. לאחר נטילת תמונת תא, כלי מעקב הצורה שימשו כדי לצייר את האזור של כל תא ותא, ואז להקליט את השינוי זריחה. לאחר התוכנית הבסיסית הפכה יציבה, ATP נוספה לתוך החדר כדי לעורר ממברנה מיטוכונדריאלי דפולריזציה. בהניסוי של סריקת קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי, תוכנות מצורפות נפתח, נתיב אופטי מתאים הוגדר. אחרי מקור האור ארגון נבחר, אנחנו להתאים את המוקד והמיקום של החדר כדי להשיג תמונה ברורה של התא צורות על המסך. מצב סריקה "xyt" נבחר, הכלי "צייר מצולע" הוחל להקיף את האזור התא כדי להקליט את השינוי פלורסצנטיות בתוך כל תא ותא. כדי לנתח את הנתונים הגולמיים, F0 היה הערך של עוצמת קרינה פלואורסצנטית לפני יישום ATP, F1 היה הערך המרבי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית אחרי יישום ATP. F1/F0 שימש כדי להעריך את דפולריזציה ממברנה מיטוכונדריאלי (איור 2 , איור 3). איור 4B , איור 5B, רמות עוצמת פלורסנט היו גבוהות בעקבות טיפול של ATP והגב ירד לקו הבסיס לאחר כ 10 דקות איור 4C , איור 5C בבירור להדגים כי הפסגה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Rh123 היה גבוה בקבוצה תחת הטיפול siRNA CLIC4 מזה בקבוצת הבקרה. איור 4 A ו- איור 5A הצג להחליפן בתמונות של השינוי פלורסנט בכל שלב ושלב. לעומת המיקרוסקופ הנפוץ פלורסצנטיות, מיקרוסקופ קונפוקלי לקבל איכות גבוהה יותר של התמונה, מציג גרעין התא, המיטוכונדריה. עם זאת, כאשר משווים את הנתונים של שתי השיטות, אין הבדלים משמעותיים נמצאו. תוצאות פלורסצנטיות, מיקרוסקופ קונפוקלי הפגינו את נוקאאוט של CLIC4 משופרת דפולריזציה ATP-induced ממברנה מיטוכונדריאלי בתאים HN4 (איור 4 , איור 5).
איור 1 . תיוג Rh123. מלקחיים (A) שימשו לשים coverslips מעגלית על החלק התחתון של לוחות 6-. טוב. (B) ציפוי coverslips עם polylysine ויה pipettor במשך 5 דקות וחזרה ולבסוף שאיבה לתוך pipettor כדי להסיר את polylysine. HN4 (ג) התאים היו נזרע על coverslips בתחתית לוחות 6-. טוב. (ד) הוספת כמות מתאימה של Rh123 ולערבב היטב. (E) לשטוף את coverslips עם רכיבי NPP טרופה והקמת התא עם כמות מתאימה של NPSS עבור הניסוי הבא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . צעדים כדי לפקח על התנודות בזמן אמת של זריחה Rh123 על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצות. (א) פתח התנסות חדשה. (B) תתעורר ובחר שדה חזותי מתאים תחת קרינה פלואורסצנטית. (ג) שימוש "אזורים" הכלי בסרגל הפקודות כדי לערוך תצפית אזורים. (ד) לחץ על "אפס שעון" ודחף במהירות F4 כדי להפעיל פיקוח על השינוי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. (E) הוספת ATP (100 µmol/L) כדי לעורר ממברנה מיטוכונדריאלי דפולריזציה לאחר התוכנית הבסיסית יהפוך יציבה. (F) לאחר סיום הניסוי, לחץ על החץ למטה ממוקם בפינה הימנית התחתונה של התרשים כדי לייצא נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . צעדים כדי לפקח על התנודות בזמן אמת של זריחה Rh123 על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי. (א) בחר הערוץ PMT, להגדיר טווח אורך גל המתאים תחת תפריט "רכוש". (B) בחר בסוג הלייזר הנכון של "לייזר זמין הנוכחי" ולהגדיר את כוחה. (ג) לבחור את "xyt" התבוננות מצב, להגדיר סדרה של הקלטה פרמטרים. (ד) לבחור את הכלים "מחסנית פרופיל" ו- "כל אחד" מתוך "מיון בתרשימים על-ידי ערוצי ו ROIs." (E) שימוש בכלי "ציור המצולע" מעגל האזור תא עבור הנתונים בזמן אמת. (F) לייצא את הערכים של פלורסנט בעוצמה לתוכנה עיבוד נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ההשפעה של נוקאאוט CLIC4 על קרום מיטוכונדריאלי ATP-induced דפולריזציה נפתרת על-ידי המיקרוסקופ הנפוץ פלורסצנטיות בתאים HN4. (א) להחליפן בתמונות של קרינה פלואורסצנטית התנודות Rh123. עקבות נציג (B), נתונים מסוכמים (C) מציג ATP (100 µmol/L)-induced שינויים בתא HN4 MMP. השינוי פוטנציאל ממברנה היה מציינים את היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית לפני ואחרי היישום של ATP. הגדלת יחס מייצג את דפולריזציה פוטנציאל הממברנה. התאים HN4 היו transfected עם CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) או מקושקשות siRNA (siRNA קון). הערכים מוצגים את n זאת אומרת ± ב- SEM = 5. P < 0.05 לעומת קבוצת הביקורת (siRNA קון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . ההשפעה של CLIC4 נוקאאוט ב- ATP-induced ממברנה מיטוכונדריאלי דפולריזציה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ בתאים HN4 סורק לייזר קונפוקלי. (א) להחליפן בתמונות של קרינה פלואורסצנטית התנודות Rh123. עקבות נציג (B), נתונים מסוכמים (C) מציג ATP (100 µmol/L)-induced שינויים בתא HN4 MMP. השינוי פוטנציאל ממברנה היה מציינים את היחס של צפיפות קרינה פלואורסצנטית לפני ואחרי היישום של ATP. הגדלת יחס מייצג את דפולריזציה פוטנציאל הממברנה. התאים HN4 היו transfected עם CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) או מקושקשות siRNA (siRNA קון). הערכים מוצגים את n זאת אומרת ± ב- SEM = 5. P < 0.05 לעומת קבוצת הביקורת (siRNA קון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה מתועד היטב כי Cl− ערוצים הם חיוני בשמירה על hemostasis של הסביבה הפנימית ולא לשחק תפקידים חשובים התפשטות תאים, אפופטוזיס15,16. לכן, הבנת הקשר בין התערבות ממוקדות ערוץ יון אפופטוזיס הוא של צורך גדול ואת המשמעות כדי למצוא גישה טיפולית כדאי עבור סוגי סרטן שונים17. המיטוכונדריה לשמור על המדינה ביולוגית רגילה של תא, תפקידה מאוד מתייחס חדירות הממברנה ופוטנציאל transmembrane שלה. מלבד סרטן, צבירת חקירות neuropathological תיעדו כי ליקויים מיטוכונדריאלי לתרום מיופתיה, מחלות לב וכלי דם, כולל חירשות sensorineural, אטקסיה אסטרוציטומה, דמנציה תסמינים נוירולוגים , אפילפסיה18,19. כל אלה דרבנה את המחקר בהתערבות מיטוכונדריאלי במיקוד שבה המשלבת טיפול רפואי. Rh123, צבע, ממוקדות מיטוכונדריון פלורסצנטיות, יכולים לחדור את קרום התא, ומשמשת כ בדיקה קרינה פלואורסצנטית אוניברסלי לגילוי MMP. ב מדינת תא אפופטוזיס מוקדם, פתיחת MPTP מעלה את חדירות קרום מיטוכונדריאלי ומאפשר Rh123 להשתחרר החוצה המיטוכונדריה, סוף סוף האות החזק פלורסצנטיות ירוק עשוי להתגלות. תחת מצב זה, יונים דו צדדיים להפיץ באופן חופשי, להוביל ירידה מהירה של MMP גורם סופגת של רשת התחבורה אלקטרון וירידה ייצור ATP, המשפיע באופן חמור את אספקת אנרגיה של תאים. בנוסף, פתיחת MPTP מפעיל זרימה יוצאת של תרכובות ביו פרו-אפופטוטיים להיפגע כולל Cyt C, אפופטוזיס גרימת פקטור, מוות פרוטאז הפעלת פקטור-1, ו- ROS והפניות סוף סוף אפופטוזיס בלתי הפיך20,21 .
ATP עלול לגרום ממברנה מיטוכונדריאלי דפולריזציה כפי שמתואר על-ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברות של Rh123. על ידי השוואת ATP-induced ממברנה מיטוכונדריאלי דפולריזציה של התאים תחת טיפולים שונים, זה אפשרי לפענח הפונקציה הביולוגי של שינוי המיטוכונדריה ואת מצב של אפופטוזיס22מעלות. מיקרוסקופ פלורסצנטיות משותף והן סריקת קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ניתן להשיג ניטור בזמן אמת של MMP דרך להקליט את התנודות של קרינה פלואורסצנטית בעוצמה של Rh123, אבל היתרונות ואת החסרונות של שתי השיטות צריך להיות נחשב. התמונות שנתפסו על ידי סריקת קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי לעומת המיקרוסקופ הנפוץ פלורסצנטיות, יש רזולוציה ואיכות גבוהה יותר. לכן, ניתן לאבחן עוד פרטים subcellular. בנוסף, זה מצמצם ההשפעות של האור צולבות לדבר כאשר משתמשים מרובים צבעי זריחה. לפיכך, מיקרוסקופ קונפוקלי ניתן בדיוק להקליט את התנודות פלורסצנטיות בזמן אמת של Rh123, לשקף את אתריים סלולרי אמיתי. עם זאת, השיטות שלנו לפקח MMP צריכה הקלטה ברציפות במשך זמן רב יחסית, סדרה של cytotoxins, כולל חמצן יחידה ROS, עלולה להיווצר תחת קרינת לייזר המוביל אל התא נזק23. יתר על כן, עוצמת הלייזר גבוהה גורמת בדרך כלל דהייה של צבעי זריחה במהלך סריקה רציפה24. לעומת זאת, המיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוצה לא יכול לקחת תמונות באיכות גבוהה כמו מיקרוסקופ קונפוקלי, אך זה לא קיים את ההשפעות השליליות הנ ל, ובכך מאפשר זמן הקלטה. על ידי השוואת הנתונים שלנו מיקרוסקופ פלורסצנטיות משותף והן מיקרוסקופ קונפוקלי, אין הבדל ברור יכול להימצא, אשר מציין כי המיקרוסקופ פלורסצנטיות נפוץ הוא מספיק מוכשר לניטור התנודות של MMP, כמו גם ניתוח נתונים חסכונית ונוחה יותר. HN4 התאים היו נזרע על coverslips לפני הניסוי. למרות polylysine מוחל כדי לשפר את הקובץ המצורף הסלולר, חלק קטן של תאים עדיין מנותקת coverslips ותפעול קשה מוביל ירידת ערך של תא הכדאיות. חוץ מזה, הוספת Rh123 או ATP לתוך החדר, להקפיד לא לגעת את החדר ואת coverslips.
חוץ Rh123, DioC6, JC-1, tetramethyl-rhodamine-מתיל-אסטר (TMRM) הם צבעי זריחה העשויות לשמש כדי לזהות את MMP. במקום הקלטה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ, cytometry זרימה גם ניתן לבצע משימה זו. אולם, הקלטה השינוי בזמן אמת של עוצמת קרינה פלואורסצנטית עם המיקרוסקופ הוא מתאים יותר לגלות את bioactivity הסלולר ולהפיק תמונות intuitionistic, נותן תוצאות אמינות יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
נבקשך תודה מר צ'או פאנג תרבית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן מדעי הטבע של סין (מענק מס 81570403, 81371284); אנחווי מדעי הטבע מחוזי קרן (מענק מס 1408085MH158); החוקר צעירים מצטיינים של האוניברסיטה לרפואה אנחווי; התומכת בתוכנית כשרונות צעירים מעולה באוניברסיטאות של פרובינצית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
