Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for anvendelse av rhodamine 123 å identifisere mitokondrie membranen potensielle (MMP) og studere CLIC4 knockdown-indusert HN4 celle apoptose i vitro. Under felles fluorescens mikroskop og AC confocal laser skanning fluorescens mikroskop, ble real-time endringen av MMP registrert.
Abstract
Utarming av mitokondrie membranen potensielle (MMP, ΔΨm) regnes tidligste hendelsen i apoptotisk kaskade. Det skjer selv før kjernefysiske apoptotisk egenskaper, inkludert chromatin kondens og DNA brekkasje. Når MMP kollapser, celle apoptose starte irreversibelt. En rekke lipofile kationisk fargestoffer kan passere gjennom cellemembranen samlet i matrisen mitokondrie og tjene som fluorescens markør å vurdere MMP endring. Som en av seks medlemmene av Cl- intracellulær kanal (CLIC) familie deltar CLIC4 i celle apoptotisk prosessen hovedsakelig gjennom mitokondrie sti. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å måle MMP via overvåking fluorescens svingninger i Rhodamine 123 (Rh123), hvor vi studere apoptose indusert av CLIC4 knockdown. Vi diskuterer fordeler og begrensninger av AC confocal laserskanning og normal fluorescens mikroskopet i detalj, og også sammenligne den med andre metoder.
Introduction
Rh123 er et kationisk fluorescens fargestoff, som fungerer som en indikator for transmembrane potensial. Rh123 er dugelig av gjennomtrengende cellemembranen og angi mitokondrie matrix avhengig av potensielle forskjellen på innsiden og utsiden av membran1. Apoptose fører til skade mitokondrie membran integritet. Mitokondrie permeabiliteten overgangen pore (MPTP) åpnes og føre til kollaps av MMP, som igjen fører til utgivelsen av Rh123 på utsiden av mitokondrier. Til slutt, grønne fluorescens sterke vil bli oppdaget under fluorescens mikroskop. Det er godt dokumentert at uttømming av MMP og forhøyet membran permeabilitet er tidlige tegn på celle apoptose2. Rh123 kan derfor brukes til gjenkjenning av MMP endring og forekomsten av celle apoptose.
Som de 6 vanligste carcinoma i verden forverres hode og nakke kreft alvorlig en persons helse3. Selv om mange tilnærminger ble utviklet i de senere årene, er kliniske utfallet av behandling for pasienter som lider av hode og nakke squamous celle carcinoma (HNSCC) fremdeles ikke ideelt4. Utforske nye terapeutiske metoder kan forbedre behandling for HNSCC5. Ionekanaler som involverer mange biologiske prosesser viser en viktig rolle i utviklingen av ulike kreftformer6. Delvis eller totalt deltakelse av Cl- -kanaler er sterkt involvert i ulike egenskaper for neoplastic transformasjon inkludert aktive migrasjon, høy grad av spredning og invasiveness. I lys av dette, har CLIC, en roman protein familie, vært listet som en lovende klasse av terapeutiske mål for kreft behandling6,7. Nyere undersøkelser avdekket som familiemedlemmer CLIC inkludert CLIC1, CLIC4 og CLIC5, lokalisere til hjerte mitokondrie og reaktive oksygen arter (ROS) er upregulated av CLIC5, som angir funksjonell rolle mitokondrie ligger Cl - kanaler i apoptotisk svar8. CLIC4, en familiemedlemmer CLIC (også kjent som mtCLIC, P64H1 og RS43), har blitt mest grundig undersøkt for egenskapene apoptotisk regulering kreftceller og subcellular plassering inkludert Golgi, endoplasmatiske retikulum og mitokondrie i menneskelig keratinocytter7,9,10. Profilen for expression av CLIC4 var regulert av tumor nekrose faktor-α (TNF-α), P53 og ekstern stimulans. Overuttrykte og downregulation av CLIC4 utløse en apoptotisk respons hovedsakelig gjennom mitokondrie veien sammen med ubalansen av Bcl-2 familiemedlemmer, aktivering av caspase gjennomgripende og utgivelsen av cytochrome C11, 12 , 13. derfor MMP måling er avgjørende å utforske CLIC4-relaterte apoptose, og Rh123 fungerer som en ideell fluorescens indikator.
Studien beskriver en detaljert protokoll for påvisning av MMP å studere CLIC4 knockdown-indusert apoptose i HN4 celler. Rh123 brukes som en fluorescens sonde for å observere endringen av MMP. Under felles fluorescens mikroskop og AC confocal laser skanning fluorescens mikroskop, kan sanntid svingninger i MMP være løst. Vi diskuterer fordeler og begrensninger av AC confocal laserskanning fluorescens mikroskopet i detalj, og også sammenligne den med andre metoder. Denne protokollen kan også brukes til andre apoptose-relaterte studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kultur og hva
-
Cellekultur
Merk: HN4, en HNSCC celle linje, ble avledet fra pasienter med HNSCC14.- Kultur HN4 celler i Dulbeccos endret Eagle medium (DMEM, 4,5 finans glukose) med 10% fosterets bovin serum og antibiotika (100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin). Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2.
-
Cellen transfection
- En dag før transfection, plate 5 x 105 celler i 2 mL/vel av kultur medium uten antibiotika i 6-og plater.
- Fortynne 100 pmol CLIC4 siRNA eller kryptert SiRNA i 250 µL av redusert serum media, forsiktig. Fortynne 5 µL liposome reagensen i 250 µL av redusert serum media ruge for 5 min. kombinere utvannet siRNA med fortynnet liposome reagensen, bland forsiktig og ruge for 20 min ved romtemperatur.
- Legg til blandingen i hver også inneholder celler og medium. Bland forsiktig av rocking platen frem og tilbake. Inkuber cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator for 24 timer før du fortsetter med Rh123 merking fremgangsmåten. Erstatt medium med normal vekst medium 4T etter hva.
2. Rh123 merking
Merk: Rh123 ble benyttet for å måle MMP i HN4 celler1.
- Etter CLIC4 siRNA behandling (del 1), bruk HN4 celler i 6-vel plater for følgende behandling. Mengden av HN4 celler i hver er godt nok til å gjenta eksperimentet 10 ganger på coverslips.
- Bruke pinsett for å sette sirkulære coverslips på bunnen av nye 12-vel plater. Antall plater er settes eksperimentell design (figur 1A).
- Sette 150 µL av 100 µg/mL polylysine på midten av hver dekkglassvæske i 12-vel platene og vente 2 min. ta hensyn til ikke sette polylysine utenfor coverslips. Fjern polylysine ved å hindre grundig (figur 1B).
- Fjern kultur medium HN4 cellene i retten og tilsett 1 mL 0,25% trypsin å koble cellene. Etter 6 min, Legg 2 mL kultur medium å nøytralisere trypsin. Bland forsiktig HN4 cellene ved å hindre for 5 ganger og frø 2-6 х 104 celler i den sirkulære coverslips. Plasser i en inkubator på 37 ° C med 5% CO2 (figur 1C).
- Etter 8 h inkubasjon ruge HN4 cellene med 2 µmol/L Rh123 for 40 min på 37 ° C. Bland forsiktig middels opp flere ganger å sikre jevn fordeling av Rh123 i medium (figur 1D).
- Forberede nok normal fysiologisk saltløsning (NPSS); lage NPSS (i mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 glukose og 5 HEPES, pH 7.4). Forvarm til 37 ° C i et vannbad.
- Bruke pinsett for å fjerne coverslips og vask gjenværende flytende via kort å plassere coverslips i forvarmet Landsbyer bufferen (figur 1E).
- Plasser coverslips på bunnen av 500 µL rustfritt stål kammeret (se Tabell for materiale) med utskiftbare 25 mm glass dekkglassvæske bunn forseglet på plass av en o-ring. Fikse det ved å stramme lokket av kammeret (figur 1E).
- Legge til 450 µL forvarmet NPSS buffer til sammensatte chamber og setter bad under for fluorescens mikroskop eller AC confocal laserskanning fluorescens mikroskopet (figur 1E).
3. påvisning av MMP
-
Vanlige fluorescens mikroskopet
- Slå på mikroskopet fluorescens følge instruksjonene fra produsenten.
Merk: Vanlige fluorescens mikroskop ble oppnådd med kvikksølv lampe fiberoptiske lyskilde, en FITC filtersettet for Rh123 (480/40 eksitasjon filter, 505 LP dichroic speil og 535/40 utslipp filter) ved romtemperatur. 20 X mål ble brukt til å utføre live-celle bildebehandling. - Åpne tenkelig systemprogramvaren og velg knappen "Ny" fra kommandolinjen til å begynne et nytt eksperiment (figur 2A).
- Justere visuelle feltet og fokus å finne plasseringen av cellene i hvitt lys.
- Slå av lyset og trykk på knappen for å lukke hvitt lys. Klikk knappen "Fokus" fra kommandolinjen og velg "Start Focusing" slå på fluorescensen. Finne plasseringen av cellene atter via mikroskop med en 507 nm eksitasjon og 529 nm lang pass utslipp bølgelengde (sett før eksperimentet). Justere visuelle feltet og fokus igjen hvis nødvendig (figur 2B).
- Velg et visual felt som inneholder bare 20 til 30 atskilt HN4 celler. Endring av intracellulær fluorescens signal for hver celle registreres nøyaktig.
- Når en klar synsfelt er oppnådd, kan du klikke "Tett fokusering" fra baren fokus. Klikk "Acq en" fra kommandolinjen å kjøpe et sett med bilder. Klikk "Områder" fra kommandolinjen, og klikk "OK" for å redigere måling områder.
Merk: Fra Rediger regionen bar, annerledes område figurer kan bli brukt avhengig av studiet. - Passer for ulike former for individuelle celler, velg "Trace Region" sirkel regionen i én enkelt celle og dobbeltklikk når ferdig. Gjenta prosedyren til alle celler er sirklet (figur 2C). Klikk "Ferdig" og velg "Save Images" å finne lagringsplassen.
- Klikk "Zeroclock"og raskt trykk F4 for å starte overvåking av fluorescens intensitet. Posten i sanntid endre fluorescens intensitet én gang hver 5 s i 5 min (figur 2D).
- Når planlagte blir stabil, legge 50 µL NPSS blandet med 0,5 µL av 100 mmol/L ATP til kammeret via hindre. Husk å ikke berøre kammeret for å unngå fjerne det visuelle feltet (figur 2E).
Merk: Fluorescens bildet vil bli registrert for 20 min og deretter eksperimentet kan ende via manuell drift. Hele tiden er rutinemessig avgjort for 20 min for å observere hele fluorescens endring. Manuell operasjon for å stoppe fange brukes imidlertid når uventede faktorer påvirker stabiliteten av kurven eller når hele prosessen tar mindre enn 20 min.
- Slå på mikroskopet fluorescens følge instruksjonene fra produsenten.
-
AC confocal laser skanning fluorescens mikroskopet
- Slå på AC confocal laser skanning fluorescens mikroskop følger produsentens instruksjoner, og åpne det samlet programvaren.
Merk: Her Rh123 ble opphisset av en Argon laser satt til 488 nm og slippes ut signalet ble spilt inn over omfanget av 545-700 nm via program TD488/543/633 filter. - Klikk "Målet" under menyen "Hent" velge 63 X / 1.4 N.A. olje linsen. Observere prøven og finne en klar visuelle feltet under feltet lys.
- Trykk på "TL/IL"-knappen for å skifte til fluorescens modus og velge riktig fluorescens filtrene til å finne plasseringen av cellen under mørket via mikroskop. Trykk "Nedleggelse" beskytte prøven når observasjon er ferdig.
- Under menyen "Hent" justere egnet avdrag kanal og klikk "Oppnå" for å aktivere den utlignede optiske banen (Figur 3A). Klikk på "Configuration"-menyen og velg "Laser" for å bestemme nødvendige laser. "Argon" anbefales for denne protokollen (Figur 3B).
- Klikk "Live" for å få sanntid og kontroller det visuelle feltet inneholder bare 20 til 30 atskilt HN4 celler. Endring av intracellulær fluorescens signal for hver celle registreres nøyaktig.
- Velg "xyt" inne vinningen måte i undermenyen "Erverv" under menyen "Hent" (Figur 3C). Angi 5 s og 20 min til tid og varighet, henholdsvis. Klikk"Apply" når alle parametere er avgjort.
- Bruk verktøyet "Tegne polystrek" sirkel innspillingen området hver celle under "Kvantifisere"-menyen. Velg "Linje profil" og velg "Start" for å gjennomføre observasjon. Registrere real-time endringen av fluorescens intensiteten i 5 min (Figur 3D - E).
- Når planlagte blir stabil, legge 50 µL NPSS blandet med 0,5 µL av 100 mmol/L ATP til kammeret via hindre. Husk å ikke berøre kammeret for å unngå fjerne det visuelle feltet.
Merk: Fluorescens bildet vil bli registrert for 20 min og deretter eksperimentet er fullført.
- Slå på AC confocal laser skanning fluorescens mikroskop følger produsentens instruksjoner, og åpne det samlet programvaren.
4. statistisk analyse
-
Vanlige fluorescens mikroskopet
- Slå på mikroskopet fluorescens rutinemessig følge bruksanvisningen. Åpne tenkelig systemprogramvaren og velg "Åpne" knappen fra kommandolinjen til å åpne en lagret eksperiment. Klikk "Områder" fra "Kommandolinjen" og klikk "OK"-knappen for å redigere måling områder.
- Velg "Trace region" og sirkelen regionen i én enkelt celle og dobbeltklikk når gjort. Gjenta prosedyren til alle celler har blitt sirklet. Klikk "Ferdig" og velg det "F4: frem"-knappen for å få et spor viser fluorescens intensitet.
- Når ferdig, klikk pil ned-knappen på nederst til høyre i diagrammet, og klikk "Vis grafdata" (figur 2F). Klikk "OK" to ganger og velg "loggdata"-knappen for å åpne grensesnittet av databehandlingen programvare. Klikk "loggdata" igjen og Finn postene i sanntid svingninger av fluorescens vises i regnearket.
Merk: For hver celle endringer i MMP ble vist som forholdet mellom fluorescens i forhold til intensiteten før anvendelsen av ATP eller TG (F1/F0). Hver fluorescens intensitet data var gjennomsnittlig 20-30 celler. Dataene for Rh123 presentert som gjennomsnittlig ± SE. resultater fra 2 grupper ble testet av tosidige uavhengig t testen og P verdien < 0,05 ble ansett som statistisk betydning. Statistisk analyse software ble brukt til å utføre statistiske analyser i dette eksperimentet.
-
AC confocal laser skanning fluorescens mikroskopet
- Slå på mikroskopet AC confocal laser og logge inn det samlet programvaren følger produsentens instruksjoner.
- Velg "Fire" for å åpne en innspilt eksperiment.
- Velg verktøyet "Stable profil" under "Kvantifisere"-menyen, velg "alt i ett" fra "Sorter diagrammer av kanaler og ROIs."
- Bruk "Draw polygonverktøyet" sirkel celle områder for observasjon.
- Velg "Graph" Klikk høyre museknapp og velger "Eksporter til excel" legge verdiene av fluorescerende intensiteten til et regneark. Følgende analyse er konsistent med normal fluorescens mikroskop (Figur 3F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studien, ble Rh123 brukt for å oppdage MMP. Først ble HN4 celler kultivert til følgende fluorescens flekker eksperimenter. Pinsett ble brukt til å sette sirkulære coverslips på bunnen av 6-vel plater (figur 1A). Coverslips ble belagt med polylysine i 5 minutter og deretter polylysine fjernet via hindre (figur 1B). Deretter var HN4 celler trypsinized og sådd på coverslips plassert i bunnen av 6-og plater. Deretter riktig mengde Rh123 ble lagt til og blandet godt (figur 1C-D). Etter vask med forvarmet NPSS, var dekkglassvæske samlet i visning kammeret. Riktig mengde NPSS lagt til følgende eksperimentet (figur 1E).
Etter prosedyren for Rh123 flekker, ble både vanlige fluorescens mikroskop og AC confocal mikroskop brukt til å registrere i sanntid Rh123 fluorescens med forskjellige trinnene og programvare. For vanlige fluorescens mikroskopet, ble bildebehandlingsprogramvare slått på å opprette et nytt eksperiment. Lukkeren ble åpnet for å vise grønne fluorescens lys og fokus og stedet ble justert for å få en passende synsfelt. Etter å ha tatt en celle bilde, ble spor formverktøyene brukt til å trekke regionen i hver enkelt celle og deretter registrere fluorescens endringen. Når den opprinnelige planen ble stabil, ble ATP lagt inn i kammeret utløse mitokondrie membran depolarization. I eksperimentet AC confocal laserskanning fluorescens mikroskop, det samlet programvaren ble åpnet og en passende optisk bane ble angitt. Når lyskilden argon ble valgt, justert vi fokus og plasseringen av kammeret å oppnå en klar visuell av cellen figurene på skjermen. Skannemodus "xyt" ble valgt og "Draw polygonverktøyet" ble brukt til å sirkel regionen celle for å registrere fluorescens endringen i hver enkelt celle. Analysere rådata, F0 var fluorescens intensitet før ATP programmet F1 var maksimumsverdien for fluorescens intensiteten etter ATP søknad. F1/F0 ble brukt til å vurdere mitokondrie membran depolarization (figur 2 og Figur 3). Fra Figur 4B og figur 5B, ble nivåer av fluorescerende intensitet promotert etter behandling av ATP og redusert tilbake til opprinnelige etter ca 10 min. Figur 4C og figur 5C tydelig vise at toppen av fluorescens intensiteten av Rh123 var høyere i gruppen under CLIC4 siRNA behandling enn i kontrollgruppen. Figur 4 A og figur 5et Vis representant bilder av fluorescerende endringen i hvert trinn. Sammenlignet med vanlige fluorescens mikroskopet, oppnådd AC confocal mikroskopet en høyere kvalitet på bildet, som viser cellekjernen og mitokondrier. Men når du sammenligner data fra de to metodene, ble ingen signifikante forskjeller funnet. Resultater fra fluorescens og AC confocal mikroskop vist at knockdown av CLIC4 forbedret ATP-indusert mitokondrie membran depolarization i HN4 celler (Figur 4 og figur 5).
Figur 1 . Rh123 merking. (A) pinsett ble brukt til å sette sirkulære coverslips på bunnen av 6-og plater. (B) belegg coverslips med polylysine via hindre for 5 min og til slutt sugekraft tilbake i å hindre fjerne polylysine. (C) HN4 celler var frø på coverslips på bunnen av 6-og plater. (D) legge en passende mengde Rh123 og blande det godt. (E) vask coverslips med forvarmet NPPS og montering kammer med en passende mengde NPSS for følgende eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Trinnene for å overvåke sanntid svingninger i Rh123 fluorescens ved vanlige fluorescens mikroskop. (A) åpne et nytt eksperiment. (B) begynner å fokusere og velge en egnet visuelle feltet under fluorescens. (C) bruke "Regionene" verktøyet fra kommandolinjen redigere observasjon regioner. (D) klikker "Null klokke" og Trykk raskt F4 for å starte overvåking av fluorescens intensitet. (E) å legge ATP (100 µmol/L) utløse mitokondrie membran depolarization etter planlagte blir stabil. (F) når forsøket er ferdig, klikker du nedpilen på nedre høyre hjørne i diagrammet til å eksportere data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Trinnene for å overvåke sanntid svingninger i Rh123 fluorescens ved AC confocal laserskanning fluorescens mikroskopet. (A) Velg avdrag kanalen og sett en egnet bølgelengdeområde "Hent"-menyen. (B) Velg riktig laser fra "Gjeldende tilgjengelig laser" og sette sin makt. (C) Velg "xyt" observere modus og angi en rekke opptak parametere. (D) Velg verktøyene "Stack profil" og "All in One" "Sorter diagrammer av kanaler og ROIs." (E) Bruk verktøyet "tegne polygonen" sirkelen regionen cellen for sanntids data. (F) eksportere verdiene for fluorescerende intensitet til databehandlingen programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Effekten av CLIC4 knockdown på ATP-indusert mitokondrie membran depolarization løses ved vanlige fluorescens mikroskopet i HN4 celler. (A) representant bilder fluorescens svingninger Rh123. representant spor (B) og summerte data (C) viser ATP (100 µmol/L)-induserte endringer i HN4 cellen MMP. Endringen i membranen potensielle ble angitt med forholdet mellom fluorescens intensiteten før og etter bruk av ATP. Økningen på forholdet representerer membran potensielle depolarization. HN4 cellene var transfekterte med CLIC4siRNA (CLIC4 siRNA) eller kryptert siRNA (Con siRNA). Verdiene vises som gjennomsnittlig ± SEM. n = 5. P < 0,05 vs kontrollgruppen (Con siRNA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Effekten av CLIC4 knockdown på ATP-indusert mitokondrie membran depolarization løst ved bruk av AC confocal laser fluorescens mikroskopet i HN4 celler. (A) representant bilder fluorescens svingninger Rh123. representant spor (B) og summerte data (C) viser ATP (100 µmol/L)-induserte endringer i HN4 cellen MMP. Endringen i membranen potensielle ble angitt med forholdet mellom fluorescens tetthet før og etter bruk av ATP. Økningen på forholdet representerer membran potensielle depolarization. HN4 cellene var transfekterte med CLIC4 siRNA (CLIC4 siRNA) eller eggerøre siRNA (Con siRNA). Verdiene vises som gjennomsnittlig ± SEM. n = 5. P < 0,05 vs kontrollgruppen (Con siRNA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er godt dokumentert at Cl− kanaler er avgjørende i å opprettholde hemostasen av interne miljøet og spille viktige roller i celle spredning og apoptose15,16. Derfor forstå forholdet mellom ion kanal-målrettet intervensjon og apoptose er stort behov og betydning for å finne en bedre terapeutisk tilnærming for ulike kreftformer17. Mitokondrier opprettholde normale biologiske staten i en celle, og dens funksjon gjelder svært sin membran permeabilitet og transmembrane potensial. Bortsett fra kreft, har samler neuropathological undersøkelser dokumentert at mitokondrie unormalt bidra til muskeldystrofi, hjerte-og karsykdommer og nevrologiske symptomer inkludert sensorineural døvhet, lillehjernen ataksi, demens , og epilepsi18,19. Alle disse har ansporet forskning i mitokondrie målrettet intervensjon med å forbedre klinisk behandling. Rh123, en mitokondrie målrettede fluorescens fargestoff, kan trenge celle membran, og fungerer som en universell fluorescens sonde å oppdage MMP. I tidlig delstaten celle apoptose, åpningen av MPTP løfter mitokondrie membran permeabilitet tillater Rh123 å bli befridd utenfor mitokondrier og endelig grønne fluorescens sterke kan oppdages. Under denne situasjonen bilaterale ioner distribuere fritt og føre til raske dråpe MMP forårsaker frikopling av elektronet transportkjeden og redusert ATP produksjonen, som alvorlig påvirker normal energiforsyning celler. I tillegg utløser åpningen av MPTP utstrømming av pro-apoptotisk bioaktive forbindelser inkludert Cyt C, apoptose inducing faktor, apoptotisk protease aktivering faktor-1, og ROS, og til slutt fører til irreversible apoptose20,21 .
ATP kan indusere mitokondrie membran depolarization som demonstrert av opphøyet fluorescens av Rh123. Ved å sammenligne ATP-indusert mitokondrie membran depolarization celler under forskjellige behandlinger, er det mulig å dechiffrere den biologiske funksjonen til endringen i mitokondrier og grad og delstaten apoptose22. Både vanlige fluorescens mikroskop og AC confocal laserskanning fluorescens mikroskop kan oppnå real-time overvåkning av MMP via opptak svingninger i fluorescens intensiteten av Rh123, men fordeler og mangler av begge metodene må være vurdert. Sammenlignet med vanlige fluorescens mikroskopet, har bildene tatt av AC confocal laserskanning fluorescens mikroskopet høyere oppløsning og kvalitet. Derfor kan subcellular mer visualiseres. I tillegg reduserer det virkningene av lys kryss-snakk når flere fluorescens fargestoffer brukes. Derfor kan AC confocal mikroskopet nettopp registrere sanntid fluorescens svingninger i Rh123 og gjenspeiler den virkelige mobilnettet bioactivity. Imidlertid våre metoder å overvåke MMP må kontinuerlig opptak for relativt lang tid og en rekke cytotoxins, inkludert enkelt oksygen og ROS, kan produseres under laserstråling fører til celle skade23. Videre fører høy laser intensitet vanligvis falming av fluorescens fargestoffer under kontinuerlig skanning24. Derimot vanlige fluorescens mikroskopet kan ikke ta bilder med høy kvalitet som AC confocal mikroskopet, men det har ikke nevnte bivirkninger og dermed muliggjør lenge innspillingen. Ved å sammenligne våre data fra både vanlige fluorescens mikroskop og AC confocal mikroskop, ingen åpenbare forskjellen fant, som angir at vanlige fluorescens mikroskopet er kompetent nok for overvåking svingninger i MMP, samt kostnadseffektiv og mer praktisk dataanalyse. HN4 celler var frø på coverslips før eksperimentet. Selv om polylysine brukes til å forbedre cellulære vedlegget, fører en liten brøkdel av celler fortsatt løsrevet fra coverslips og grov operasjonen til svekkelse av cellen levedyktighet. Dessuten bør legge til Rh123 eller ATP i kammeret, omsorg tas ikke berøre kammer og coverslips.
Foruten Rh123, DioC6, JC-1 og tetramethyl rhodamine metyl ester (TMRM) er fluorescens fargestoffer som kan brukes til å oppdage MMP. I stedet for real-time opptak via mikroskop, kan flowcytometri også utføre denne oppgaven. Men er opptak real-time endringen fluorescens intensitetsnivåer med mikroskopet mer egnet til å oppdage den cellulære bioactivity og generere intuitionistic bilder, gi mer pålitelige resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Mr. Chao Fang for cellekultur. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation av Kina (Grant nr. 81570403, 81371284); Anhui provinsielle Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Fremragende unge Investigator Anhui medisinske universitet; Støtter programmet for utmerket unge talenter i universitetene i provinsen Anhui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HNSCC cells | ATCC | CRL-3241 | |
| Polylysine | Thermo Fisher Scientific | P4981 | |
| Specific siRNA for human CLIC4 | Biomics | NM_013943 | (accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Rhodamine 123, FluoroPure grede | Thermo Fisher Scientific | R22420 | |
| Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Gibco | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin | Gibco | 10099141 | |
| Trypsin-EDTA Solution | Beyotime | C0201 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240062 | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Leica Microsystems GmbH | LEICA.SP5-DMI6000-DIC | |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope | Nikon | N/A | |
| Metaflour, V7.5.0.0 | Universal Imaging Corporation | N/A | |
| Leica application suite, v2.6.0.7266 | Leica Microsystems GmbH | N/A | |
| Microsoft office Excel 2007 | Microsoft | N/A | |
| Sigma Plot 12.5 | Systat Software | N/A | |
| Attofluor Cell Chamber | Thermo Fisher Scientific | A7816 |
References
- Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
- Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
- Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).
- Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
- Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
- Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
- Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
- Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
- Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
- Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
- Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378 (2012).
- Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
- Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227 (2013).
- Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
- Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584 (2015).
- Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
- Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
- McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
- Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
- Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
- Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
- Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
- Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).
